文摘

运动神经元(MNs)来源于人为多能干细胞(hiPSC)拥有巨大的潜力为各种运动神经退行性疾病的治疗移植排斥的低风险成为可能。有许多hiPSC差异化协议追求模仿运动神经发生的多步过程在活的有机体内。然而,这些经常使用病毒载体,馈线细胞,或抗生素产生hiPSC MNs,限制他们的转化潜力。在这项研究中,一个病毒,给料机,和不需抗生素的方法被用于重组hiPSC,维持在培养基生产临床良好生产规范。差异化与标准化执行MNs,化学定义和不需抗生素的培养基。hiPSC的身份、神经祖细胞和成熟的MNs不断验证的特定标记在基因和蛋白质水平的检测通过存在、流式细胞术、免疫印迹和免疫荧光。MNX1——ChAT-positive motoneuronal祖细胞形成后神经感应通过dual-SMAD抑制和扩张。成熟,成熟的方法旨在直接相比,这些祖细胞的方法,其中包括一个额外的分化一步进一步规范。虽然这两种方法生成成熟的MNs postmitotic标记表达特点,直接成熟方法似乎更有效。这些结果提供新的见解两种标准化分化的方法是否适合生成成熟的MNs,这可能为未来的临床应用铺平了道路。

1。介绍

人类多能干细胞再生医学(hiPSC)是非常重要的,作为一个可以生成各种各样的细胞类型,避免争议讨论使用胚胎干细胞(ESC)。移植免疫排斥反应的低风险与自体hiPSC-derived细胞成为可能。此外,重组细胞病变个人hiPSC允许pathomechanisms的分析,例如,阿尔茨海默病的调查并设置为特定的药物发现。与patient-derived hiPSC,它可能很快就可以预测病人的个人回应还治疗(1]。

目前,没有适当的治疗可用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS),一种神经肌肉疾病,运动神经元的变性(MNs)发生。更换这些退化的MNs将理想的治疗ALS的还有其他疾病涉及退化、MNs功能失调,或失踪。hiPSC是一种很有前途的工具,运动神经元(MN)的一代,也表现出MN微分潜在ESC相比。临床应用,人类成熟和功能的一代MNs需要负责确保质量和再现性和最小使用异种的材料(2]。因此,hiPSC归纳方法的选择是一个关键因素。现有的MN差异化协议的使用,例如,genomic-integrating lenti - [3)或逆转录病毒(4,5]hiPSC重组是可疑的,因为他们的潜在诱变(6]。其他协议执行,例如,nongenomic-integrating仙台病毒(7),但应用细胞或抗生素维持hiPSC,拥有一个没有完全调查影响hiPSC分化潜能(8]。此外,重组因子的选择和类型的细胞用于hiPSC重组是决定性的。重组因子如原癌基因,被称为致癌,需要更换等因素与类似的重组效率L-myc [9]。重新编程细胞的表观遗传记忆也被认为是会影响生成的分化潜能hiPSC [10]。hiPSC分化成MNs似乎仍然是一个挑战中没有定义微分媒体认证,准备使用质量,和postmitotic xeno-free hiPSC-derived MNs没有可买的在这个研究的开始。

各种hiPSC差异化协议旨在模拟运动神经发生在体外。比安奇et al。11),例如,追求一个三步差异化策略来生成功能MNs,开始通过抑制神经感应BMP和TGFβ/苯丙酸诺龙/节点路径(dual-SMAD抑制)其次是MN分化通过,即。维甲酸(RA)和声波刺猬(嘘)接触,和随后的MN成熟。馈线细胞的使用限制这种区分协议在再生医学的实施。类似三步序列用于干细胞的技术协议(加拿大温哥华)应用标准化,定义,和不需抗生素的培养基为神经诱导分化和成熟。有趣的是,之前的研究表明,神经元与尾位置的身份可以通过抑制TGF生成β/苯丙酸诺龙/ Nodal-signalling,电生理能力的获得进一步的培养(12,13]。这可能是通过STEMDiff™SMADi神经感应设备和随后的成熟。

本研究旨在比较这两步直接成熟方法,命名方法,三步协议,命名方法B的效率从hiPSC生成成熟的MNs。方法临床应用的要求,适应重组鸡尾酒和病毒、馈线和footprint-free方法被用于hiPSC一代。血清,不需抗生素的培养基生产下临床良好生产规范(cGMP)维护hiPSC申请。进一步分化过程中,化学定义和标准化文化媒体被用来确保一个健壮的和可再生的协议。差异在形态、基因和蛋白质水平进行调查,这可能提供新的见解更有效的分化方法,方法在再生医学中的应用。

