文摘
人类肌原性的祖细胞可以从多能干细胞已经被用于建模的自然和病理肌细胞生成,以及治疗肌肉疾病。Transgene-free推导肌原性的祖细胞的方法从不同的PSC线经常产生混合种群中异构肌原性的分化潜能,但详细和准确的描述人类PSC-derived肌原性的祖细胞仍然是难以捉摸的。隔离和净化人类PSC-derived肌原性的祖细胞因此是一个重要的方法论考虑当我们调查这些细胞在文化的属性和行为。我们之前报道transgene-free,血清浮动球体培养法的人类已经被肌原性的祖细胞的来源。在这项研究中,我们首先进行全面的细胞表面蛋白分析领域文化的细胞通过255抗体的筛查。接下来,我们使用磁激活细胞分选和丰富了细胞根据特定的表面标记物的表达。肌肉产生的细胞分化的能力以immunofluorescent积极染色细胞的标记和量化。我们的研究结果显示,myotube-forming CD29细胞居住在不同的文化+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -分数,而厚,多核肌管是从CD9差异化的文化中所确定的+和CD146+分数。我们发现PAX7本地化细胞核与myotube-forming能力在这些分类人群。我们还表明,细胞无序,CD271+,CD15- - - - - -分数回应不同的低温贮藏和长时间的文化扩张。最后,我们表明,CD271表达对终端分化至关重要的人类PSC-derived肌原性的祖细胞。综上所述,这些细胞表面蛋白质不仅是有用的标记来识别独特的细胞数量在人类PSC-derived肌原性的祖细胞还功能重要的分子,可以提供有价值的洞察人类肌细胞生成。
1。介绍
骨骼肌肌原性的祖细胞,也称为祖/干细胞可以分化成骨骼细胞,形成收缩肌肉单位所需的肌肉修复和再生。各种来源被用来传播肌原性的祖细胞在文化、包括胎儿肌肉,成人肌肉,和nonmuscle体细胞组织(1- - - - - -5]。然而,有限的肌肉biopsy-derived成人肌原性的祖细胞是可扩展的通道数和迅速接受衰老文化。这些问题被解决,干细胞技术的进步。具体来说,人类多能干细胞(已经),包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能),是一个几乎无限期有效和具有成本效益的新的细胞来源肌原性的祖准备(6- - - - - -8]。人类PSC-derived肌原性的祖细胞可以提供宝贵的见解自然和病理机制的肌细胞生成在体外建模和在活的有机体内实验。例如,在体外药物筛选使用人类PSC-derived肌原性的祖细胞允许我们识别新的机制和分子有能力防止肌肉萎缩,萎缩在正常衰老或疾病过程。在过去的十年中,从不同的实验室提出了几种方法从人类已经被有效的推导肌原性的祖细胞。特别是,我们发表的一系列研究证明的可行性产生肌原性的祖细胞直接从人类已经没有基因改造利用无血清和feeder-free浮球文化(EZ球体)6,9,10]。
特定的细胞表面蛋白可用于隔离,识别,描述可行的人类肌原性的祖细胞(11]。随着人类PSC衍生品通常在细胞类型显示不同的异质性,浓缩利用细胞表面标记是一个重要的步骤在当前程序改善肌原性的祖人口的纯度。虽然标记的啮齿动物卫星细胞都进行了广泛的研究,人类肌原性的祖标记数据只特定转录因子(如PAX3 PAX7 Myf5, MyoD)和细胞表面标记(CD29和CD56)已被广泛接受为可靠的早期人类卫星细胞标记(11]。其中,活细胞隔离的转录因子是不相容的,因为他们的核本地化。因为CD29表达式也观察到一些nonmuscle细胞内肌肉组织(12),CD29单是无效的人体肌原性的祖细胞鉴定和从未被用作唯一的标记隔离肌原性的祖细胞从人类已经被准备好11]。CD56可以用作唯一的标记隔离来自成人肌肉肌原性的祖细胞(13- - - - - -16),但其特异性和效率作为孤立的唯一标记PSC-derived肌原性的祖细胞仍然未知的(11]。它也被报道,细胞缺乏CD56表达式可以表现出肌原性的祖属性(17,18]。此外,推导方法的变化和PSC线路不同生产混合细胞群。到目前为止,没有共识共同唯一的标记或多个标记的黄金标准组合净化人类PSC-derived肌原性的祖细胞在不同的设置。例如,肌原性的祖标记CD271和ErbB3的结合产生了矛盾的结果当用于分离人类PSC-derived肌原性的祖细胞通过不同的协议(准备19,20.]。
更好地描述和丰富人类PSC-derived肌原性的祖细胞,我们进行了全面的分析利用EZ球细胞细胞表面标记的筛选与255年抗体。根据选定的标记的表达,我们然后使用磁激活细胞分选排序EZ球细胞(mac)。相比fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪),mac电脑处理结果在大约10倍细胞生存能力21人口增长和更高的postsort [22]。一个示例中,mac电脑处理4 - 6倍流式细胞仪;对多个样本,mac可以并行执行,流式细胞仪需要按顺序进行。此外,mac电脑的所有排序程序可以完成在一个生物安全柜,这很容易可用于广泛的研究人员没有一个昂贵的细胞分选仪。排序细胞分化来评估他们的肌原性的潜在使用采用免疫分析。我们发现细胞myotube-forming效率提高居住在CD29的分化细胞+分数,CD56+分数,CD271+分数,CD15- - - - - -分数,而分化CD9的文化+分数和CD146+分数显示改善肌管融合。Pax7细胞内分布的详细分析显示高发生Pax7定位在细胞核中CD9的未分化的文化+分数,CD29+分数,CD56+分数,CD271+分数,CD15- - - - - -分数,暗示核Pax7表达式之间的正相关和myotube-forming能力。此外,CD271的未分化细胞+分数和CD15- - - - - -分数表现出改善无序的人群相比,膨胀率和留存myotube-forming终端分化的效率在感应。最后,我们观察到抑制CD271表情肌原性的分化造成了障碍。我们的研究结果暗示,这些细胞表面蛋白可能是功能重要的分子,可以推出关于人类肌肉的重要信息生物学和疾病。
2。材料和方法
2.1。人类多能干细胞
人类ESC线WA09 (H9)和人类iPSC线imr - 90来自WiCell (WI麦迪逊,美国)。这些线是维护使用feeder-free协议(23]。iPSC殖民地培养在mTeSR1 (WiCell)介质6-well板涂层与基底膜基质(BD生物科学;CA)和通过使用Versene圣何塞(美国纽约生活技术,大岛屿)。
2.2。分化的细胞则肌原性的祖细胞和肌管
