文摘
背景。同种异体移植物排斥postkidney移植(KTx)是一个主要的临床挑战尽管增加访问医疗体系和改善免疫抑制药物(是)。近年来,间充质基质细胞(msc)已经引起了相当大的兴趣领域移植因其免疫调节和再生性能。本研究旨在调查安全、可行性和免疫效果的自体msc (auto-MSCs)和同种异体msc (allo-MSCs)作为补充是KTx患者药物治疗。方法。10患者发生KTx living-related捐赠者进行分析以及5例在对照组。患者auto-MSCs或allo-MSCs在两个时间点,即,one day before transplant (D-0) and 30 days after transplant (D-30) at the rate of 1.0- 除了免疫抑制剂msc每公斤体重。随访2年,29个免疫相关淋巴细胞亚群和8细胞因子和重要的生物标志物在所有时间点进行了分析。结果。病人没有任何不适的迹象显示或者在应对MSC注入剂量相关毒性。流仪分析显示B监管淋巴细胞数量的增加和非传统T调节细胞和T效应淋巴细胞比例下降auto-MSC-infused病人。没有这样的优惠在所有MSC-infused患者免疫反应观察。结论。该研究提供了证据表明auto-MSCs安全和耐受性良好。这是美国首次报道比较自体和同种异体MSC KTx患者输液。重要的是,我们的数据表明,MSC-induced免疫反应的患者并没有完全与临床结果。我们的发现使用msc在KTx添加到当前的角度,探索可能性可以实现通过供体/受体嵌合KTx患者诱导免疫耐受。
1。介绍
肾移植(KTx)加上免疫抑制药物(是)是首选治疗终末期肾病(ESRD) [1]在透析过程中,通常表现在nonavailability合适的捐赠者或潜在的医疗条件。尽管医学进步,长期移植物生存post-KTx仍然是一个重大的挑战[2)进一步危及长期使用的药物。因此,寻求新的治疗方法,那将是极大的好处,可以替代/锥使用免疫抑制剂。是治疗的主要目标是抑制免疫细胞(3];然而,利用这些疗法对特定的淋巴细胞存在的困难是由于重叠效应和监管途径利用淋巴细胞(4]。因此,有必要了解淋巴细胞车厢上的各种细胞疗法的效果,作为免疫调节机制调解的大多数的影响具有重要的意义。在这方面,间充质基质细胞(msc)已被证明有巨大的潜力被视为一种替代或辅助治疗许多病潜在的免疫调节和再生条件通过旁分泌和直接影响,分别。msc是有据可查的影响T细胞(5),但它们的影响尚未完全推断在T细胞相互作用子集。最近的研究也强调了骨髓间充质调节B细胞的能力(6,7]。因此,它将是有趣的探索如果msc重塑免疫平衡KTx移植病人和他们的影响结果。
我们此前试点研究发表在4 KTx患者的安全性和有效性auto-MSCs结合药物治疗postinduction [8]。目前的研究旨在评估两次点MSC输液的效果在自体和同种异体T细胞和B细胞(donor-derived)设置没有任何ATG诱导治疗。此后,临床效果分析。
2。方法
2.1。研究目标、设计、安全性和疗效监测
招募ESRD患者组织病理学确认。病人ATG诱导疗法或受到任何感染被排除在外。包含和排除标准详细补充表(圣1)。所有协议设计机构委员会批准的干细胞研究PGIMER (PGI-IC-SCRT-39-2013/1471),昌迪加尔,没有批准后更改了。协议进行根据有关规定和指导方针中指定批准信,并从患者知情同意了。
对于这个开放的,与这些相应平行的组织前瞻性研究(补充图(科幻小说1),共30例,与计划KTx living-related捐赠者,评估和17例符合入选标准分为3组(SF 1),即自体(汽车)组( ;27)平均年龄24岁(23日),同种异体(喂)组( ;37岁的平均年龄31(20.5))和对照组( ;35),平均年龄23.5 (25)。任务是分配比率为1:1:1。患者登记从2013年6月到2015年3月,随访2年。主要和次要目标和端点已经总结了在圣2。病人的人口统计资料和临床资料中描述的圣3和圣4中描述的细胞剂量。一个病人从每个汽车和紧密相联的组没有跟进,离开 为每个组。研究设计涉及不同时间点图以图形方式描述1。人口集淋巴细胞、细胞因子和生物标志物特征都列在下表中1。所有临床及免疫学参数测量的统计摘要定期报告在圣5和表2,分别。