2。材料和方法

2.1。代hiPSC通过Nucleotransfection人类新生儿的皮肤成纤维细胞

人类新生儿皮肤成纤维细胞(hPDF)(写明ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在纤维母细胞生长培养kit low血清(女性生殖器切割)(写明ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),直到最大通道3根据制造商的协议。0天,游离nucleotransfection三质粒编码重组因子和一个质粒编码绿色荧光蛋白(GFP)(见补充方法1和2)控制(Addgene水城,马萨诸塞州,美国)与执行Amaxa®Nucleofactor第二设备(Lonza、巴塞尔、瑞士)由于制造商的指示。简单地说, hPDFs转染有1μg的DNA的四个质粒(共4μg DNA)。转染控制,2μ克pmaxGFP®向量(Lonza、巴塞尔、瑞士)被引入细胞根据制造商的指示。改变了媒体在第一天后,转染细胞被蔡司LSM 710共焦显微镜(蔡司、从、德国)。2天,细胞通过通过与PBS洗一次,添加Gibco®胰蛋白酶0.05% edta(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)和孵化为5分钟37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。通过添加介质Trypsination停止了。细胞离心5分钟 和镀1:6。4天,细胞通过所述镀前和在康宁®基底膜基质®预镀盘子。维持hiPSC,细胞培养30天在mTeSR™1 (cGMP下产生干细胞技术,温哥华,加拿大)中改变每隔一天。使执行与温柔细胞分离试剂(GCDR, cGMP下产生干细胞技术,温哥华,加拿大)每隔5 - 7天。总之,细胞被洗一次PBS和孵化与GCDR 10分钟。上层清液取出mTeSR™1补充10μy - 27632(干细胞技术,加拿大温哥华)补充道。hiPSC被冲洗收集在一个循环模式,并镀1:4康宁®基底膜基质®预镀盘子。的身份证实了hiPSC碱性磷酸酶染色,免疫荧光和基因表达分析(见补充方法3 - 6)。

2.2。hiPSC分化成神经祖细胞(人大)

神经诱导,hiPSC对待STEMDiff™SMADi神经感应设备(干技术,加拿大温哥华)21天与媒介变化每隔一天和通道STEMDiff™神经玫瑰选择试剂(干细胞技术,加拿大温哥华)每隔5 - 7天到预镀poly-L-ornithine /层粘连蛋白板块(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。神经祖细胞的扩张阶段发起了STEMDiff™神经祖介质(NPM、干细胞技术,温哥华,加拿大)中改变每隔一天。StemPro™Accutase™细胞分离试剂(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)被用于使细胞孵化为5分钟37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂并使离心5分钟 。细胞被维护在NPM 21天。 派生的人大都是低温贮藏1毫升STEMDiff™神经祖冷冻剂(干细胞技术,加拿大温哥华)和存储在-150°C。

2.3。两个不同的程序来区分人大

方法,人大培养在STEMDiff™神经元成熟的媒介(干细胞技术,加拿大温哥华)28天的变迁中每隔一天。

方法B首次接受STEMDiff™神经元分化培养基为7天每天介质变化。细胞被暴露于STEMDiff™神经元成熟的媒介(干细胞技术,加拿大温哥华)21天的变迁中每隔一天。

2.4。不同的神经元集群被IncuCyte®

500000镀方法A和B细胞在poly-L-ornithine /层粘连蛋白预镀6-well盘子。观察能力的差异形成的神经元网络,被放置在盘子IncuCyte®S3系统(缝匠肌、哥廷根、德国)。细胞成像一天两次的28天。实验进行了一式三份。

2.5。测试表达式的神经原纤维

神经原纤维染色的Bielschowsky (Bio-Optica、米兰、意大利),全国人大和细胞分化方法A和B的28天被播种到poly-L-ornithine /层粘连蛋白(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)预镀Nunc™Lab-Tek™II室幻灯片™(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),固定为4% w / v PFA在PBS孵化20分钟在4°C和PBS洗两次。根据制造商的协议,幻灯片和超纯水洗两次,与10滴试剂孵化15分钟40°C。与超纯水洗两次后,添加了10滴试剂B孵化后的20分钟50°C。上层清液被丢弃,下滑是减少处理解决方案(20滴剂C, 8滴每个试剂D, E, F在50毫升超纯水)为2分钟。细胞用超纯水清洗两次,随后孵化10滴剂G为3分钟。脱水前滑与升乙醇浓度和治疗两次二甲苯(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),它是用超纯水清洗两次。最后,下滑是嵌入在Entellan Neu(默克公司,达姆施塔特,德国)孵化后30分钟在室温下晾干。彩色的神经元结构应用Eclipse TS100尼康显微镜成像(尼康、Minato、日本)。

2.6。流仪分析神经元标记来确定分化状态

fluorogenic染色、250000名人大和方法A和B细胞分化为28天在300年被仔细resuspending固定μL 4%的w / v PFA在PBS和孵化20分钟在4°C。随后,1毫升烫解决方案(0、1% v / v Triton x - 100和0 3% w / v枸橼酸二氢钠((Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在超纯水)和细胞离心液添加了5分钟 。上层清液都被丢弃而透化作用于300年由仔细的再悬浮μL烫解决方案在4°C和孵化2分钟。细胞颗粒状(5分钟 ),resuspended在45μL流式细胞仪解决方案(PBS v / v的边后卫为2%),并随后沾以下标签抗体通过孵化30分钟没有光线:巢蛋白PerCP-Cy™5.5 (5μ美国,正欲L,富兰克林湖),ChAT-APC (5μ500 L(1:流式细胞仪解决方案,abcam, Cambrigde,英国),DAPI (5μ1000 L(1:流式细胞仪解决方案,Biolegend,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。无污点的细胞和染色细胞的抗体后荧光同形像被作为控制:PerCP-Cy™5.5 (5μ美国,正欲L,富兰克林湖),免疫球蛋白APC (5μ500 L(1:流式细胞仪解决方案,abcam Cambrigde、英国)。洗后与300年的三倍μL流式细胞仪解决方案,分析了10000个细胞使用Amnis®ImageStream®^XMk II仪器与ISX软件(美国奥斯汀Luminex公司)。实验进行了三次独立数据处理和面对的想法®软件(美国奥斯汀Luminex公司)。