人类iPSC-derived肌原性的祖细胞和肌管准备使用[描述最近我们的协议6]。短暂,iPSC殖民地手动取消使用刮刀和转移到扩张Stemline介质组成的介质(s - 3194, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100 ng / ml人类成纤维细胞生长因子2 (FGF-2;WiCell), 100 ng / ml人类表皮生长因子(EGF);美国微孔,Billerica的),5 ng / ml硫酸肝素(Sigma-Aldrich)和青霉素、链霉素、两性霉素B (PSA, ;生命技术)。消极的控制,iPSC殖民地被转移到没有FGF-2扩张中。培养瓶的殖民地保持预镀与聚(甲基丙烯酸2-hydroxyethyl酯)(poly-HEMA;Sigma-Aldrich)以防止细胞表面附件。1周后,殖民地形成自由浮动的球形骨料EZ球体。球被机械切段每周使用McIlwain组织直升机(很多实验室工程、萨里、英国)。机械切允许维护细胞间接触球文化的快速和稳定的扩张没有分离单个细胞悬液(24- - - - - -26]。组织直升机被喷洒消毒70%异丙醇,在生物安全柜。一套flame-sterilized刀片是在组织的直升机。球被放在培养皿盖子和机械碎到200年μ多维数据集。
6周后,EZ球体分离使用胰蛋白酶(TrypLE,生活技术),磨碎在终端分化培养基(杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Sigma-Aldrich)含2% B27血清补充(PSA)生命技术)和1%,细胞通过过滤器与40μ米网孔隙大小(352340年,康宁公司,康宁,纽约,美国),和4000个细胞密度/镀μl玻璃盖玻片上涂有poly-L-lysine(0.1毫克/毫升)和层粘连蛋白(50μg / ml) (Sigma-Aldrich) (6]。镀细胞被保持在24-well板为2周在终端分化培养基中分化成肌管。
2.3。表面标记筛选
筛选了与BD Lyoplate™人类细胞表面标记筛选面板(BD生物科学),其中包含242纯化单克隆抗体对人体细胞表面标记和相应的二次抗体。此外,以下主要抗体细胞表面标记也被添加到筛选:CD331, CD332, CD333, CD334(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。这四个表面标记的纤维母细胞生长因子受体(FGFR)家庭对卫星细胞表达和参与肌细胞生成,也称为FGFR1, FGFR2, FGFR3,和FGFR4分别27,28]。iPSC殖民地转入扩张中如上所述。EZ球体是维护自由浮动球文化和通道通过机械切每周5周,然后分离和磨碎的终端分化培养基,细胞通过过滤器和40μ米网孔大小如上所述。 细胞每口井在96孔镀玻璃圆底板涂有poly-L-lysine(0.1毫克/毫升)和层粘连蛋白(50μg / ml) (Sigma-Aldrich)。镀细胞保存在终端分化中过夜。接下来,细胞被孵化与初级抗体(25μg / ml)在冰上30分钟和磷酸盐(PBS)洗孵化后二次抗体(1.25μg / ml)在冰上30分钟。PBS洗,细胞被固定在冰冷的甲醇20分钟,然后孵化与赫斯特33258 (0.5μ在PBS g / ml;Sigma-Aldrich) 10分钟。图片被收购一个尼康Eclipse TE2000-E DS-QilMC CCD相机(尼康、东京、日本)和蔡司510元激光扫描共焦显微镜(蔡司,耶拿,德国)。
2.4。磁激活细胞分选(mac)
iPSC-derived EZ球体培养在扩张中至少6周和用于细胞分选使用Miltenyi研究(Bergisch格拉德巴赫、德国)基于列的排序工具。EZ球体分离,磨碎,经过细胞过滤器如上所述。一些细胞孵化磁bead-conjugated抗体(1:5在mac缓冲溶液稀释,使用100年μl每107总细胞)在4°C 15分钟。磁bead-conjugated抗体使用CD15-MicroBeads和CD56-MicroBeads (Miltenyi研究)。其他细胞孵化fluorochrome-conjugated感兴趣的表面标记抗体(1:10在mac缓冲溶液稀释,使用100年μl每107总细胞)在4°C 15分钟,用mac电脑缓冲区(mac 5% BSA股票autoMACS清洗解决方案™解决方案;Miltenyi研究),和孵化MicroBead-conjugated抗体相应的荧光染料(10μl 90年抗体μ每10 l mac缓冲溶液7总细胞)在4°C 10分钟。Fluorochrome-conjugated抗体是CD9-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) CD26-FITC, CD49b-FITC, CD49f-FITC, CD98-FITC, CD146-FITC, CD164-FITC (BD生物科学),CD13-FITC, CD24-FITC, CD29-FITC, CD82-FITC, CD184-allophycocyanin (APC), CD271-phycoerythrin (PE), ErbB3-FITC (Miltenyi研究),和ITGN -α7-FITC (Biorbyt,剑桥,英国)。这些抗体选择根据上述筛选和数据1和2。Microbead-conjugated抗体是anti-FITC微,anti-APC微,和anti-PE微(Miltenyi研究)。这些表面标记抗体的细节补充表中是可用的S1。
(一)
(b)
(c)
(d)
标记细胞然后通过磁列设置在mac手动分隔符进行排序,按照制造商的描述(Miltenyi研究)。他们的女士和LD列用于积极和消极的选择,分别。有序的细胞被镀在盖玻片和维护终端分化中了两个星期,然后用甲醇固定和分析。对于每一个实验,一组平行准备的细胞不经过mac是用作控制,称为“无序细胞。”
2.5。免疫细胞化学
细胞处理PAX7和肌凝蛋白重链(MyHC)免疫细胞化学(如前所述29日]。镀PAX7染色,细胞在盖玻片和4%多聚甲醛固定在PBS (PFA);镀MyHC染色,细胞在盖玻片固定与冰冷的甲醇。固定细胞permeabilized Triton x - 100 0.1%和5%正常驴血清(NDS) PBS。与PBS冲洗后,这些细胞被孵化与主PAX7抗体(1:40;杂种细胞发育研究银行,DSHB,爱荷华州的城市,IA)或MyHC (MF20, 1: 20;DSHB)。孵化后主要的抗体,细胞被冲洗PBS和孵化与二次抗体共轭Alexa萤石488或Cy3 (1: 1000;杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA)。最后,细胞核染色了赫斯特33258如上所述。 Coverslips were mounted on slides using a mounting medium (Fluoromount-G; SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA).