2.2。免疫抑制药物治疗和支持性护理
所有患者接受治疗他克莫司(TAC),霉酚酸酯(MMF)和强的松(图1)。TAC是开始移植手术前48小时,保持槽10 - 12级别调整ng / mL的第一个月然后8和10 ng / mL之间具有重要的在接下来的1 - 3个月。MMF(骁悉®,罗氏)剂量的1 g,一天两次,。类固醇剂量为0.5毫克/公斤是最初和锥形5毫克/天的6th星期。具有重要的意义此外,复方磺胺甲恶唑磺胺甲恶唑+甲氧苄氨嘧啶160毫克)(400毫克每日为6个月。全血TAC槽水平(C0)监控,直到达到目标水平。患者监测临床条件或血清肌酐的变化(Scr)的水平。
估计的肾小球滤过率(eGFR)确定使用Nankivell方程(9]。活检是同种异体移植物功能障碍或蛋白尿。
2.3。细胞的制备和表征
msc是准备从骨髓(BM)吸入的病人(汽车集团)或相应的肾脏捐赠者(喂组)约6 - 8周(图1)移植前的转化和再生医学,PGIMER,昌迪加尔,如前所述8,10]。短暂,40毫升的骨髓样本受到密度梯度离心法,收集和单核细胞和resuspended完成媒体(α最小的重要媒体+ 10%汇集人类血小板溶解产物)。细胞接种密度的t - 225的玻璃瓶 细胞/厘米2被密封在一个孵化器有限公司为5%2在37°C。confluency msc使胰蛋白酶化在80%,扩大hyperflasks直到通道2,和冻存于液氮中直到输液的时间。低温贮藏msc在完整恢复和扩大MEM含有10% pHPL输液前7天。那天注入(D-0或d),细胞使胰蛋白酶化,他们的数量确定用台盼蓝注入之前(> 95%)的可行性。
msc还表型和功能符合国际社会细胞疗法(ISCT)指南11]。当在光学显微镜下观察时,msc有典型的纺锤形表面形态和坚持(科幻2 a)。表型特征,msc沾fluorochrome-labelled抗体并使用流式细胞术分析。Culture-expanded msc通道3显示≤2%为造血的谱系标记CD34免疫反应性,CD45, CD11b, CD19, HLA-DR和积极性human-MSC特定标记CD73≥95%, CD90、CD105(科幻2 b)。无污点的msc被用作一个负控制进行分析。
msc的功能特性是通过4根据其分化为脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞(科幻2 c)。脂肪形成的分化,细胞在6-well镀板的密度 细胞/厘米2和维护在一个脂肪形成的介质组成αmem、isomethylbutylxanthine、胰岛素、地塞米松和吲哚美辛。同样,对于成骨分化,细胞被镀的密度 细胞/厘米2和αmem补充与地塞米松、抗坏血酸和甘油磷酸盐。评估chondrogenic潜力,软骨细胞分化工具包(HiMedia)每个制造商的使用协议。
培养基是改变每3到4天。21天,使用油红O染色进行估计的中性脂质积累脂肪分化脂肪细胞的液泡。同样,分化骨细胞的染色是使用茜素红S,执行检测碱性磷酸酶活性,chondrogenic分化是证明了与阿尔新蓝染色,检测内里含有在软骨细胞的表达。
核型分析是也表现为culture-expanded msc(通过3)证实染色体稳定性(科幻2 d)。积极地从70%细胞分裂,汇合的培养瓶服用KaryoMAX®(Gibco)抑制细胞的增殖在中期阶段。有丝分裂被捕后,细胞收获使用胰蛋白酶/ EDTA和沉浸在氯化钾溶液在37°C低渗的治疗。细胞治疗是离心机,紧随其后的是固定使用Carnoy的固定剂。细胞被resuspended在新鲜的固定剂溶液在室温下的幻灯片准备。细胞悬液是掉在热板上的滑动,保持2 - 3分钟在38-40°C。一旦干,幻灯片被保存在室温下过夜,然后沉浸在寒冷的胰蛋白酶的解决方案,并使用染色染色了。胰蛋白酶和染色乐队(GTG)分析了显微镜下(100 x)。中期通过CCD摄像头捕获和分析使用GenASIs Bandview软件(应用光谱成像)。至少20带状中期对所有样本被捕。
