文摘
神经干细胞(nsc)和衍生品都是潜在的治疗神经系统疾病的细胞来源。在目前的研究中,我们重组人类外周血单核细胞诱导nsc (iNSCs)和GFP基因插入贪污的AAVS1网站跟踪。目标融合GFP并不影响iNSCs的增殖和分化能力。iNSC-GFP可以进一步分化为多巴胺前体(dap)和运动神经元前体细胞(基于),分别。iNSCs道入运动皮层和iNSC-DAPs纹状体和黑质(SN)的非人类的灵长类动物,分别。幸存的iNSCs可以应对微环境的皮层和自发分化成成熟的神经元,神经突延长。iNSC-DAPs存活良好,成长为DA神经元移植到纹状体和SN。iNSC-MNPs也可能生存和转化为运动神经元道后大鼠的脊髓。结果表明iNSCs和衍生品有一个潜在的用于神经系统疾病的治疗。
1。介绍
神经干细胞(nsc) [1)及其衍生物有前途的候选人细胞治疗各种神经系统疾病/障碍。过去十年目睹了重编程领域的快速发展,可以提供替代胎儿脑源性主要国家安全委员会(NSC来源除了1- - - - - -4]。在我们之前的研究中,我们报告的生成iNSCs通过重组人类外周血单核细胞(PBMNCs)与仙台病毒载体编码键重组因子和修改的文化条件NSC-selective介质(5]。获得iNSCs显示良好的自我更新能力和分化到特定的神经元亚型,如多巴胺(DA)神经元(6,7]。
人类iNSC——(hiNSC)派生DA前体展览安全和治疗效果当移植到免疫缺陷小鼠帕金森病(PD)模型(7),建议一个好的临床应用潜力。然而,测试hiNSC-DA前体在非人灵长类动物模型将包含更多的信息。然而,缺乏一个好的标志可以区分人类从猴子的细胞移植设置。标签的贪污BrdU或纳米颗粒具有一定的非特异性问题在转会BrdU标记移植可能或纳米颗粒在移植后宿主细胞死亡7- - - - - -10]。靶向敲入的绿色荧光蛋白(GFP)可能会解决这个问题。
此外,它是不知名的iNSCs是否可以分化成其他disease-relevant细胞类型。在当前的研究中,我们执行特定站点GFP融入iNSCs iNSC-GFP及其派生的DA特征和运动神经元(MN)前体移植后的中枢神经系统(CNS)猴子和老鼠。
2。材料和方法
2.1。隔离和PBMNCs文化
的隔离和扩张PBMNCs之前已经报道过(11]。~ 5毫升新鲜血液收集捐赠的抗凝管。单核细胞是由使用聚蔗糖梯度离心分离(Sigma-Aldrich,美国)和培养EM中包含Stemspan 3000(表达载体,美国),50μg / ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich,美国),50 ng / ml自洽场(Miltenyi、德国),10 ng / ml IL-3(表达载体,美国),2 U /毫升EPO(研发系统、美国),40 ng / ml igf - 1 (Miltenyi、德国),和1μ地塞米松(Sigma-Aldrich,美国)。
2.2。重组PBMNCs iNSCs
的重组PBMNCs iNSCs, 与20 PBMNCs涨跌互现μl仙台重组向量编码Oct3/4、Sox2 Klf4, Myc(热费希尔科学、美国)。第二天,仙台重组向量是通过改变介质中删除。第三天,媒介改变了NSC介质组成的DMEM / F12, Neurobasal在1:1比例, , ,1% GlutaMAX™,青霉素和链霉素1%,1% NEAA(从热费希尔科学、美国),重组人白血病抑制因子(hrLIF,微孔,妈,美国),和SB431542 CHIR99021(从谢立克,美国)。在7天左右,iNSC克隆将会出现。三个新兴克隆为进一步使手动选择。特征三个克隆的生长曲线,NSC标记表达式,和分化能力,所有三个显示类似的表型(数据未显示)。因此,一个随机选择的三个克隆GFP敲入和随后的移植实验。
2.3。针对集成AAVS1 GFP的网站
的使用Accutase iNSCs被分离成单个细胞。制造商的指示后4 d-nucleofector系统(Lonza、瑞士),包含同源臂的Cas9-expressing质粒和捐助质粒以及GFP-coding序列被放置到4 d-nucleofector系统一起electrotransfer缓冲区(Cas9-expressing质粒是由作者,捐赠者质粒从Addgene购买,美国)。电穿孔后48小时内,观察绿色荧光的表达。与绿色荧光细胞分类使用流式细胞仪。纯合子GFP-expressing细胞进一步选择单细胞文化和克隆扩张。