表面标记免疫细胞化学,活细胞被镀在盖玻片,然后孵化FITC-conjugated CD9的抗体,CD15, CD26, CD29, CD49b, CD49f、CD56、CD98, CD146, CD164, CD271 (BD生物科学),CD184 (BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),CD13, CD24, CD82, ERBB3 (Miltenyi研究),和ITGN -α7 (Biorbyt)或非结合的主要抗体CD55,表皮生长因子受体(BD生物科学),CD34表达载体,CD331, CD332, CD333,和CD334(细胞信号技术),与稀释1:40一个小时在室温下。主要抗体可用列表补充表S1。当使用非结合的主要抗体,染色细胞冲洗PBS和孵化与二次抗体共轭Alexa萤石与稀释488 1:1000年在黑暗中在室温下30分钟。细胞孵化FITC-conjugated主要抗体跳过第二抗体孵化,然后下一步。与PBS冲洗后,细胞被固定和染色与赫斯特33258如上所述。盖玻片被安装在幻灯片使用安装介质(Fluoromount-G;SouthernBiotech)。
2.6。显微镜和图像量化
采用图像获得使用Eclipse 80我荧光显微镜,尼康相机DS-QiIMC电荷耦合器件(尼康)。细胞计数与NIS-Elements进行成像软件(尼康)或ImageJ。PAX7表达式计算的平均百分比(% PAX7 PAX7-positive细胞+)/总细胞由Hoechst-positive细胞核。MyHC的数量+细胞被确定为Hoechst-positive细胞核的平均百分比MyHC包围+肌管(% MyHC+为每个字段的视图)。肌管宽度测量并显示在所有肌管的平均宽度/图像领域。来验证我们的研究结果的可靠性,我们重复2 - 3独立实验细胞计数。对于每一个染色,我们准备好的技术副本(2盖玻片),至少3随机选择的字段/盖玻片拍摄使用×20目的。% PAX7的值+和% MyHC+确定至少6微观领域/实验。
2.7。球增长测量和计算
EZ球体从万能准备然后分离排序如上所述。细胞CD271+分数和CD15- - - - - -分数被转移到中长期改革领域扩张。平行准备组的细胞不经过mac是用作控制,被称为“未分类的细胞。6周后通道的机械切,球被转移到细胞冷冻剂(C6295 Sigma-Aldrich)和存储在液态氮2年了。低温贮藏领域被解冻并转移到扩张中。球后通过一周一次和维护为6周,每组8球的井被转移到low-attachment 96孔板在0天。每个包含一个类似球体大小(~ 20μ米直径)在扩张中。6 0天,第三天,天,天9,球体的直径测量的目镜十字线尼康Eclipse TS 100倒置显微镜和用于计算球体体积。增长率的计算是通过规范每个球体的体积相对于初始体积的变化在0天。来验证我们的研究结果的可靠性,我们重复3个独立的实验。
2.8。CD271基因击倒使用小核RNA)
改进的文化扩张率和肌管形成能力postsort CD271+细胞导致的潜在参与我们的特定利益CD271表情肌细胞生成。要回答这种可能性,我们检查是否沉默CD271表达在人类PSC-derived肌原性的祖细胞对肌原性的分化会造成任何影响。PSC-derived EZ球体分离,在终端分化中磨碎,经过细胞过滤器如上所述。CD271小核RNA) # 1和# 2或炒(5μM;j - 009340 - 07 - 009340 - 10和d - 001810 - 10;Dharmacon,拉斐特有限公司、美国)转染 细胞在100年μl人类干细胞Nucleofector™解决方案使用Amaxa Nucleofector™2 b设备(Lonza、巴塞尔、瑞士)计划u - 013。转染细胞被镀上盖玻片和终端分化培养基中培养2周。细胞被固定ice-chilled甲醇和immunolabeled MyHC。平行准备组的细胞被用来检查核效率由西方墨点法在转染后6小时。来验证我们的研究结果的可靠性,我们进行了2独立实验使用EZ球体源自iPSC imr - 90和ESC线WA-09 (H9)。
2.9。免疫印迹
转染细胞的细胞溶解radioimmunoprecipitation分析缓冲区(里帕缓冲区;EMD微孔,伯灵顿,美国马)蛋白酶抑制剂鸡尾酒(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和5毫米乙二胺四乙酸(EDTA;热费希尔科学)。蛋白质浓度测定使用直流分析工具包(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。蛋白质(20μ每车道g)在聚丙烯酰胺凝胶上运行并转移到PVDF膜(EMD微孔)。膜是用了反CD271抗体免疫印迹(345102年,1:100;BioLegend)其次是二次抗体结合辣根过氧化物酶(anti-mouse免疫球蛋白合;Promega,麦迪逊,美国WI)。增强化学发光底物(美国马皮尔斯生物技术、沃尔瑟姆)在免疫印迹检测合用于化学发光成像使用UVP ChemStudio +成像系统(德国耶拿分析仪器公司美国、高地、钙、美国)。
2.10。统计分析
GraphPad棱镜9.1.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)被用来执行统计分析。定量数据是画 (SEM)至少两个独立的实验。未配对的双尾学生的 - - - - - -执行测试来比较两组。单向方差分析进行比较多个组。统计上显著的单向方差分析和适当的事后跟进测试:费舍尔最显著差异(LSD)测试来比较每一组无序,积极和消极的分数数据3和4;Bonferroni调整成对比较图5;和Dunnett的测试数据比较治疗组和对照组6和7。差异被认为是重要的时候 。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
2.11。流式细胞术分析
EZ球体分离,经过40μ过滤器,resuspended最终浓度的104细胞每在96孔板,孵化与抗体(1:100)流式细胞仪缓冲区(PBS(-)包含1% BSA和0.1%叠氮化钠)对冰在黑暗中,20分钟,洗两次流式细胞仪缓冲区。以下使用抗体:BV421反CD15, PerCP / Cy5.5反CD184 (BioLegend) APC反CD29;PE反CD56、FITC反CD146分子和Alexa萤石647反CD271 (BD生物科学)。染色细胞进行了分析使用BD LSRFortessa™(BD生物科学)。流式细胞仪数据分析使用FlowJo分析软件版本9.9.6 (BD生物科学)。
3所示。结果
3.1。表面标记分析人类PSC-Derived肌原性的祖细胞通过抗体筛选