MSC培养基用于检测细菌和真菌污染物或支原体病原的发病率(科幻2 e)。BACTEC血液文化系统是用来排除有氧和厌氧细菌污染,和琼脂板被用来检测真菌污染。对于支原体测试,使用支原体嵌套PCR检测(豆类)进行设置。细胞融合一旦不育是证实。
2.4。电池管理
汽车和喂组患者接受两个静脉MSC注入D-0和d -,对于每个剂量,大约1 - 细胞/公斤体重有(圣4)。患者premedicated扑热息痛和扑尔敏postinfusion作为防范措施,以防止任何反应。病人的要害是监控postinfusion 4 - 6小时。
2.5。临床评价
常规临床参数(圣5)以天(D) 0, 30岁,90年,180年,365年和800年,血清肌酐和表皮生长因子受体。
2.6。免疫学评价
Immunophenotyping进行孤立的外周血单核细胞和细胞因子分析进行血清样本收集在天(D) 0, 30岁,90年,180年、365年和800年。淋巴细胞亚群进行了分析使用fluorochrome-labelled单克隆抗体FACSAria流式细胞分析仪(圣6)。Th1 / Th2 / Th17细胞因子和TGF -β1是量化使用商用设备(圣6)。控制策略提供了表现型补充数据科幻3和4。
2.7。统计分析
分析通过使用内部的R进行脚本(12]。只要适用,价值观首先调整各自的亲本种群。调整值进一步规范化(min-max)前统计分析。线性混合模型使用R包lme4,其次是方差分析,用于访问显著因素。威尔科特斯R方法测试-威尔科克斯。测试(x, y,配对= FALSE)被用来执行Wilcoxon等级和测试以测试零假设,两个变量的分布在调查中不同位置的转移 。块生成的值创建使用R方法箱线图()。
3所示。结果
3.1。msc移植耐受良好,没有临床影响生存
病人没有任何不适的迹象显示、过敏或感染期间或post-MSC输液。在汽车集团,40%患者移植后立即拒绝集(Pa5和乙烯),和喂组40%患者拒绝集(P3-TCMR在3.5个月,P6-immediate拒绝posttransplantation)(圣3),但后来稳定移植肾功能得以实现。相反,没有排斥反应观察对照组(圣3)。所有的常规临床参数分析显示,在此期间没有重大变化的跟踪,在正常范围内(圣5)。然而,可控硅和表皮生长因子受体是规范化水平在所有的群体posttransplantation(图2)。
(一)
(b)
3.2。msc T和B淋巴细胞的频率改变
流仪分析指出,汽车组CD4 T细胞的减少后续的末尾而CD8 T细胞(数据尚未受到影响3(一个)和3 (b))。我们进一步新陈代谢活动相比,T奈细胞识别MSC注入细胞分化过程的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
分析T奈对TEFF细胞显示更高比例的T奈细胞内的汽车集团在CD4(图d - 8003 (c))和CD8 T细胞(图3 (d))。此外,分析T奈T:MEM在d - 800细胞显示海拔在CD4(图的汽车集团3 (e))和CD8(图3 (f))T细胞的子集。这指向了T奈细胞与TEFF和TMEM细胞在汽车集团。这种趋势更加明显效应记忆(TMEM-EM比中央内存(T)的子集MEM-CM(表)的子集2)。我们发现T下降海军学校规则在汽车和对照组下降趋势紧密相联的组(图3 (g))。双重否定的增加(DN) T细胞在不同时间点观察在汽车集团,这是明显高于d - 800比在对照组或健康对照组(图3 (h))。无显著差异在其他T细胞亚群在同分异构的或明显的对照组(表2)。