2.7。免疫荧光

固定,细胞培养poly-L-ornithine /层粘连蛋白预镀Nunc™Lab-Tek™II室幻灯片™洗两次与PBS和孵化了4% w / v PFA在PBS 20分钟在4°C。幻灯片与洗水洗三次缓冲区(Biozol、决定、德国)2分钟温柔颤抖。透化作用是由孵化与烫5分钟解决方案在4°C。三次洗涤后2分钟,细胞被封锁了30分钟使用无血清蛋白质块(安捷伦,圣克拉拉,加州,美国)。后主要抗体稀释在背景减少抗体稀释剂(安捷伦,圣克拉拉,加州,美国):兔子Anti-Peripherin (ab4666 abcam,剑桥,英国)1:1000年,兔子Anti-NF-H (ab8135 abcam,剑桥,英国)1:2000年,兔子Anti-Synapsin 1 (LS-C117933寿命生物科学,西雅图,华盛顿,美国)1:500年,兔子Anti-Pax6 (HPA030775 Atlas抗体,斯德哥尔摩,瑞典)1:500年,兔子Anti-ChAT (ab223346 abcam,剑桥,英国)1:100年,兔子Anti-MNX1 (LS-C148679寿命生物科学,西雅图,华盛顿,美国)1:200年,重组兔子Anti-Islet 1 (ab109517 abcam,剑桥,英国)1:250年,鼠标Anti-beta微管蛋白3 (GTX27751 Genetex,欧文,加利福尼亚,美国)1:1000年,兔子Anti-Nestin (HPA007007 Atlas抗体,斯德哥尔摩,瑞典)1:1000年,和鼠标Anti-NeuN (GTX30773 Genetex,欧文,加利福尼亚,美国)1:100。细胞与稀释孵化主要抗体在一夜之间在4°C温柔的颤抖。洗涤三次2分钟后,添加了以下二次抗体和孵化90分钟排除光:山羊Anti-Rabbit IgG抗体(H + L) Dylight®488,山羊Anti-Mouse IgG抗体(H + L) Dylight®594(美国加州向量实验室,伯林盖姆)两个1:800和DAPI(美国加州圣地亚哥422801年,Biolegend) 1: 75000年核酸染色。幻灯片与超纯水洗四次为2分钟,随后安装在延长®不变色(由热费希尔科学表达载体,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),蔡司显微镜下检查LSM 710共焦显微镜(蔡司、从、德国)。

2.8。免疫印迹

免疫印迹分析使用的方法是基于协议最近发表的角等。14),进行了如下。人大和细胞分化方法A和B为28天,培养在6-well盘子,洗一次了PBS (Gibco,热费舍尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),分离通过孵化StemPro™Accutase™细胞分离试剂(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)为5分钟37°C调湿大气中含有5%的股份有限公司₂和离心5分钟 。 每个400年resuspended细胞类型的细胞μL Tris-EDTA-Triton x - 100提取缓冲(2.5毫米12.5毫米6.25毫米三、氯化钠、EDTA、1.5% Triton x - 100,一个完整的微型抑制剂鸡尾酒(瑞士巴塞尔罗氏公司)和一个PhosSTOP(罗氏、巴塞尔、瑞士)10毫升超纯水)和孵化在冰了15分钟。细胞被破坏了使用超声波匀浆器(Bandelin电子,柏林,德国)脉冲三次十年代,0.3区间,和30%的强度,冰1 h后孵化,涡流每15分钟。细胞碎片被使离心10分钟 在4°C。上层清液被转移到0.5毫升蛋白质LoBind®管(股份公司、德国汉堡)和保存在冰蛋白质含量测定用量子位™蛋白质化验设备量子位4荧光计(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)根据制造商的指示。细胞溶解产物被整除为单位的15μL和存储在-20°C。蛋白质变性是由混合细胞溶解产物包含40μg蛋白8μL加载缓冲区(60% v / v的4×蛋白质样品加载缓冲区(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯),和3.12% w / v德勤((Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在超纯水)和超纯水的总量25μL每5分钟的示例和随后的孵化95°C。分析Pax6和MNX1样品和3μL变色龙™双核Prestained蛋白质梯(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯)加载在NuPAGE™Bis-Tris凝胶4 - 12% 井与NuPAGE™MES SDS运行缓冲(Novex热费希尔科学,沃尔瑟姆,美国)。巢蛋白的分析,样品和7μL光谱™多色高范围内蛋白质梯(美国沃尔瑟姆热费希尔科学)加载到NuPAGE™3 - 8%醋酸三凝胶 井与NuPAGE™Tris-Acetate SDS运行缓冲(Novex热费希尔科学,沃尔瑟姆,美国)。凝胶电泳进行50分钟在200 V为60分钟(Pax6 MNX1)或150 V(巢蛋白)使用一个迷你凝胶坦克(由热费希尔科学表达载体,沃尔瑟姆,美国)。

