文摘
Kartogenin (KGN),一种新型小分子化合物,被认为是一种很有前途的chondrogenic启动子在软骨再生。然而,KGN是否也参与骨和骨再生仍不清楚。本研究旨在探索KGN的角色在骨髓间充质干细胞成骨分化(BMMSCs)以及确定骨生成的可能机制。我们发现KGN增强BMMSCs的成骨分化能力在不影响细胞增殖,在自噬活动和autophagy-related基因的表达被提升。此外,KGN调节Smad1/5/9信号的磷酸化水平,抑制和激活Smad信号也被用于验证的参与在BMMSCs Smad KGN治疗。总之,这项研究表明,KGN促进成骨分化BMMSCs通过增强自噬水平和移植Smad1/5/9信号机械。
1。介绍
骨缺陷可能发生由于各种原因,如创伤、感染和先天畸形。虽然骨组织有自愈的能力,许多骨缺陷或骨折仍然是一个重大的挑战在再生医学由于某些疾病或缺陷的大小。研究骨髓间充质干细胞(BMMSCs)为复杂的骨缺损疾病提供了新的治疗策略(1,2]。然而,大多数当前的治疗骨缺损修复使用BMMSCs遭受的弱点如可怜的成骨分化率,低水平的骨融合,和不满意骨生成稳定;因此,迫切需要进一步探索BMMSC分化机制和优化他们的定向分化调节骨组织工程促进干细胞骨缺损修复和重建。Kartogenin (KGN)是一种新型小分子化合物,研究了Johnson et al。3第一次是在2012年。是证明能力的发挥chondroprotective影响体外诱导chondrogenic间充质干细胞(msc)分化和骨关节炎动物模型被证明是有效的。受益于高稳定性、KGN广泛探索了组织再生,尤其是对软骨修复。到目前为止,据报道,KGN可以诱导msc分化为软骨细胞在体内和体外4,5]。此外,它研究领域的tendon-bone愈合,伤口愈合,肢体发展(6]。然而,有一个研究的相对缺乏KGN在骨再生的影响。据王et al。7),KGN促进细胞内抗氧化活性通过激活AMPK-SIRT1信号通路,从而促进骨生成。因此,有趣的是确定KGN可以促进成骨的活动KGN BMMSCs和具体机制的干细胞。
msc multidifferentiation能力并能够维持骨内稳态,已广泛研究领域的骨再生(8,9]。德克艾尔。10)透露,KGN激活转化生长因子-β/果蝇对decapentaplegic蛋白质(TGF -母亲β/ Smad)信号通路,移植Smad2/3的磷酸化水平,刺激小鼠胚胎肢发展。作为一个重要的信号通路,TGF -β/ Smad是必不可少的中介BMMSCs的成骨分化的承诺11,12]。磷酸化Smad1/5/9介导的骨形成蛋白- 2 (BMP)受体导致激活亚型和Smad4交往,其次是易位到细胞核,诱导osteogenesis-related基因转录,使得MSC Smad1/5/9信号基本成骨的信号(12]。组成的一个子集TGF -β总科,每个位置调节许多生物过程,如形成骨骼和软骨细胞在胚胎发生(13),会导致Smad-specific转录因子磷酸化(14]。Smad中蛋白质,Smad1、Smad5 Smad9与成骨分化密切相关(15]。绑定后的每个特定受体,磷酸化的BMP-responsive Smad 1、5、9的结果在复杂地层R-Smads,积累与common-mediator Smad4的核,这是致力于osteogenesis-related基因表达调控(16,17),如转录Runt-related转录因子2 (Runx2),骨生成的重要调节因子,导致其他成骨的基因的表达的启动12,18]。在此基础上,KGN能否上调Smad1/5/9促进BMMSC成骨分化的表达需要确认。
自噬是一个高度保守的基本细胞生物学过程,帮助维持体内平衡和细胞应激条件下提高细胞生存19]。自噬在细胞trilineage也是不可或缺的分化(20.),如成骨分化(21]。近年来,有研究专注于自噬和msc成骨的影响。据报道,自噬可以提高骨生成的调节成骨细胞分化和矿化,尤其是影响自噬小体在细胞外钙运输22]。自噬活动也密切关注MSC分化可能通过调节脂肪形成的或成骨细胞的血统,和自噬水平可能会影响骨细胞存活率在不利的情况下(19]。提出了几个标记监测自噬,如LC3、以及autophagy-related基因如LC3, Atg7, Beclin1。LC3通常参与elongation-closure自噬小体的形成和存在于两种形式(23]:LC3-I,分布在细胞质和非结合的脂质,LC3-II,位于自噬体膜脂质磷脂酰乙醇胺和共轭,被广泛使用作为一个特定的自噬小体标记访问自噬流量。