2.4。iNSCs多巴胺能神经元分化
iNSCs被分离成单个细胞利用Accutase并放在PDL / laminin-coated盘子。两步分化方法被用来区分iNSCs DA神经元。在第一阶段,iNSCs对待SAG1(恩佐,美国)和纤维母细胞生长因子8 (FGF8、PeproTech美国)为10天。在第二阶段,媒介被替换为一个混合物含有抗坏血酸(AA, Sigma-Aldrich,美国),脑源性神经营养因子(BDNF, PeproTech,美国),神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF, PeproTech,美国),环磷酸腺苷(营地,Sigma-Aldrich,美国),将生长因子β三世(TGF -β三世,PeproTech、美国)和榫眼14天(Sigma-Aldrich,美国),另一个促进DA神经元的成熟。
2.5。分化iNSCs运动神经元
iNSCs被分离成单个细胞并放在人工基底膜(康宁,美国)涂层板。分化的过程分为三个阶段。在第一阶段,iNSC介质取代化学定义神经介质,包括DMEM / F12, Neurobasal介质在1:1的比例, , ,0.1毫米抗坏血酸(Sigma-Aldrich,美国),1% GlutaMAX™,和1%的青霉素和链霉素。1μM CHIR99021, 2μM DMH-1 (Tocris),和2μM SB431542被添加在中。同时,维甲酸(RA, 0.1μ美国Stemgent mol / l)和嘘通路抑制剂(purmorphamine, 0.5μmol / l, Stemgent,美国)被添加到介质为7天。培养基是改变了每隔一天。iNSCs维护条件下6天,分化成OLIG2-positive运动神经元前体细胞。在分化的下一个阶段,我们退出CHIR +某人+ DMH, RA浓度增加到0.5μ0.1 mol / l, purmorphamine减少μmol / l。每隔一天中被改变。6天OLIG2-positive基于这个条件下分化成HB9-positive MNs。在分化的最后阶段,文化被Accumax消化(表达载体,美国)laminin-coated盘子和复合处理E(谢立克,美国),这是一个NOTCH信号抑制剂。HB9-positive MNs逐渐成熟,交织成网络结构。
2.6。培养细胞的免疫荧光染色
细胞被洗3次与PBS和固定用4%多聚甲醛,持续15分钟。细胞被封锁的3%胎牛血清和0.05% Triton x - 100 1小时。细胞主要抗体孵育过夜在4°C 3洗紧随其后。然后,二级抗体被添加之后,核与DAPI对比染色在室温下2小时。染色细胞被使用SP8徕卡共焦显微镜成像。抗体信息补充表中列出S2。
2.7。核型分析
像之前描述的那样进行核型分析(12,13]。短暂,iNSCs在NSC培养基培养2天,然后,这些细胞被孵化100 ng / ml秋水仙胺(生活技术,美国)为90分钟。然后,细胞被固定在一个冰冷的methanol-glacial乙酸(3:1)解决方案3次。染色体是沾染了赫斯特(生活技术,美国)和计算在630 x放大。
2.8。动物手术和细胞移植
非人灵长类动物的实验中,一个健康的雌性恒河猴在当前的研究中。动物是由肌肉注射麻醉的盐酸氯胺酮(5 - 10毫克/公斤的动物体重)结合dormium(1毫克/毫升)。抑制炎症反应,每日肌内注射青霉素(800年,000 U /天)是必需的术前和术后持续了额外三天。在手术过程中,葡萄糖5%的解决方案是提供和滴定维持动物的能量和体液平衡。注射Tolfedine CS(0.1毫升/公斤)进行减轻动物的痛苦。
在手术过程中,猕猴是固定使用立体定位工具。 DA前体悬浮在30岁μl与100 ng / ml BDNF DPBS, 100 ng / ml GDNF,和4 ng / ml bFGF注入右侧纹状体(第一点的位置: , ,和D / v - 11.4毫米;第二点的位置: , ,和D / v - 11.3毫米)和黑质( , ,和D / V-33毫米),分别指导下使用核磁共振图像。与此同时, iNSCs悬浮在30μl缓冲如上所述被注入的运动皮层区右侧前额叶( , ,和D / v - 1.2毫米)。