蛋白质转移进行了使用iBlot™传输堆栈PVDF (0.2μ孔隙大小)与iBlot™2凝胶转移装置(热费希尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)Pax6和MNX1 7分钟(23 V, 1分钟20 V, 4分钟,2分钟25 V)和巢蛋白10分钟(2分钟20 V, 5分钟25 V, 3分钟25 V)。PVDF膜在超纯水清洗一次,重新激活用甲醇冲洗(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)与超纯水30年代和两次,在拦截,随后封锁了®(PBS)阻断缓冲区(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯)1 h和温和的颤抖。一夜之间,膜被孵化在4°C以下主要抗体稀释抗体稀释剂(拦截®(PBS)阻断缓冲区0.2% v / v渐变®20 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)):重组兔子Anti-MNX1 (ab79541 abcam,剑桥,英国)1:1000年,兔子Anti-Nestin (HPA007007, Atlas抗体,斯德哥尔摩,瑞典)1:1000年,和纯化小鼠Anti-Pax6 (ma1 - 109热费舍尔,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)1:1000。随后,10分钟的膜清洗两次洗涤缓冲0.1% (v / v PBS的渐变®20)。二级抗体孵化进行90分钟下光排斥IRDye®800 cw山羊Anti-Mouse IRDye®800 cw山羊Anti-Rabbit(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯)1:8000年的抗体稀释剂。膜又洗了两次10分钟洗涤缓冲和用超纯水清洗两次。正常化的辅助蛋白质glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),主要的抗体重组兔子Anti-GAPDH(美国加州ab181602 abcam,欧文)1:10000年抗体稀释剂添加和检测到二次抗体山羊anti-Rabbit IRDye®680(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯)1:8000年的抗体稀释剂。独立实验进行了三次。

成像的屁股,奥德赛CLx(美国内布拉斯加州LI-COR生物科学,林肯)成像系统使用。Densiometric分析Empiria Studio®软件2.2版(https://www.licor.com/bio/empiria-studio/resources)。分析每个复制样品进行免疫印迹正常化后的数据。结果说明软件RStudio(版本4.0.3 (2020-10-10),RStudio Inc .,波士顿,美国)。

2.9。基因表达分析

这里使用基因表达分析的方法是基于先前描述的协议由角等。14),进行如下。人大和方法A和B细胞分化为28天洗一次PBS和获得通过使用细胞刮刀(格林尼AG)、Kremsmunster、奥地利)直接成RNA后(试剂盒、希尔登,德国)。RNA提取是根据制造商的说明进行使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。短暂,RNA后丢弃,细胞与600年在重复的再悬浮细胞溶解μL缓冲RLT。细胞溶解产物被转移到一家QIAshredder旋转列(试剂盒、希尔登,德国)和离心机为2分钟 。洗出液混合着600年μL 70%的乙醇。700年μL的混合物用移液器吸取到30年代的列和离心机旋转 。洗出液被丢弃,列是洗了三次。一旦有700μL缓冲区RW1(30秒, )并与500年两次μL缓冲区RPE(2分钟, )。干的列,离心机 为1分钟。RNA与30筛选了μL核酸酶游离水(试剂盒、希尔登,德国)旋转1分钟 在一个Biopur®1.5毫升管(股份公司、德国汉堡)。

NanoQuant板块™与板块的读者无限M200 Pro (Tecan集团、Mannedorf、瑞士)是用于RNA浓度测定。互补脱氧核糖核酸合成的RNA是设置为500 ng /存在板。互补脱氧核糖核酸合成与RT执行²第一个链工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。总之,对于消除基因组DNA, 2μL(缓冲通用电气、RNA和核糖核酸酶游离水喜忧参半的总量10μL和孵化为5分钟42°C紧随其后在冰上冷却至少1分钟。10μL逆转录混合组成的4μL 5×缓冲BC3, 1μL控制P2, 2μL RE3逆转录酶混合,和3μL核糖核酸酶游离水被添加到混合基因组消除。反转录是由孵化为15分钟42°C,其次是孵化在95°C 5分钟停止的过程。的Mastercycler®nexus GX2(股份公司、德国汉堡)是用于所有孵化的步骤。91年μL核糖核酸酶游离水被添加到准备。互补脱氧核糖核酸混合存储在-20°C最多7天。