在我们之前的研究中,CD19 auto-MSC-treated患者B细胞减少posttransplantation [6]。评估这一变化的具体影响,我们进一步使用bm-bm5和CD27 / CD19 B细胞特征子集IgD分类。没有相关的差异明显的汽车内的子集或对照组。有趣的是,在喂,bm2 bm2 ,和bm3 + 4细胞在d - 800(表显示下降2)。这些结果表明差异的长期影响汽车,allo-MSCs KTx患者的B细胞轮廓。
因为B海军学校规则导致移植耐受,我们研究不成熟的B (B即时通讯)细胞连同其他两个B注册子集,表型类似于经典的B注册和B10数量,即。,CD19+CD5+CD1d嗨(B海军学校规则)和CD19+CD27+CD24嗨(B10细胞)。B的比较分析10和B即时通讯对CD4 / CD8 T子集EFF表示数量显著增加在汽车集团在不同的时间点(数据4(一)- - - - - -4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
相反,在喂组,B即时通讯T:EFF集团内部细胞减少,各种各样地降低HC(表相比2)。没有观察到显著变化在对照组B细胞的数量。
3.3。msc调节细胞因子水平
TGF -显著增加β1水平明显在汽车集团直到d - 800(表2),重叠与CD4 T下降EFFT和B细胞和DN的增加注册子集。同分异构的小组展示了TGF -断断续续的增加β1 post-D-30(表2)。MFI - 2 d - 365汽车集团是低于喂组(表2)。没有其他的细胞因子有显著变化在汽车或喂组(表中2)。观察到的细胞因子水平无显著差异。
4所示。讨论
免疫抑制剂是给KTx接受者阻碍免疫细胞介导的排斥,从而促进成功移植的捐赠肾脏。尽管药物管理改进,KTx患者不仅遭受危及生命的并发症,也倾向于机会性感染。有一个最大的需要开发一种方法,将供体特异性immune-hyporesponsiveness援助,从而减少病人的免疫抑制剂的依赖。免疫环境是不断变化的,贪污接受移植的设置是由免疫系统如何适应挑战,灌输强加。然而,同时评估细胞和体液免疫系统的至关重要的预测移植物移植设置质量。
msc对治疗的潜在的主要竞争者,再生和免疫调节活动。本研究评估安全性和有效性的auto-MSCs和allo-MSCs病人KTx。第一次输液在D-0建立protolerogenic微环境可能促进移植物验收,避免急性移植肾功能的恶化,和第二个注入了d -抗击炎症环境和延长protolerogenic作用时间均由msc。
我们的研究表明MSC注入与有利的肾移植患者的免疫反应是可行的,但是没有短期临床效益干预正常的肾移植风险。我们表明,auto-MSC注入移植幼稚T (T奈监管(B)子集,B海军学校规则)和双重否定(DN) T细胞可能有助于减少循环效应T (TEFF)细胞。
众所周知,供体特异性宽容是圣杯移植免疫学、和研究表明,TMEM可以直接刺激T细胞EFF细胞和被证明是有害的腐败(13]。有增加的发病率相关拒绝增加循环记忆T细胞(14]。因此,低TEFF/ TMEM相对于T细胞的比例奈细胞post-auto-MSC灌注,观察在我们的研究中可能的潜在治疗价值。
T海军学校规则已报告保持供体特异性KTx病人停止响应(15];然而,我们发现T下降海军学校规则在所有团体无论MSC输液,挑战MSC-induced T的当前视图海军学校规则扩张。然而,T的数量海军学校规则甚至可能不与骨髓间充质抑制T细胞功能的功能能力(16]。Downregulation T的海军学校规则可以归因于使用钙调磷酸酶抑制剂的治疗(17),这是众所周知的,2块生产,所需T海军学校规则扩张。不为人知的非传统T海军学校规则子集等双重否定T (DN T细胞也已知免疫抑制特性(18]。DN T细胞缺乏FoxP3表达,因此抗钙release-activated抑制钙通道(19)支持这些细胞的增加在我们的研究中。同时,迄今为止的研究表明B的重要性海军学校规则在临床前移植模型和患者(20.,21]。B海军学校规则有直接影响通过抑制效应T细胞在抗体生产除了他们的角色。他们的分析可以帮助识别患者免疫耐受从而减少免疫抑制方案。B的增加的趋势海军学校规则与效应T细胞在我们的设置表明森严的B细胞容忍检查站post-auto-MSC注入;然而,这些细胞的功能状态还未确定在我们的研究中。