iNSC-derived运动神经元前体细胞移植到T9-T10地区的三只老鼠的前角灰质 MN前体悬浮在30岁μl DPBS注入脊髓。手术是由与1%戊巴比妥钠麻醉的动物一个ip剂量30毫克/公斤体重。
2.9。注射免疫抑制剂
移植的动物被注射了免疫抑制剂环孢霉素A(瑞士诺华公司)三天前细胞移植。环孢霉素A是每天两次注射的剂量10毫克/公斤/天。动物接受细胞移植治疗与环孢霉素抑制免疫排斥反应,直到他们被安乐死。
2.10。冰冻切片的组织和免疫荧光染色
三个月后的细胞移植到不同的猕猴大脑区域,动物安乐死。大脑被与4%多聚甲醛灌注固定后,紧随其后的是与30%蔗糖脱水。组织与O.C.T.嵌入化合物(日本樱花Finetek)至少30分钟在-20°C冷冻,然后使用冷冻切片机切片在矢状面。组织部分根据上述方法是免疫荧光染色。抗体信息补充表中列出S2。
类似地,两个星期后移植,老鼠被安乐死,和脊髓组织被灌注固定,切片,然后免疫荧光染色如上所述。
2.11。统计分析
统计分析和图形进行利用GraphPad棱镜8.0.2 (GraphPad软件,拉霍亚,CA)。给出的数据 。单向方差分析是用来比较三个或更多组,其次是Dunnett的多重比较检验。和一个值≤0.05被认为是重要的。
量化特定标记阳性细胞的比例,三种文化的细胞来源于同一克隆受到免疫染色和量化,9个字段的使用ImageJ每种文化进行了采样和分析软件(美国国家卫生研究院)。
量化幸存的移植细胞在动物,每5个部分(20μ米厚的)在整个移植网站统计。
3所示。结果
3.1。仙台PBMNCs重组成iNSCs利用向量
外周血单核细胞(PBMNCs)从周围静脉血分离(5毫升)的成年健康男性捐赠者通过梯度离心之前报道(11]。文化5天后,PBMNCs转导与仙台重组向量编码Oct3/4 Sox2, Klf4, Myc [14]。细胞被转移到PDL / laminin-coated板在一个特定的介质含重组人白血病抑制因子(hrLIF) SB431542, CHIR99021(图1(一))。第七天posttransduction, NSC-like克隆开始出现和手动选择了扩张在体外。在不同时间点细胞的形态学posttransduction图所示1 (b)。这些iNSCs可以不断自我更新在PDL单层附着形式/ laminin-coated板块以及neurosphere低粘附培养板(数字形式1 (c)和1 (d))。iNSCs仍保持相对增长率后30通道(图1 (e))。在下面,我们决定是否transdifferentiated细胞系表达神经干细胞的签名蛋白质。通过免疫荧光染色,iNSCs被证实为PAX6是积极的,巢蛋白,ZO-1, SOX2, N-CADHERIN (NCAD)和KI67(图1 (f))。巢蛋白阳性细胞的比例KI67, PAX6, NCAD达到约90%,细胞间也没有显著差异的5号,20和40(图1 (g))。此外,获得iNSCs显示正常核型(图1 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.2。Crispr-Cas9-Mediated目标集成AAVS1 GFP的网站
绿色荧光蛋白序列插入到AAVS1轨迹通过同源重组方法由Crispr-Cas9系统(15]。短暂,Cas9-expressing质粒和捐赠者质粒含有同源臂和GFP-coding序列被电子引入iNSCs转染(图2(一个))。iNSCs与GFP融合经使用三个具体的双引物PCR(图S1A-B)。GFP的表达可以检测到iNSC-GFP增殖培养基或分化培养基培养(图就是S1C)。通过流仪分析,GFP-positive细胞达到98.9%,对照组和GFP表达负面的iNSCs没有GFP敲入(图2 (b))。通过免疫荧光染色,iNSC-GFP仍然SOX2阳性,PAX6,巢蛋白,KI67(图2 (c))。此外,多能性标记NANOG iNSC-GFP是负数,SSEA4(图S1D)。NSC iNSC-GFP表达的标记也被证实是在转录水平的定量逆转录酶聚合酶链反应技术(图(存在)2 (e))。结果表明,iNSC-GFP能稳定表达GFP在不影响神经干细胞的特征。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。iNSC-GFP可以分化成中脑多巴胺神经元与效率高在体外