准备的检测混合和qPCR板块的移液,自由Evo自动化移液机控制EVOware™标准软件(Tecan集团、Mannedorf、瑞士)使用。最小化任何污染,建议洗集中7% v / v次氯酸钠(卡尔罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)之前和之后在超纯水和超纯水移液的步骤。根据制造商的指示,102年μL 1248年的互补脱氧核糖核酸混合稀释μL核糖核酸酶游离水,然后放置在自由Evo自动化移液机增加1350μL (2 x RT²SYBR®绿色火箭qPCR Mastermix(试剂盒、希尔登,德国)。混合物被温柔混合反演,以避免泡沫。25μ这种混合的L是用移液器吸取在每个下面的96 - RT²分析器™PCR数组:人类活动导致的多能干细胞,人类神经发生,人类神经递质受体,人类Neutrophins和受体,人类神经元离子通道,一个专门设计的板进行分析的基因参与motoneurogenesis(试剂盒、希尔登,德国)。每个板与光学薄壁8-Cap密封条(试剂盒、希尔登,德国)。存在分析与埃普多夫Mastercycler®epgradient realplex²与Mastercycler ep realplex软件(股份公司、汉堡、德国)通过激活聚合酶10分钟在95°C,紧随其后的是40的循环在95°C和1分钟15秒60°C。每次运行后,阈值调整到200年,漂移校正是支持更好的比较。所有独立实验重复三次。

进行数据分析,值是出口到GeneGlobe (http://www.qiagen.com/geneglobe)使用C_T截止的35岁RPLP0看家基因正常化,规定截止2.0,折起来截止值为0.05。的计算值是基于一个未配对的学生 - - - - - -测试。软件RStudio(版本4.0.3(2020-10-10))用于图示(美国波士顿RStudio Inc .)。

3所示。结果

3.1。身份生成hiPSC和有区别的人大

验证成功hPDF nucleotransfection多能性诱导因素,GFP信号检测转染后一天(补充图1(一))。培养一段30天mTeSR™1,明确hiPSC克隆不同的和紧凑的形态从转染单细胞hPDF(补充图1 (b))。如补充图所示2(一个),hiPSC显示染色呈阳性的碱性磷酸酶活性和多能性标记,如TRA-1-60 Oct3/4, Nanog [15(补充数据2 (b)和2 (c))。此外,hiPSC能够分化成三个生殖细胞形态类似于细胞层(补充图1 (c))。多能性基因编码,例如,GDF3, FGF4, DNMT3B, TDGF1, Nanog显著调节相比hPDF(褶皱 ; ),这说明了成功重组hiPSC(补充图吗3)[16]。

后21天dual-SMAD信号的抑制,人大接受神经形成莲座状(图1(一))相比,他们hiPSC-origin细胞基因表达分析。重大发现upregulation基因早期运动神经发生,例如,Pax6, FABP7 Sox2和Tubb3(褶皱 ; )(图1 (b))[17,18]。相比之下,等多能性基因编码节点,DPPA3, TBX3显著下调(褶皱 结合 )。

3.2。形态模式的两种分化的方法

28天人大分化的方案直接成熟,方法,和分化前一步,方法B,如图2(一个)。分析了IncuCyte®,这两种方法产生分支网络MN-type集群后28天的分化与人大(图2(b))。这些集群被确认为神经网络Bielschowsky银染色(图2(c))和疣状神经元标记Tubb3(图2(d))。方法B比方法一个密集的细丝,Tubb3染色中尤其明显。

3.3。通过中存在神经元基因表达的变化检测

进一步描述神经元来自28天分化通过方法A和B,运动神经发生的各种基因的表达特征(19),神经元离子通道(20.神经营养因子),(21),和神经递质22)确定。如图3细胞中,基因显著差异表达的A和B两种方法相比,全国人大(褶皱 在结合和≤-2.0 )。

在方法,一些基因选择性表达下调,包括性别决定区域Y盒2 (Sox2;-4.71),神经丝蛋白巢蛋白(NES;-4.83),转录因子Neurogenin 1 (NEUROG1;-10.62),和他的家人BHLH转录因子1 (HES1;-2.43),涉及神经祖细胞的命运23,24]。基因编码离子通道就像压敏电阻器钙通道Gamma-4亚基(CACNG4;-5.38),电压门控钠通道α亚基3 (SCN3A;-8.52)和谷氨酸受体Ionotropic Kainate类型单元2 (GRIK2;-5.83)和亚基4 (GRIK4;-7.82)也发现表达下调。其他基因在神经发生和神经传递,例如,‘诺金’(支架;2.86),生成3 (NTF3;6.53),神经生长因子(神经生长因子;4.75),溶质载体家庭16个成员7 (SLC16A7; 3.45), and Cholinergic Receptor Nicotinic Alpha Subunit 7 (CHRNA7; 2.29) were found selectively upregulated.