人类肌原性的祖细胞是来源于人类iPSC imr - 90和人类ESC线WA09 (H9)使用范围的文化协议。传统方法使用10 - ng / ml FGF-2开车培养细胞的增殖30.,31日),但FGF浓度要求维持多能性细胞可能会有所不同从一个细胞系到另一个根据培养条件,从低至4 ng / ml (32- - - - - -35)高达100 ng / ml (36- - - - - -39]。我们之前发现高浓度(100 ng / ml) FGF-2显著增加人类的数量PSC-derived肌原性的祖细胞在EZ领域,而几乎没有产生的文化条件没有FGF-2肌原性的祖细胞(6]。在这项研究中,我们比较两种制剂之间的表面标记物的表达EZ球体源自每一行,培养6周的扩张中有或没有100 ng / ml FGF-2。EZ球体被分离成单个细胞, 细胞每口井被镀在96 -玻璃圆底板块和终端分化的培养基培养过夜。接下来,我们使用了BD Lyoplate™人类细胞表面标记筛选面板镀和染色的细胞FGF-2-treated EZ球体与255年不同表面标记抗体。我们将确定表面标记,特别表现在人类PSC-derived肌原性的祖细胞(图1)。FGF-2-treated细胞阳性抗体和89 - 166年其他抗体(图2(一个)和补充图S1),在积极的CD29、CD56显然是积极的细胞FGF-2-treated EZ球体(图2 (b))。这对应于前面的报告显示,这两个标记是积极的在各种类型的肌原性的祖细胞(2,11- - - - - -17,19,40,41]。因此,我们可以利用这两个标记阳性染色为疣状分析作为参考。相比之下,与抗体免疫细胞化学结果CD6 CD83和负染法(图的例子2 (b))。CD6 T淋巴细胞上发现的是一个1型跨膜糖蛋白,与ligand-activated白血球细胞粘附分子(ALCAM)激活T细胞增殖(42,43),而CD83是免疫球蛋白超家族成员,主要报道作为成熟的树突细胞的标记(44,45]。
我们接下来相比表面标记细胞来源于FGF-2-treated和参与之间的配置文件(例如EZ球体,没有FGF-2补充)。在89年FGF-2-treated抗体染色阳性细胞,33表面标记显示明显的不同表达水平相比,参与细胞(补充图S1B)。而10显示,FGF-2-treated细胞高表达,在参与细胞(图23显示更高的表达式2(一个)和补充图S1C)。例如,CD271 FGF-2价格高的表达细胞治疗,而CD15表达高non-FGF-2-treated控制细胞(图2 (c))。CD271是一个低亲和力受体生成已知细胞存活的关键功能(46],分化[47),和迁移48的神经细胞。接下来,我们进一步缩小了感兴趣的标记,确认他们的表情肌原性的祖细胞来源于多个批次的人类iPSC (imr - 90)和ESC (WA9 / H9)线。我们的选择标准之一是,30 - 70%的肌原性的祖文化应该污点积极跨所有批次测试。如果阳性细胞的比例高于或低于30 - 70%范围,我们认为随后的细胞分类不会做出重大变化的组成细胞群。例如,CD9满足这一标准,而CD61染色阳性的不到30%的细胞群和CD49a染色阳性的细胞群不超过70%。考虑的重现性和可靠性单元排序,我们选择标记,可以检测到高强度和明显的形态学和免疫细胞化学染色。CD15染色模式,满足我们的标准,是一个合适的候选人。相反,CD95没有履行我们的标准(图2 (d))。基于我们最初的选择,一系列的标记(CD9、CD13 CD26, CD29, CD49b, CD49f、CD56、CD98, CD146, CD164, CD184,和CD271)被确定,下一步用于进一步的调查。
3.2。使用识别标记隔离的人类iPSC-Derived肌原性的祖细胞
确认选中标记的特异性,我们丰富的肌原性的祖细胞从人类iPSC-derived EZ球体mac电脑,然后评估潜在的孤立的细胞在体外肌管分化。EZ球体从万能准备与FGF-2扩张中补充。球体分离后,单身悬浮细胞被mac使用选定的表面标记进行排序。排序细胞被镀在盖玻片和维护终端分化中(与2% B27补充DMEM) 14天诱导肌管的形成。的效率iPSC-derived肌原性的祖细胞经常跨批次不同,我们使用至少三个独立准备的EZ球体来测试每一个标记的多功能性。疣状MyHC表明积极(CD9、CD29、CD56、CD146和CD271)和消极(CD15)标记可用于肌原性的祖浓缩(数字3(一个)和3 (b))。相反,CD184没有足够的隔离工作肌原性的祖细胞的肌管的形成由于没有实质性区别积极和消极细胞分数后终端分化(数字3 (c)和3 (d))。类似地,其他标记,如CD13、CD24, CD26, CD49b, CD49f, CD98, CD164,也没有丰富的肌原性的祖细胞(补充图S2)。此外,我们测试了表面标记最近被报道在以前的出版物,但不列入我们的筛选面板,如整合素α7 (2,49],ErbB3 [19,50],CD82 [40,51]。然而,mac使用这些标记不能充实一个特定的人口从我们的EZ球体(补充图肌原性的祖细胞S2)。
3.2.1之上。改善肌管形成CD29的效率+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -分数
当比较的postsorting分数iPSC-derived FGF-2-treated细胞,MyHC的数量+肌管从CD29分化显著的高于文化+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -分数(图3 (d))。CD29、CD56广泛建立肌原性的标记(11),评估这些标记的有效性很重要,丰富iPSC-derived肌原性的祖细胞准备与我们sphere-based文化协议。免疫细胞化学显示, 和 细胞被MyHC+在终末分化文化源自于CD29+分数和CD29- - - - - -分数,分别为( )。同时,从CD56分化细胞+分数和CD56- - - - - -分数有 和 MyHC+细胞,分别为( )。CD271差异化的文化+分数有更多MyHC+细胞( )CD271相比- - - - - -分数( , )。与此同时,CD15+分数和CD15- - - - - -分数由 和 MyHC+终端分化后细胞,分别为( )。