检查iNSC-GFP的分化能力,我们使用一个协议来区分iNSCs DA神经元(图3(一个))[7]。在不同时间点细胞的形态图所示3 (b)。DA神经lineage-related标记检测的细胞分化24(图10天3 (c))。分化第十天,细胞几乎不表达酪氨酸羟化酶(TH)或G-protein-regulated inward-rectifier钾通道2 (GIRK2),两者都是成熟的中脑多巴胺神经元标记(16]。在这个时间点(第十天),大多数细胞阳性相对早些时候DA神经元标记,叉头框蛋白A2 (FOXA2, 66.33%)和核受体related-1蛋白质(NURR1 71.5%)(数据3 (c)和3 (d))。分化一天24日FOXA2——NURR1-positive细胞的比例增加到92.1%和91.5%,分别为(数字3 (c)和3 (d))。同时,TH-positive细胞的比例达到90.8%,GIRK2-positive细胞的比例增加到32.63%(图3 (d))。此外,DA lineage-related基因的转录水平测量中存在于细胞的分化10天,13日,18日和24(图3 (e))。结果表明,iNSCs可以分化为多巴胺能神经元在体外效率高。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。iNSC-GFP可以分化成运动神经元在体外效率高
我们还测试了iNSC-GFP是否可以分化成运动神经元。分化的过程分为三个阶段,如图4(一),代表图片在不同的分化时间点在图所示4 (b)。接下来,我们比较了分化成运动神经元;也就是说,在每个阶段的细胞被免疫荧光鉴定。6分化天,超过80%的细胞iNSC-GFP组阳性MN祖细胞标记Olig2(数字4 (c)和4 (d)),HB9-positive的百分比和CHAT-positive细胞分化一天12(93.78%)达到顶峰,天24例(90.12%),分别为(数字4 (c)和4 (d))。的运动神经元分化的胚胎干细胞线H9 HB9-positive的比例和CHAT-positive细胞在分化21天达到顶峰,33岁的分别(数字4 (c)和4 (e))。没有显著差异的最高比例从iNSC-GFP HB9-positive和CHAT-positive细胞分化和H9(图4 (e))。结果表明,iNSC-GFP可以有效和迅速分化成锰在体外。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.5。表征接枝iNSCs和iNSC-DAPs三个月后移植到非人类灵长类动物的不同区域
接下来,我们将iNSCs和iNSC-DAPs移植到不同的非人灵长类的大脑区域(图5(一个))。iNSCs道入运动皮层和纹状体和黑质iNSC-DAPs (SN)(图5 (b))。移植后3个月,脑组织切片免疫荧光染色和分析。GFP-positive移植细胞被发现在注射部位(图5 (c)一、皮质;图5 (c)B,纹状体;和图5 (c)C, SN)。在大脑皮层,GFP-positive细胞与神经元形态学观察。神经元显示长流程(图5 (d)),这表明iNSCs可能对大脑皮层利基和分化成熟神经元。帕金森病的多巴胺能神经元回路控制运动功能受损,而这些DA神经元和投影目标位于SN和纹状体。考虑到与PD, iNSC-DAPs道纹状体和SN。移植后3个月,纹状体GFP-positive细胞成长为DA TH阳性神经元,神经元标记microtubule-associated GIRK2, NURR1,普遍蛋白2 (MAP2)(图5 (e))。在纹状体,约为18.82%,17.03%,20.25%,和41.70%的GFP-positive细胞coexpressed TH, NURR1, GIRK2,分别和MAP2(图5 (f))。约为91.25%,95.57%,和81.32%的TH-positive细胞与GIRK2 colabelled MAP2,分别和NURR1(图5 (g))。同样,iNSC-DAPs移植到SN利用免疫荧光染色(图进行了分析5 (h))。GFP-positive中移植细胞,约为16.82%,17.22%,16.03%,和45.35% coexpressed TH, GIRK2, NURR1和MAP2分别。TH-positive中移植细胞,约为89.30%,92.0%,和72.80%的人colabelled GIRK2, MAP2和NURR1(数字5(我)和5 (j))。GIRK2 SN A9针对性DA神经元的标记,和结果表明,道iNSC-DAPs成熟到中脑A9 DA神经元移植后的纹状体和SN非人灵长类动物的大脑。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