相反,allo-MSC注入导致T细胞亚群变化不显著但减少监管B细胞的子集。尽管不同的研究提倡使用allo-MSCs(表3),我们的数据表明,之前考虑的应用msc紧密相联的原产地在肾移植患者中,还需要进一步的研究来分析其对免疫细胞表型和功能的影响。
我们确定了TGF -β作为主要的免疫调节细胞因子在我们的研究中。增加这个抗炎细胞因子可能表明转变从Th1、Th2反应汽车集团的病人。
大量研究报道msc(表的安全性和有效性3);然而,有不同的来源,剂量,MSC行政路线,时间点,方案,后续阶段。此外,这些研究疗效端点的差异使其进一步挑战来推断msc的治疗效果。
我们研究的新颖性在于比较两组的免疫档案管理有两个时间点剂量的自体和同种异体msc、和主要研究结果指向控制免疫环境(图5)移植,特别是在较小的汽车集团对临床参数用于确定影响移植物生存能力。虽然一些研究,指出表3,有指向基本免疫,有些人指向汽车或allo-MSCs的临床安全性和可行性。我们研究的独特之处在于比较分析29 T细胞和B细胞与细胞因子子集分析两组的一个不确定的对临床结果的影响,强调进行更规范的试验利用msc在实体器官移植。
我们的研究是有限的小样本大小和功能评估数据的缺乏。然而,我们的研究将贡献大幅向理解MSC的长期免疫调节效应,考虑可用的MSC疗效数据的不足。尽管我们认为有利的免疫反应是前排post-auto-MSC输液,只能说在大样本临床相关性大小和后续多年。
研究的主要结果(圣2)的注入auto-MSCs KTx病人安全和耐受性良好。移植的结果而言,所有KTx患者显示稳定的移植肾功能最终拒绝集后几个病人。免疫反应的变化很明显,无论同源,隔离,扩张的条件,和剂量的msc。这些差异背后的确切原因尚不清楚;然而,这些可能是引起donor-dependent可变性或宿主微环境。作为一个次要结果(圣2),结果集体压力在一个独特的淋巴细胞亚群的变化趋势,将帮助我们进行更有针对性的临床试验,最终提高长期移植物存活率。自体msc的起源可能是更安全的选择而言,避免不必要的免疫反应而msc外源的起源可能引起特定针对供体抗原的细胞和体液免疫反应。
尽管看似有利的免疫,临床无效在这项研究中也很明显。因此,我们的研究结果添加到当前的角度使用msc KTx和探索可能性可以实现通过供体/受体嵌合KTx患者诱导免疫耐受。
数据可用性
支持数据作为辅助数据。
信息披露
Urvashi Kaundal是NIH的当前地址,贝塞斯达,美国。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
拉贾拉玛钱德朗和Amit Arora同样这项工作。
确认
我们非常感谢Remuzzi教授和博士就锁定在马里奥·内格里研究所日前,意大利,为促进短期培训AR免疫学技术相关项目。这项研究是在ClinicalTrials.gov注册NCT02409940。
补充材料