确定CD29文化+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -分数显示myotube-forming能力高于各自无序细胞群(控制),我们归一化数据为每个单独的实验与各自的控制和计算平均(图3 (e))。当比较无序的细胞群,只有CD56+和CD271+分数显示肌管形成显著增加( )。这些结果表明,使用CD56 CD271可以丰富肌原性的祖细胞分类的数量由iPSC-derived EZ球体。另一方面,尽管MyHC的比率+CD29细胞显著更高+分数CD29相比- - - - - -CD29分数,分化潜能的细胞+分数和无序的人群没有明显不同。同样,尽管几乎只在CD15肌原性的祖细胞被发现- - - - - -分数和CD15几乎没有+CD15分数,分化潜能的细胞- - - - - -分数没有明显不同于细胞无序的人群。因此,我们使用的排序技术,CD29, CD15没有足够为肌原性的祖浓缩工作。
此外,我们想确定多少CD marker-positive细胞最初分布在人类PSC-derived EZ球体的无序的准备(补充图S3)。对于这一分析,我们使用iPSC-derived和ESC-derived FGF-2-treated EZ球体和比较特定的表面标记流式细胞仪的表达模式。我们发现iPSC-derived和ESC-derived FGF-2-treated EZ球细胞有类似的表达CD29和CD56的模式。相比之下,尽管几乎所有iPSC-derived FGF-2-treated EZ球细胞染色阳性CD271 CD15强度高和消极,ESC-derived细胞显示不同的表达模式的CD271 CD15:细胞染色阳性CD271发现了两种不同的强度,而大部分细胞染色阳性CD15(补充图S3)。
3.2.2。增加肌管融合在CD9和肌管宽度+和CD146+分数
如上所述,肌管形成效率(% MyHC+细胞)的积极的和消极的分数之间没有明显不同的EZ球细胞后细胞排序基于CD9和CD146的表达。我们继续分析细胞形态分化肌管。有趣的是,我们发现来自CD9的肌管+和CD146+分数是厚,含有更多的核肌管与无序相比,CD9- - - - - -,CD146- - - - - -分数(图4(一))。
在分化CD9的文化+分数,MyHC+肌管的平均宽度 。这些肌小管明显厚相比,无序的肌管分数( ; )和CD9- - - - - -分数( ; )(图4 (b))。接下来我们分析了融合指数分化肌管,每个肌管的细胞核数量特征。MyHC的比例+肌管包含≥3核明显更大的差异化CD9的文化+分数( )和CD9- - - - - -分数( ; )(图4 (c))。未CD9和差异化的文化- - - - - -分数几乎没有产生厚融合肌管与≥6核( 和 ,分别),而 总MyHC+肌管的分化CD9的文化+分数≥6核(图4 (d))。
与此同时,分化CD146的文化+分数产生了MyHC+肌管平均宽度 ,明显比MyHC厚+肌管形成差异化的文化无序分数( ; )和CD146- - - - - -分数( ; )(图4 (e))。虽然CD9+或CD146+肌管形成的细胞类似的宽度,CD146的肌管来自+细胞分数更高度融合,因此包含核/肌管比分化CD9的文化+分数。大约一半( )MyHC总数的+肌管的分化CD146的文化+分数≥3核,包含超过无序的差异化文化分数( ; )和CD146- - - - - -分数( ; )统计学意义(图4 (f))。差异更明显当比较MyHC总数的比例+包含≥6核肌管,这是 , ,和 CD146无序的不同文化+,CD146- - - - - -分别为分数(图4 (g))。
3.2.3。增加核PAX7 CD9的本地化+、CD29+、CD56+CD146+,CD271+,CD15- - - - - -分数
接下来,我们确定一个早期的表达肌原性的祖标记PAX7肌管形成的能力反映在每个排序分数。PAX7分析中,我们使用两个人准备iPSC-derived EZ球体。EZ球体分离,单个悬浮细胞按mac基于6的表达选择表面标记(CD9、CD29、CD56、CD146、CD271和CD15)。排序细胞培养在24-well板允许细胞依附到盖玻片,然后固定和immunolabeled PAX7。我们详细分析PAX7免疫染色显示,细胞内的细胞表现出两种截然不同的排序模式PAX7地理分布:局部细胞核(黄色箭头在图所示5(一个))或胞质地区广泛分散(白色箭头在图5(一个))。有一个不断增加的总趋势Pax7 CD9分数的表达式+、CD29+、CD56+CD146+,CD271+,CD15- - - - - -含有较高比例的总PAX7+细胞各自的同行相比,虽然差异没有达到统计学意义(图5 (b))。
当我们进一步分析亚细胞定位PAX7-positive细胞,我们发现PAX7表达水平明显高于局部细胞核与所有的分数中肌原性的祖细胞丰富,而细胞在其对应的分数包含更多的细胞质PAX7表达式(图5 (c))。具体来说,核PAX7表达式被确认在PAX7大约55 - 70%+CD9的细胞+、CD29+、CD56+CD146+,CD271+,CD15- - - - - -分数,但只有在PAX7 29 - 35%+CD9的细胞- - - - - -、CD29- - - - - -、CD56- - - - - -CD146- - - - - -,CD271- - - - - -,CD15+分数。当无视细胞与胞质PAX7表达式,只有比较核PAX7的整体比例+细胞,我们注意到CD29的未分化的文化+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -核PAX7分数包含更高的比率+比他们的同行CD29细胞- - - - - -、CD56- - - - - -,CD271- - - - - -,或者CD15+分数(图5 (d))。当我们regraphed MyHC的百分比+细胞分化的文化这12个排序分数从先前的实验部分2。1(图5 (e)),这些结果也有类似的整体模式相比,核PAX7的百分比+排序的这12个细胞未分化的文化分数。然而,核PAX7排序分数的差异的文化表达不完全预测myotube-forming分化能力的文化分数排序,排序的核PAX7表达水平差异的文化分数不忠实的镜子MyHC表达水平排序分数的差异文化。
3.2.4。低温贮藏的影响和文化扩张从CD271 Postsort细胞+和CD15- - - - - -分数
我们经验丰富的低温贮藏和长期的文化往往影响人类的扩散PSC-derived肌原性的祖细胞在EZ领域。因此,我们决定是否耗尽CD271- - - - - -或CD15+细胞从我们的文化会影响他们的弹性长时间低温贮藏和频繁的扩张。扩大iPSC-derived EZ球体后16周的段落,我们分离领域和排序的细胞通过基于CD271 mac或CD15表达。细胞从CD271+分数和CD15- - - - - -分数被转移回扩张中长期改革领域的文化。我们将这些组织的细胞称为“CD271+球”和“CD15- - - - - -球”,而一组平行准备的细胞不经过排序将被称为“未分类的领域。”这三个群体的范围扩大到6周的段落,冻存,然后通过另一个每周6通道解冻和扩展。在这一点上,这些球体通过30倍。分离、培养个人类似大小的球体在96孔板。垂直的直径的球体以天0,3、6和9计算体积(图6(一))。增加球体大小显示增殖率高于细胞死亡率。每组无差别的球体的增长率是画(图6 (b))[52]。从第0天到6天,CD271的增长率+球体与无序的球体。在9天,CD271的增长率+球超过未分类的领域( 和 他们最初的大小,分别; )。出乎意料,CD15- - - - - -球相对生长速率在一天6与其他两组相比,和一天的平均大小9只 初始大小,这是一个戏剧性的差异相比,未分类的领域( )。