检查的安全性和谱系特异性道细胞,我们分析了KI67的表达,SOX2,巢蛋白和运动皮层和VGluT1的表达,glutaminergic神经元标记,聊天,胆碱能神经元标记,和GFAP的星形胶质细胞标记,纹状体和SN(图S2)。在运动皮层,没有GFP-positive细胞被发现与KI67 colabelled, SOX2,或巢蛋白,这表明具备干细胞移植iNSCs退出细胞周期,失去了三个月后transplantation-a无致瘤性的迹象。几个SOX2-positive细胞被检测到,但这些细胞为阴性GFP。我们也调查了是否iNSC-DAPs移植到纹状体和SN可能变成其他神经血统。然而,未发现GFP-positive细胞coexpress VGluT1,聊天,或者GFAP。
接下来,我们分析了移植细胞的神经突扩展/投影。观察神经突延伸三个区域的非人类灵长类动物大脑移植后3个月(图6(一))。在纹状体,GFP / TH double-positive DA神经元也显示扩展神经突的形态。基于GFP-positive脑组织细胞的扩散片,我们测量GFP-positive移植在这三个领域的大脑区域,运动皮层和移植领域,纹状体和黑质是15.89毫米2,17.67毫米2,13.02毫米2分别(图6 (c))。GFP-positive细胞的神经突密度也策划反对贪污丸中心的距离。神经突密度随着距离的增加而减少的移植中心,发现和探明可能多达5000人μm远离中心的SN和多达2500μ在纹状体(图6 (d))。神经突密度也测量了GFP / TH double-positive细胞在纹状体(图6 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。MN祖细胞的存活和分化移植到大鼠的脊髓
运动神经元祖细胞是一个潜在的候选人脊髓疾病的治疗,如ALS和脊髓损伤。我们将人类iNSC-derived运动神经元祖细胞移植到大鼠的脊髓(T9-T10)描述的生存和分化iNSC-MNPs(图7(一))。老鼠收到前3天移植的免疫抑制机制日常直到实验结束。我们首先寻找最优微分时间点可能产生良好的移植物存活率。iNSCs受到MN分化为10,12和14天,这些细胞不同分化的时间点被移植到脊髓的免疫抑制大鼠2周测试移植存活率。基于差异化的12天的最佳生存(数据未显示)。两周后细胞移植,细胞分化是12天,大约4%的脊髓移植细胞存活(数字7 (b)和7 (c))。在这个时候,一些嫁接GFP-positive细胞染色阳性神经元标记,HB9,聊天(图7 (d))。结果表明,iNSC-derived运动神经元祖细胞可以存活并分化成运动神经元移植后大鼠脊髓。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
诱导神经干细胞(iNSCs)在当前研究中使用重组人类PBMNCs起动器细胞来源,便于在常规临床实践。PBMNC-derived iNSCs拥有良好的潜在治疗神经系统疾病,同时提出降低风险的致瘤性与多能干细胞,如胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能)。ESCs和具有良好的增殖能力的细胞则可以扩展几乎无限在体外,呈现一个好的候选人同种异体细胞药物“现成的”。事实上,2021年,BlueRock疗法已开始一项临床试验,首次移植ESC-derived DAP (MSK-DA01 ClinicalTrials.gov标识符:NCT04802733)到一个PD患者(17]。审判在许多PD患者带来了希望和承诺。然而多年的后续需要检查移植物的长期安全性和有效性,特别是潜在的肿瘤发生的风险可能不完全分化的多能干细胞。此外,同种异体的免疫识别的影响ESC-derived dap需要审查。前临床研究使用胎儿腹侧中脑组织,由林德瓦尔等人开创·林德沃和Kokaia [18,19),表明allograft-induced免疫反应可能会影响最优移植物功能,甚至可能伴随着一些副作用20.