相比之下,一些基因在神经传递包括脑衍生神经营养因子(BDNF);-2.33),胆碱能受体,毒蕈碱的2 (CHRM2;-5.72),γ-氨基丁酸型受体亚基α5 (GABRA5;-4.61),电压门控钾通道亚H成员2 (KCNH2;-8.13),doublecortin(克莱斯勒;-9.46),一个基因参与神经元迁移,在方法b .其他有选择地表达下调基因与神经传递,如5 -羟色胺2 a受体(HRT2A;6.93),整流钾通道亚J,成员3 (KCNJ3;10.98)和谷氨酸受体Ionotropic Kainate类型亚基1 (GRIK1;2.99)被发现有选择地调节。此外,增加表达的基因编码,例如,纤维母细胞生长因子1 (FGF1; 31.60), POU Class 4 Homeobox 1 (POU4F1; 6.32), Paired Box Gene 3 (PAX3; 3.37), and S100 Calcium Binding Protein B (S100B; 19.27) was observed.

关于这两种方法A和B,尤其是基因编码motoneuronal蛋白质如运动神经元和胰腺同源框1 (MNX1;/ 86.42;B / 12.95)和胰岛素基因增强蛋白Islet-1 (ISL1;/ 17.94;B / 30.59)以及基因编码谷氨酸Ionotropic AMPA受体亚基类型2 (GRIA2;/ 6.48;B / 7.62),骨形成蛋白2 (BMP2;/ 5.20;B / 5.63),电压门控钾通道亚H成员1 (KCNH1;/ 8.38; B/15.49), and Adrenoceptor Alpha 1A (ADRA1A; A/10.87; B/25.25) were upregulated.

早期分化标记配对盒6 (PAX6;/ -13.07;B / -8.72)是在这两种方法表达下调与突触传递相关的基因如酪氨酸羟化酶(TH;/ -46.90;B / -8.42),胆碱O-Acetyltransferase(聊天;/ -12.91;18 B / -24.36),溶质载体家族成员A3 (SCL18A3 / VAChT;/ -8.43;17 B / -14.69),溶质载体家庭成员6 (SLC17A6 / VGLUT2;/ -20.77; B/-7.84), and GDNF Family Receptor Alpha 2 (GFRA2; A/-116.43; B/-2.78). Furthermore, genes involved in neuronal differentiation and migration like Achaete-Scute Family, BHLH Transcription Factor 1 (ASCL1; A/-5.78; B/-8.59), Dopamine Receptor D2 (DRD2; A/-22.98; B/-16.40), and C-X-C Motif Chemokine Ligand 1 (CXCL1; A/-20.82; B/-21.23) as well as genes regulating Notch signalling such as Hes Related Family BHLH Transcription Factor With YRPW Motif Like (HEYL; A/-5.38; B/-4.00) and WNT signalling e.g., SHH (A/-23.39; B/-14.83) were less expressed in both approaches.

当比较基因表达的细胞分化与方法为28天细胞分化方法B为28天,只有S100B (A / -8.99; ),MNX1 (A / 6.67; ),和GFRA2(一个/ -12.33; )显著差异表达在细胞的方法。

3.4。早期分化标记Pax6和巢蛋白的表达

评估A和B两种方法是否能够生成成熟神经元的分化后28天,早期的表达水平神经元分化标记Pax6和巢蛋白相比,人大决定。巢蛋白是描述只是表示在未提交全国人大和Pax6人大的生成和维护是至关重要的,都需要表达下调,允许motoneuronal成熟(25,26]。Pax6被发现表达下调,在mRNA水平(A / -13.07;B / -8.72; )(图4(b))和蛋白质水平(A / ;B / )(图4(c))。核染色Pax6只是观察到人大但不是在A和B细胞的方法(图4(一)),从而确认的结果中存在和免疫印迹。

巢蛋白表达在人大和细胞两种方法检测免疫荧光(图28天的区别4(d))。在流式细胞术,除了全国人口的92.5%,88.3%的细胞的方法和80.5%的方法B显示Nestin-positive信号后28天的区别(图4(e))。从人大方法A和B是差异化,积极发现NPC的数量作为阈值方法A和B,这表明这两种方法的差别巢蛋白对这些检测方法阳性细胞58.1%,42.4%的阳性细胞方法B而积极的人大为92.5%。每种方法的阳性细胞获得的图像显示在流程流。检测到免疫印迹,巢蛋白表达下调两种方法(A / ;B / )后28天的区别(图4(f))。这些结果证实质量生成的人大和建议的成功分化方法a和B向成熟的神经元。

3.5。的表达Motoneuronal MNX1标志

验证代motoneuronal种群在28天的分化方法,MNX1的表达,postmitotic脊髓MNs的早期标志蛋白(27),考察了。通过免疫荧光,MNX1检测到细胞核的所有三种方法(图5(a))。这些发现证实了免疫印迹结果(图5(c))揭示人大之间没有差异蛋白表达和细胞两种方法(A / ;B / )。相比之下,细胞内存在分析显示upregulation MNX1 A和B两种方法相比,人大(A / 86.42;B / 12.95; )(图5(b))。此外,MNX1显著高表达(6.67倍 )细胞的方法相比,细胞的方法。这些结果表明,motoneuronal前体细胞也存在于神经元的分化阶段早期NPC和表明,嘘,RA-signalling在dual-SMAD抑制通路被激活。