接下来我们检查这三个群体的领域是否会在myotube-forming能力分化不同。细胞从这些领域被镀在盖玻片和终末分化为两个星期。差异化的文化CD271+球体和CD15- - - - - -myotube-forming细胞球体显示类似的比率相比,未分类的领域( , ,和 ,)(图6 (c))。CD271形态,差异化的文化+领域出现的健康长,对齐肌管和几乎任何组合设备的细胞。未分类的领域和CD15差异化的文化- - - - - -球也包含健康肌管,虽然明显比CD271短和更少的对齐+球体。聚集团聚体的细胞出现无序球体和CD15差异化的文化- - - - - -球体;后者形成细胞明显更大的集群(图6 (d))。
3.2.5。CD271表达的重要性在终端分化的人类PSC-Derived肌原性的祖细胞
调查是否CD271表情肌原性的分化扮演着关键的角色,我们沉默CD271人类PSC-derived使用RNA干扰肌原性的祖细胞。EZ球体源自人类iPSC (imr - 90)和ESC (WA9 / H9)线路分离成单个悬浮细胞和转染与两种不同序列的小干扰rna(# 1和# 2)CD271或炒。在转染后6小时,细胞细胞溶解和分析CD271蛋白水平。免疫印迹结果显示成功击倒CD271小干扰rna # 1和# 2的水平,而炒作为负控制(图7(一))。平行制备细胞被镀在盖玻片在转染后24小时内,在终端分化培养基培养了两个星期。MyHC免疫染色显示,肌管的形成是显著降低分化细胞中CD271信使rna被撞倒相比,细胞转染炒核(图7 (b))。值得注意的是,肌管形成的细胞治疗siRNA # 1显示明显的形态缺陷(图7 (c))。减少和损伤后肌管形成的CD271击倒可能意味着重要的角色为骨骼肌发育和分化CD271表达式。
4所示。讨论
严格的细胞分化过程的操作和隔离所需的细胞类型是人类PSC的成功使用衍生品的基础在体外建模或细胞疗法。不仅人类biopsy-derived和PSC-derived肌原性的祖细胞没有表现出完全等价的性质,但也观察到显著的表型差异即使在人类PSC-derived肌原性的祖细胞通过不同的方法。排序的细胞也可能经历的变化表面标记概要文件在文化扩张和分化。这也许可以解释有限的成功和缺乏共识的浓缩人类PSC-derived肌原性的祖细胞。尽管如此,最近的进步使人类肌原性的祖细胞基于表面的隔离标志的表达式,分析了细胞身份和肌原性的潜力。
我们以前报道,肌原性的祖人口来自人类已经使用我们transgene-free,无血清PAX7协议不都同质表达肌原性的因素,MyoD和Myogenin6,9]。在这项研究中,我们描述了不同的细胞类型在人类PSC-derived EZ球细胞群。我们使用肌原性的祖细胞表面标记的筛选表达式执行来自人类iPSC和ESC线。表面标记资料建立后,我们进行进一步的调查使用iPSC-derived肌原性的祖细胞因为准确疾病建模使用不同的细胞系要求有效地净化iPSC-derived肌原性的祖细胞。虽然mac并不产生特异性多种标记物的概要文件的图形表示形式,流式细胞仪可以提供通过一个流程图,我们使用mac孤立的细胞由于其几个优点在流式细胞仪,更好地满足我们的要求single-marker排序在这个研究:mac电脑更简单,更快的4 - 6倍,可以处理更多的细胞,由于它能够并行运行样本,并产生更高的细胞生存只有7 - 9%细胞损失~ 70%亏损的手机相比,流式细胞仪(21,53)以及更高的postsort人口增长(22]。纯度postsort细胞产生的mac被报道在80 - 90%的范围21,22,54- - - - - -56),可以通过使用更多的抗体和改善磁性微比制造商建议的协议(21]。多种标记物与mac排序也可以顺序执行。浓缩的肌肉使用六祖细胞表面标记确定在本研究中启用分化和成熟的人类iPSC-derived FGF-2-treated EZ球细胞明显更大在体外肌原性的潜力。蛋白质生物角色名称和代表这6个标记表进行了总结1。
正如预测的那样,已经形成的人类肌原性的标记CD56(神经细胞粘附分子;NCAM)和CD29(整合素beta 1)能够隔离大部分肌原性的祖细胞从我们的EZ球体的文化。几组报道成功的浓缩的人类PSC-derived肌原性的细胞CD56 (19,40]和CD29 [57]。CD56 myotube-forming细胞的比例+分数高于不仅CD56- - - - - -分数还未排序的人群具有重要意义,这意味着CD56可能就足够为浓缩的人类工作PSC-derived肌原性的祖细胞。CD29另一方面不足作为唯一的标记识别人类肌原性的祖细胞,CD29- - - - - -分数仍然包含大部分myotube-forming细胞。这一发现与之前一致建议概念,并非所有的肌原性的祖细胞表达CD29 [11,12]。尽管如此,高CD29肌原性的潜在能力+细胞群意味着CD29表达可能有一种角色可以促进肌肉分化。在我们的研究中,肌原性的潜在CD29之间没有明显不同+分化后和无序的人群。消除CD29- - - - - -细胞可能不会改变的细胞群组成,因为大多数的无序细胞CD29-postive(图S3)。