- - - - - -24]。在这方面,则是有利的,因为他们可以使用自体移植(25- - - - - -27]。施韦策等人已经测试了iPSC-derived PD患者自体衣冠楚楚,和症状稳定或提高植入[18到24个月后28]。相比之下,多能干细胞(ESCs和万能),iNSCs保留一个内在属性相似的组织干细胞,因此被认为造成更少的肿瘤发生的风险。的确,iNSCs直接移植到免疫缺陷小鼠的大脑不能导致肿瘤形成(7]。iNSCs可作为自体移植细胞则一样,通常需要一个相对短的时间内重新编程和特定的分化7]。iNSCs也能避免伦理、后勤和异构性问题与胎儿大脑组织(29日- - - - - -33]。
之前iNSCs和衍生品可以进行临床试验,移植研究利用非人灵长类动物将主要信息,揭示这些细胞的安全性和有效性34]。然而,缺乏一个好的标志可以区分人类和猴子细胞。为了解决这个问题,我们在特定的基因组locus-AAVS1插入GFP。敲入的GFP AAVS1并不影响iNSCs的基本特性,如增殖和分化能力。在移植,移植细胞可以很容易被认出来的绿色荧光。尽管作为一个异种移植,移植后人类iNSCs显示强劲的生还的运动皮层的猴子。没有观察到肿瘤形成iNSCs移植后3个月,建议一个好的临床潜力。有趣的是,iNSCs似乎能够应对当地的成人大脑环境并分化成神经元形态类似于锥体神经元。有趣的调查iNSCs是否能自动对不同疾病状况做出反应,如脑损伤、中风、癫痫,并相应地细胞分化成相关功能;未来的研究是必要的回答这个问题。
iNSC-derived DA前驱细胞存活在纹状体和SN和可能进一步成长为DA神经元位点。重要的是,这些DA神经元神经突延长他们到附近的空间,这是类似于移植后观察胎儿腹侧中脑组织成PD患者的纹状体(20.,35]。GFP-positive DA神经元的神经突SN也扩展,和神经突的方向似乎是随机的,没有特别指向目标area-striatum自然。结果表明,成年人的大脑可能缺乏分子线索可以指导嫁接DA细胞的轴突生长的SN向一个方向向纹状体。
iNSC-derived运动神经元前体细胞也可能生存和成长为运动神经元移植到大鼠脊髓后,显示一个潜在的治疗脊髓疾病使用。然而,生存似乎不如iNSC-MNPs道大鼠脊髓的iNSC-DAPs猴纹状体。确切的原因还不清楚。这可能是由于内在的区别iNSC-MNPs iNSC-DAPs;也可能归因于不同程度的免疫反应在大脑和脊髓或猴子和老鼠。使用严格的平行控制未来的研究需要解决这个问题。
5。结论
iNSCs重组从人类PBMNCs可以分化成不同的神经前体细胞,它能够生存和成熟后移植到各种领域的非人类灵长类动物的中枢神经系统和老鼠。iNSCs可能提供一个潜在的治疗神经系统疾病的细胞来源。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
实验过程涉及在本研究通过大鼠动物实验伦理审查在首都医科大学宣武医院(批准文号xw - 20210423 - 2)。灵长类动物被安置在云南灵长类生物医学研究的重点实验室(LPBR)。所有动物程序后进行评估和认证实验动物保健协会国际(AAALAC)善待灵长类动物。
的利益冲突
所有作者声称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Mengjia李和Zhengbo王同样贡献了这项工作。
确认
干细胞和翻译这项工作得到了国家重点项目(2016 yfa0101403),中国国家自然科学基金(82171250和82171250),北京市自然科学基金(5142005)、北京(2017000021223 td03)人才基础,支持项目的高层在北京市高校教师13五年计划时期(CIT和TCD20180333),北京市卫生委员会基金(PXM2020_026283_000005),北京一百,千,一万人才基金(2018 a03),皇家Society-Newton先进奖学金(NA150482)。
补充材料
补充图1:GFP基因敲入AAVS1轨迹。补充图2:iNSCs移植的安全性和特定分化iNSC-DAPs的运动皮层和纹状体在非人类灵长类动物的大脑。表S1:引物中存在的实验中使用。表S2:所有用于免疫荧光抗体染色实验。(补充材料)