3.6。Postmitotic Motoneuronal标记和Islet-1聊天

验证这两个微分方法的效率产生成熟的MNs, A和B细胞分化的方法检测了28天postmitotic motoneuronal标记聊天和Islet-1 (ISL1)相比,人大。通过免疫荧光法和流式细胞术,所有的方法都是积极聊天(图的染色6(一)),一种酶催化合成神经递质乙酰胆碱的特别发现胆碱能神经元的MNs的脊髓3]。A和B细胞图像的方法,在流流,显示更高ChAT-APC (Allophycocyanin)染色强度相比,人大,表明只有A和B细胞的方法应该被认为是积极的。因此,71.5%的B方法和65.6%的方法检测到阳性ChAT-APC人大(图中比例为15.9%6(b))。

ISL1转录因子,是人类必不可少的一代的成熟和功能异常(3),被发现在A和B细胞方法的核但不是在人大被免疫荧光(图6(c))。在存在,ISL1也显著调节两种方法(A / 17.94;B / 30.59; )相比于人大,证实这两种方法的适用性形成成熟的MNs(图6(d))。

3.7。神经元蛋白质必不可少的突触传递

测试如果A和B两种方法表达与成熟相关的蛋白质MNs 28天后和神经功能的分化,出现Synapsin我(Syn I) Peripherin,神经丝沉重的多肽(Smi-32)被免疫荧光检查。Syn我属于synapsins磷蛋白质家族,在神经突结果起到关键作用,形成突触,突触传递28),是成熟的神经元的特征标记(29日]。阳性染色Syn我puncta的形式,这是假定突触囊泡,被发现在A和B的方法,但不是在人大(图7()),指示成熟度和假设分化细胞的电生理活动的两种方法30.]。Peripherin表达在神经元的脊髓31日),被认为是参与神经突伸长期间神经发展(32]。Immunofluorescent结果显示Peripherin-positive神经细丝在A和B的方法(图7(b))。类型III神经丝蛋白,功能Peripherin附属于postmitotic标记Smi-32形成纤维网络(33]。如图7(c)、核和轴突的积极方法A和B是彩色Smi-32表明功能网络生成。

4所示。讨论

这项研究提供了一些见解的潜力使用标准化的A和B两种分化的方法,化学定义和即食文化媒体从foodprint生成成熟的MNs, integration-free hiPSC派生而来。分化方法避免使用抗生素或馈线细胞,因此派生的MNs可能有潜力实现的运动神经退行性疾病的治疗。自hiPSC分化成MNs是一个多级的过程包括人大的形成,这些生成的标识和描述人大是至关重要的。

从hiPSC人大成功分化无血清条件下,早期表达神经元分化标记如巢蛋白、Sox2, Pax6, FABP7, Tubb3评估中存在,免疫印迹、免疫细胞化学、流式细胞术(34]。巢蛋白,第六类中间丝蛋白和Sox2是典型的蛋白质发生在国家安全委员会(35]。表达水平的Pax6、FABP7 Tubb3增加发展中脊髓和早期诱导分化MNs [18]。特别是Pax6在模式中起着关键作用neuroectoderm细胞腹侧脊髓祖细胞(36]。MNX1,有趣的是,一个特定的标志和postmitotic MNs [37)和描述为表达发展中脊髓(38),在人大发现表明是可以生成人大dual-SMAD抑制后脊髓的命运。约旦et al。37)在治疗后观察MNX1表达式bFGF,著名的NSC诱导增殖和可能是一个补充的标准化人大扩张中使用。令人惊讶的是,聊天发现在低水平在全国人大通过流式细胞仪和免疫荧光。这也证实了神经对MNs转换,也可能是相关生长因子作为Nistor et al。39)发现了一个数量的增加ChAT-expressing NPC治疗后bFGF和FGF8。

成熟的MNs既实现了通过分化Pax6和巢蛋白差别方法A和b对这些描述MN成熟过程中(25,40),观察两种方法,如存在的结果所示,免疫印迹、免疫荧光和流式细胞术。关于锰的形态,MNs[评价的一个标志41),A和B的方法可以区分他们的成熟度水平。MN成熟形态与扩展有关长期预测(3[]和复杂性的增加神经突结果42]。虽然这是证实这两种方法的IncuCyte®和Tubb3特异性神经元染色法,该方法显示神经纤维密度较低,没那么强烈的布朗Bielschowsky染色方法B相比可以较低的成熟程度的一项指标。

关于表达谱,这两种方法在不同方面的神经营养蛋白(如GFRA2, BDNF, NTF3 FGF1)。这些参与神经元生存的规定,轴突产物,修剪树突和突触可塑性(43,44),因此负责神经元功能的开发和维护。在产后脊髓MNs [GFRA2是表达下调43),减少GFRA2表达式表明成功的MN成熟。此外,MN存活率降低被发现与BDNF, NTF3, NTF4 [43]。BDNF表达下调是在方法B和NTF3调节的方法,这可能表明,生成的MNs方法具有更高的鲁棒性。调查NTF4表达水平需要澄清。关于生成FGF1 Renaud et al。44描述,增加表达水平可以在MNs,达到最大的成人神经组织。FGF1是选择性地调节方法B,这可能会证实方法B更成熟。另一种蛋白质参与神经元可塑性和S100b长期势差。它可以防止MNs[发育细胞死亡45)和被发现调节方法b。这些发现把假设的方法可能更健壮。