也称为我生成受体或低亲和力神经生长因子受体(p75NGFR) CD271是一个非常有前途的隔离标志人类PSC-derived肌原性的祖细胞和蕴藏的巨大潜力推出小说细节对肌细胞生成的机制。以前,浓缩的混合结果报道PSC-derived肌原性的祖细胞使用CD271作为积极的标志:一组报道成功CD271-based浓缩的肌原性的祖细胞从PAX7 / Myf5双重ESCs记者在血清培养基培养(20.两组),而另一个成功应用CD271-based浓缩的iPSC-derived肌原性的祖细胞在无血清培养条件下(准备19,50]。在目前的研究中,CD271-based浓缩肌原性的细胞是成功的在人类iPSC-derived EZ球体准备下无血清协议:myotube-forming CD271细胞几乎完全被发现+分数;CD271 myotube-forming细胞的比例可以忽略不计- - - - - -分数可能反映了CD271污染+细胞。虽然不容易解码为什么有不同结果驾驶CD271-based浓缩后肌原性的承诺,推导协议和PSC的差异之间的界线研究可以解释不同对每个协议的反应。,有趣的是,因为几乎所有的细胞都在无序的人群iPSC-derived EZ球体CD271呈阳性强度高,理论上细胞成分并没有很大程度上无序的人口和CD271之间的不同+一部分人群,但CD271+部分展出的比例明显高于肌原性的分化与无序的人群。我们推测,CD271- - - - - -细胞可能有抑制作用在CD271肌肉分化的过程+细胞。这个假设也可能是由我们的发现支持postsorted CD271+领域表现出增长速度高于未排序的球体后低温贮藏和长期的文化扩张。这些CD271+球细胞也保留状态肌原性的祖细胞具有更高的能力后肌管形成终端分化的无序的人群相比。同时,沉默CD271表达导致减少肌管的形成和有缺陷的肌管形态、确认CD271对人类肌肉分化是必要的。
CD271在啮齿动物成肌细胞的功能已经在几个报告阐明。当与神经营养因子补充支持神经元的存活和分化,CD271+小学和C2C12小鼠成肌细胞数量激增,但没有区分,同时展示水平的提高磷酸化抑制剂的核因子k B (I -κB)和蛋白激酶B,这两个促进细胞存活(58]。CD271也报道抑制C3H10T1/2鼠标多能间充质干细胞的分化为成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞,细胞59]。在L6C5鼠肌原性的细胞,CD271被证明通过的参与促进肌管分化和融合核转录因子(NF -κBκB)激活和小热休克蛋白(sHSPs)αB-crystallin和Hsp2760]。另一项研究报道,CD271 L6C31鼠成肌细胞表达是早期发现在生长介质,但镀后切换到分化培养基后开始递减,在肌管完全未被发现。同样的研究报道,在成年人的主要文化成肌细胞,一些CD271+细胞出现在所有时间点测试,从早期电镀在生长介质,直到6天后在分化培养基(61年]。CD271表达的变化已报告在一波又一波的转换从早期到后期人类胎儿肌细胞生成,也与主肢肌纤维或成熟的发展二级胎儿肌纤维(19]。CD271 / ErbB3-based隔离可以用来丰富Pax7+细胞和Myf5+从人类胎儿肌肉细胞在妊娠的最初的三个月和其后三个月,包括在时间点其他肌原性的表面标记了肌肉祖细胞(51]。一个CD271+/ ErbB3+分组人口出现了肌肉和肌原性的转录因子的表达在妊娠8周;这个程序开始co-express一些细胞表面标记如CD56、CD82,然后CD146怀孕11周,开始失去CD271表达式在妊娠16周(19]。CD271也发挥着至关重要的作用在肌肉纤维类型的决心,是利用小鼠成肌细胞的一项研究显示,CD271促进快速肌凝蛋白重链的感应和fast-glycolytic标记62年]。氧化代谢受损和并发的CD271蛋白质积聚对mdx老鼠在这项研究中观察到的相似之处神经生长因子水平的增加记录杜氏肌萎缩症的病人中,因此,作者认为hyperactivation CD271-associated通路可能拯救缓慢氧化在瘠薄病理表型。综上所述,这些数据表明CD271表达骨骼肌成肌细胞的生存和增殖提供中介以及它们的分化和融合成肌管。CD271-associated途径的机制是如何相似或不同调节肌细胞生成的啮齿动物和人类还有待确定。
最近的一项研究显示,ESC-derived CD271高肌原性的祖细胞表达的水平明显高于PAX7肌原性的因素,MYF5, MYOD1 MYOG,显示高myotube-forming CD271相比能力低细胞(41]。FGF-2-treated ESC-derived EZ球细胞在我们的研究似乎表现出类似的CD271区别高和C271低亚种群在流式细胞仪分析,我们可以看到两个峰值代表细胞染色阳性的子集CD271高强度和低强度的另一个子集(补充图S3)。检测CD271高和CD271低细胞也被报道在各居民人类细胞类型,如咽下的癌症细胞,大脑黑素瘤细胞,乳腺上皮细胞祖细胞,成神经管细胞瘤细胞和胰腺星状细胞(63年- - - - - -69年]。CD271高这些研究细胞癌变和高度增殖。CD271之间的差异的进一步描述高和CD271低种群在不同细胞类型将允许更好的理解可能的角色CD271多能性和血统的承诺。
我们目前的数据支持,CD15可以作为负面标记肌原性的祖细胞来源于人类的多能干细胞。我们发现CD15+细胞几乎不拥有任何肌原性的活动,而CD15−分数产生高纯度人口强劲肌原性的祖细胞。然而,CD15−选择并没有导致肌肉分化水平高于未分类的数量。类似于上面的参数为CD29-based选择,这可能是因为CD15的比例+细胞在EZ球体和CD15很低+细胞去除不影响整个构图。此外,CD15的存在+细胞可能没有这样的抑制性影响肌原性的种群分化的细胞,这与我们提出关于CD271之上−细胞。Nonmyogenic CD15+细胞甚至可能为维护CD15配角−肌原性的细胞,如postsorted CD15−球体增长率显著减少后低温贮藏和长期的文化扩张相比,平行准备未排序的细胞。明显较大的集合体聚集CD15细胞被发现有区别的文化- - - - - -球细胞,尽管这些CD15−细胞保留肌原性的地位与myotube-forming祖细胞与未分类的细胞的能力。还需要进一步的研究来阐明什么类型的细胞中表达CD15 EZ球体的文化。几组CD15报道+细胞主要是检测到的脂肪形成的人口相对较少的肌原性的能力,而高肌原性的祖细胞缺乏CD15表达(13,14,70年]。
我们这里发现CD9和CD146新的表面蛋白,这可能是至关重要的对人类肌管的成熟和融合。CD9和CD146不相宜的肌原性的祖细胞衍生的隔离使用我们的协议,CD9 myotube-forming细胞类似的分布+和CD9−分数以及CD146+和CD146−分数。然而,由CD9肌管形成+细胞和CD146+多核细胞厚和超过CD9肌管形成−细胞和CD146−细胞。更具体地说,一些CD9的肌管+分数有异常高的宽度长度比,与细胞核聚集在中心,而不是排队的主要轴肌管(数字3和4)。特别,相似的形态学观察老鼠细胞缺乏CD9。在文化、从CD9成肌细胞−−/老鼠融合频率高于正常肌管形成大的合胞体,包含许多核文化。此外,CD9−−/老鼠显示异常的肌肉再生,形成离散巨头瘠薄肌纤维(71年]。早前的一项研究报道,anti-CD9单克隆抗体抑制和延迟的小鼠成肌细胞分化C2C12细胞细长的肌管(72年]。尽管有这些差异可以解释为生化不兼容不同的物种,异常肌管的比较观察融合无疑链接tetraspanin CD9肌细胞生成。事实上,它已经涉及upregulation CD9的表达激活小鼠干细胞的动员受伤的肌肉(73年]。尽管最近的一项研究定义的血统−/α7整合素+/ CD9+细胞内的肌原性的隔间鼠成人肌肉干细胞和成肌细胞74年],CD9从未被提出作为人类肌原性的祖标记。CD9的监管效应在不同粘附分子在免疫系统75年)和血小板招聘(76年]显示它的重要性在细胞活动中引发的损伤反应。我们推测,CD9可能扮演相同角色,迁移,肌原性的细胞的粘附和聚集在受伤的网站。更多的工作是找出可能的保证CD9参与肌管融合在人类身上。不仅在CD9-sorted细胞CD146+肌管也厚,一排排的集中位于细胞核,而高度一致,并与相邻的肌管融合。CD146+细胞分离成人肌肉,胎儿肌肉和胎盘以前报道表现出高肌原性的潜在[11]。原位CD146+细胞被发现在成人肌肉肌内膜(13),以及相邻肌纤维和骨骼肌血管内胎儿77年]。考虑到居民CD146的位置+细胞和肌原性的潜力,可能CD146标记细胞负责迁移的一个子集,myotube-forming细胞的组织和对齐。