补充表(圣1 ST 7)。圣1:患者合格标准。圣2:小学和中学的研究目标和端点。圣3:病人人口和肾移植患者的临床资料。圣4:postmanufacturing细胞特征。圣5:临床参数的统计总结学习小组。圣6:资源表。圣7:HLA打字肾脏受体和捐赠者。补充数据(SF 1科幻4)。科幻1:配偶流程图:筛查试验报告,登记,分配,跟踪和分析在自体MSC注入(汽车)和同种异体(喂)组与对照组。科幻2:MSC描述骨骨髓来源间充质基质细胞。(一)代表的光学显微镜照片纺锤状附着msc (p 2)(放大:20 x)。 (B) MSC gating according to the FSC and SSC profile. Flow cytometric analysis indicated that BM-MSCs are negative for CD34, CD45, CD11b, CD19, and HLA-DR (negative cocktail) and positive for MSC surface markers CD73, CD90, and CD105. Dark grey-coloured plots represent specific antibody staining, and light grey plots represent negative control. (C) Representative images depicting在体外分化分析揭示脂滴的形成沾油红O (20 x,形成软骨细胞与阿尔新蓝染色(40 x)形成的骨细胞染色茜素红S (x) 20日。(D)代表正常的染色体组型-46年完成,XX, culture-expanded msc的通道3。核型分析是对所有样本的扩大msc用于输液。(E)不育测试执行对所有样本用于输液。厌氧细菌,有氧细菌、支原体、真菌污染输液前排除。科幻3:代表人物描绘人类T细胞的控制策略来识别子集。(一)淋巴细胞控制根据FSC和SSC概要文件。淋巴细胞被封闭的确定(B) CD3的比例+CD4细胞,(C)+CD8 T细胞,+T细胞和CD4细胞- - - - - -CD8- - - - - -T(双重否定(DN) T细胞。检测效应和记忆细胞子集,首先CD4 (D)+CD45RO+CD45RA- - - - - -和CD4+CD45RO- - - - - -CD45RA+CD8细胞(E)+CD45RO+CD45RA- - - - - -和CD8+CD45RO- - - - - -CD45RA+细胞被封闭,然后CD62L染色的基础上,细胞被确定为(F) CD4中央内存(CD4 TMEM-CM)和CD4记忆效应细胞(CD4 TMEM-EM),(G) CD4天真(CD4 T奈)和CD4效应(CD4 TEFF)细胞,(H) CD8中央内存(CD8 TMEM-CM)和CD8记忆效应(CD8 T细胞MEM-EM),(我)CD8天真(CD8 T奈)和CD8效应细胞(CD8 TEFF)。(J)淋巴细胞控制来确定(K) CD3的比例+CD4+T细胞。进一步从CD3+CD4+T细胞CD25 (L)嗨(M) T细胞被封闭海军学校规则(具体+CD127罗人口)。FCS-A:向前散射区域;SSC-A:侧散射区域。科幻4:代表人物描绘人类B细胞的控制策略来识别子集。(一)淋巴细胞控制根据FSC和SSC概要文件。淋巴细胞被封闭的确定(B) CD19的比例+B细胞,CD38和IgD双染色的基础上进一步划分为(C)处女天真IgD (bm1)+CD38−,激活天真IgD (bm2)+CD38+pregerminal (bm2 )IgD+CD38嗨生发中心(bm3+bm4) IgD−CD38嗨(ebm5) IgD,早期的记忆−CD38+,内存(bm5) IgD末−CD38−细胞。CD19 IgD-CD27双重染色的基础上+B细胞也被确定为B cells-IgD (D)交换−CD27+;unswitched B cells-IgD+CD27+;天真(B奈)igd+CD27−;和双重否定IgD B (DN)−CD27−细胞。监管从CD19 B细胞测定子集+B细胞通过闸门CD5 (E)+细胞和CD1d (F)嗨细胞的B注册(G) CD27子集+细胞和CD24 (H)嗨B10CD24细胞,(我)嗨细胞和CD38 (J)嗨不成熟的B细胞(B即时通讯)细胞。FCS-A:向前散射区域;SSC-A:侧散射区域。(补充材料)