蛋白质基本特征的识别postmitotic和功能性MNs MNX1, ISL1,和聊天46]。MNX1(也称为Hb9)促进MNs的规范,被认为是较低的MNs的标志(47,48]。神经元获得通过的方法显示增加MNX1 mRNA水平方法B相比,表明更高数量的降低MNs生成。调查MNX1蛋白水平揭示这两种方法之间没有显著差异,这关系到这个假设。在进一步MN-specification, MNX1的表达决定了LIM homeodomain转录因子的表达在postmitotic ISL1 MNs [49]。ISL1是第一批motoneuronal基因表达postmitotic MNs和规范中起着关键作用的功能性MNs参与神经递质表达和MN迁移(3,50]。ISL1基因和蛋白表达在这两种方法显著增加,证实了一代的假定的功能异常。此外,ISL1 VAChT等调节胆碱能的基因的表达,和聊天51]。聊天是至关重要的神经递质乙酰胆碱的合成,有选择地表达MNs的脊髓3]。一些研究发现,ChAT-positive神经元具有电生理活动(27,46,52- - - - - -54]。在蛋白质水平,聊天中发现这两种方法通过流式细胞术和免疫组织化学。相比之下,聊天的基因表达水平降低了这两种方法,这可能是由于转录后的调控在成熟的过程55]。这些发现也观察到在老鼠Corsetti et al。53]。作为上层MNs聊天并不表示,这可能意味着成功的人大分化为成熟和功能降低MNs [52,56]。

基因编码神经元离子通道在调节方法A和B可以考虑成熟神经元的功能分类57]。电压门控钾通道Kv10.1 KCNH1、编码,与神经递质释放和突触传递的MNs [58,59]。ADRA1A、编码对肾上腺素能受体,GRIA2编码谷氨酸ionotropic受体,参与神经递质释放儿茶酚胺和谷氨酸和维护功能MNs至关重要60,61年]。KCNH1表达的增加,ADRA1A GRIA2两种方法显示成功成熟由减少进一步强调表达SLC17A6和DRD2基因编码的61年,62年]。Smi-32进一步与神经电生理活动相关的蛋白质,Peripherin, Syn i的表达Smi-32特定的MNs脊髓和被发现在细胞质和树突的两种方法(3]。支撑结构和运输的主要功能是营养神经丝Smi-32。Smi-32 Peripherin, III型中间丝蛋白出现在MN的发展过程中,在功能上是相互依存的,保证正常传导速度(31日,33]。因此,这两个蛋白功能异常的形成至关重要。分散在树突突触puncta特性的检测Syn我组织化学染色,突触囊泡蛋白参与突触形成和突触传递(28,63年]。Syn我成熟神经元的选择性表达,发现增加诱发突触电流的振幅(28]。因此,检测Smi-32 Peripherin, Syn我证实了成熟和显示功能活动的两种方法33,64年,65年]。

澄清如果生成的MNs拥有功能,不仅调查使用电生理活动,例如,膜片钳或multielectrode-array系统还需要执行但coculture实验与骨骼肌细胞需要适当的突触和神经肌肉信号提供的上下文27]。考虑motoneuronal变性疾病的治疗,Trawczynski et al。2)表明,特别有前景的结果是通过移植MN前体细胞形成适当的突触相比,表现出更好的功能恢复postmitotic MNs。通过使用xeno-free矩阵,本文提供的方法生成MN前体细胞再生医学的组成一个有前途的工具。在未来,这将是有趣的,分化MNX1-positive motoneuronal前体细胞,调查他们的能够分化成成熟和功能的异常在活的有机体内。

5。结论

这项研究表明MNX1——ChAT-positive锰前驱可以区分从集成,馈线,血清,和不需抗生素hiPSC生成dual-SMAD抑制和随后的扩张。派生的MN前体细胞形成成熟和假定的功能性MNs化学定义应用程序后,标准化和不需抗生素的培养基。hiPSC质量、MN前体和成熟的MNs被不断证实的形态、蛋白质、和基因表达,确保一个健壮的和可再生的协议。比较A和B的分化方法揭示MNX1基因表达显著差异。因此,这种方法似乎是一个更有效的分化方法,可能为临床课程翻译如果hiPSC生成和分化的整个过程,包括所有文化媒体和矩阵使用,符合cGMP要求。

数据可用性

数据可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由德国国防部。

补充材料

补充图1:代hiPSC hPDF。补充图2:表达多能性相关的标记。补充图3:基因表达的hiPSC来自hPDF。补充方法1:多能性诱导质粒的扩张。质粒的补充方法2:资格hiPSC一代。补充方法3:碱性磷酸酶染色住hiPSC识别。补充方法4:cryosection免疫荧光的hiPSC TRA-1-60和10月3/4。补充方法5:uDISCO Nanog在hiPSC免疫荧光的方法。补充方法6:从hiPSC中提取RNA。(补充材料)