PAX7作为转录因子主要是肌原性的祖细胞的细胞核中,但是我们的详细分析表明,PAX7表达式也检测到细胞质内舱。特定转录因子的功能和转译后的事件可以推断通过他们的亚细胞定位,但缺乏研究PAX7监管肌原性的祖细胞的蛋白质分布和运输。一项研究报道,dfd13 dystrophin-deficient小鼠成肌细胞的比例明显高于PAX7相比在细胞质中局部C2C12野生型小鼠成肌细胞(78年]。亚细胞分布的详细分析表明,在细胞质PAX7本地化内质网,高尔基体,和回收内体dfd13和C2C12成肌细胞,PAX7本地化在dfd13回收核内体明显更高的成肌细胞,表明PAX7更积极地穿越细胞质在dystrophin-deficient成肌细胞。本研究发现,PAX7与KPNA2 (karyopherin -α2,或者importin亚基alpha -),一个家庭成员的蛋白质作为蛋白质转运蛋白核,证实了早先的介词研究KPNA2对成肌细胞增殖(很重要79年]。在细胞质中合成另一个肌原性的因素和快速运送到细胞核MyoD;MyoD退化发生在细胞核和细胞质(80年]。因此,分布格局和易位Pax7可能是至关重要的,以确定这种蛋白质是否被正确地激活正常功能和退化。分散的胞质分布在我们的研究中观察到的PAX7可能描述不同的细胞亚型不同PAX7事件和函数,或者可能有一个缺陷在PAX7蛋白质贩卖或细胞核。最少、排序分数较高的未分化iPSC-derived EZ球细胞的核PAX7本地化对应分数,当分化产生更多的肌管(CD29+、CD56+,CD271+,CD15- - - - - -)或更高的肌管融合(CD9+CD146+)。请注意,CD56+分数和CD271+部分含有更多核PAX7+比他们的同行CD56细胞- - - - - -分数和CD271- - - - - -分数只有温和的意义( 和 ,分别),但前者比后者高肌小管产生意义( )。统计的差异区别这两个双排序分数可能表明增加肌肉消耗CD56后分化的承诺或能力- - - - - -细胞和CD271- - - - - -细胞的文化。这也许可以解释为什么CD56+分数和CD271+分数是唯一准备形成肌管明显多于未分类的控制(部分2。1)。成功识别的表面标记分离人类PSC-derived肌原性的祖细胞具有更高潜力肌管的形成和融合证明我们的方法可行11]。一个浓缩使用这些标识表面标记允许我们描述不同的细胞亚型内肌原性的祖池,以及他们如何相互作用,从而使调查的这些表面标记的表达调节肌细胞生成。使用表面标记进行浓缩,我们可以推迟复制衰老,增加扩散,并改善肌肉的肌原性的祖细胞分化,从而促进更方便,高效,有效利用这些细胞的研究。我们主要关注在体外评估在当前的研究中,所以我们还没有检查丰富细胞的潜力在活的有机体内异种移植后肌肉再生。我们的未来研究方向包括评估的移植能力丰富人类PSC-derived肌原性的祖细胞,以确定是否有使用这些前景识别标记移植研究。而言,在体外描述,需要更成熟的祖细胞功能和机械的分析仍然是一个挑战需要解决肌肉生物学领域的研究。
5。结论
细胞表面标记分析被证明是有用的浓缩肌原性的祖细胞来源于人类已经通过transgene-free方法,以及识别此前未公布的表面蛋白,肌管的形成和成熟的重要作用。更好地描述人类肌原性的祖细胞的细胞特征通过定向分化的方法可能会导致准备在体外模型概括人类发展和特异性血统更紧密,从而允许对增强临床效用。进一步发展我们的知识的表型不同的细胞具有肌原性的祖属性和函数也可以想象援助承诺目标的选择提供进展为肌肉疾病和肌肉损伤再生的方法。我们预料将会做更多的研究来定义和区分人类的亚种群PSC-derived肌原性的祖细胞,从而促进人类肌肉发展发现新颖的见解,体内平衡,衰老和疾病。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。我们自由地接受请求访问这些数据,它应该通信作者(Masatoshi铃木masatoshi.suzuki@wisc.edu)。
附加分
总结陈述。细胞表面标记CD9、CD15 CD29、CD56、CD146, CD271可以用来丰富人类骨骼肌祖细胞来自多能干细胞。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
PAX7抗体和肌凝蛋白重链(MF20)从DSHB获得开发研究所和维护由爱荷华大学。这项工作是支持由美国国立卫生研究院(R01NS091540 R01AR077191,硕士),好的食物研究所(硕士)和威斯康辛大学基金会(硕士)。第一作者(S-R.T)。要感谢威斯康辛大学干细胞与再生医学中心的金融支持。
补充材料
补充表S1:抗体用于这项研究。补充图S1:表面标记的人类iPSC-derived肌原性的祖细胞。(一)89在FGF-2-treated细胞表面标记,没有检测到。(B) 56表面标记FGF-2-treated之间,并没有显示出明显不同的表达水平和参与细胞。(C) 10 FGF-2-treated细胞表面标记显示更高的表达式和23显示在FGF-2-treated细胞低表达。补充图S2:表面标记未能丰富人类iPSC-derived肌原性的祖细胞。数量明显相似的肌管被发现在两个正面和负面分数排序的人类iPSC-derived EZ球细胞根据其表达CD13, CD24, CD26, CD49b, CD49f, CD82, CD98, CD164, ErbB3和整合素α7;这些标记都无法丰富肌原性的祖细胞。 。补充图S3:表面标记分析人类PSC-derived肌原性的祖细胞流式细胞术。CD56阳性标记的表达CD29, CD146,和CD271 - CD15标志,“浓缩”标记CD184(从左至右)在人类iPSC-derived(上)和ESC-derived(底部)FGF-2-treated EZ球细胞。(补充材料)