本研究的目的是调查KGN促进MSC骨生成的影响,探讨可能的机制。我们的研究结果将提供新的见解小分子compound-induced BMMSC骨骨组织工程以及新方向为临床复杂的骨缺损修复和重建。
2。材料和方法
2.1。隔离和BMMSCs文化
C57BL / 6 j小鼠(6 - 8周;女)买来SiPeiFu生物技术有限公司有限公司(防晒系数;北京,中国)。所有有核细胞获得小鼠股骨和胫骨骨髓和细胞( 每100 mm细胞培养皿)(美国纽约康宁)被播种在37°C, 5%的公司2。2 d后,nonattached细胞被丢弃,贴壁细胞培养14 d完成α最低基本培养基(生物产业、拜特Haemek、以色列)添加胎牛血清(20%;Gibco)、谷酰胺(2毫米;Gibco)、2-mercaptoethanol (55μM;Gibco)、青霉素、链霉素(1%;Gibco)。msc的隔离和标识是描述在我们先前的研究[24- - - - - -26]。每三天中被刷新,然后,克隆形成连接细胞进一步通过一次实验使用。
2.2。细胞增殖实验
的存活率BMMSCs进行使用细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验(Solarbio)。BMMSCs培养中等(100μL /)在96 -孔板的密度 每口井。CCK-8试剂与培养基稀释准备工作解决方案后24 h培育和孵化额外1.5 h的指导建议。随后,光密度值测量是由一个微型板块读者(美国弗吉尼亚Bio-Rad) 450 nm波长。我们做这个试验在0 h, 12小时和24小时。MSC的增殖人口也使用Ki67公司化验检查。鼠标BMMSCs被播种和培养20毫米玻璃室幻灯片(康宁)。中包含的文化被孵化Ki67的解决方案(1:100;表达载体、钙、美国)20 h和染色使用Ki67染色工具包(表达载体)。积极Ki67细胞和整体细胞计数,分别和比例计算。
2.3。透射电子显微镜法
应用透射电子显微镜(TEM)观察自噬体。细胞被固定在4%甲醛和清洗在PBS,其次是postfixation OsO在1%4一夜之间在4°C。样本然后脱水逐步提升乙醇,用氧化丙烯洗净,然后嵌入环氧树脂作为之前的研究描述(27]。部分与柠檬酸铅染色以及醋酸双氧铀。
2.4。成骨分化分析
BMMSCs通道2准备成骨的感应,和成骨的介质是用于BMMSC文化包含完整的培养基+抗坏血酸(50 mg / L;Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),β甘油磷酸酯(10毫米;Sigma-Aldrich)和地塞米松(10海里;Sigma-Aldrich),用新鲜OM每三天更换一次。两周后的感应,4%多聚甲醛(Solarbio,北京)是用于细胞修复。矿化结节的形成是利用茜素红染色检测(ARS)工具包(Sigma-Aldrich)。积极的量化分析染色区域是由图像专业+ 6.0 v(美国媒体控制论,CA)和提出的比率。
2.5。免疫印迹分析
获得的总蛋白质的BMMSCs里帕缓冲区(Solarbio)添加蛋白酶的抑制剂鸡尾酒/磷酸酶(美国马热费希尔科学)。BCA蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)用于浓度量化。等量的蛋白质悬挂被应用于4 - 12% SDS-polyacrylamide凝胶(Beyotime)然后electroblotted到聚乙二烯二氟化物膜(热)。膜被封锁在TBST 5%脱脂牛奶。主要抗体mouse-monoclonal anti-Runx2 (1: 1000;圣克鲁斯、钙、美国;sc - 101145), mouse-monoclonal anti-alkaline磷酸酶(Alp) (1: 1000;圣克鲁斯、钙、美国;sc - 365765), rabbit-polyclonal anti-autophagy-related基因7 (Atg7;1:1000; Proteintech, NJ, USA; 10088-2-AP), rabbit-polyclonal anti-microtubule-associated protein light chain 3 (LC3; 1 : 1,000; Cell Signaling Technology, MA, USA; 4108S), rabbit-polyclonal anti-Smad1/5/9 (1 : 1,000; Affinity Biosciences, CA, USA; AF0614), and rabbit-polyclonal anti-phosphorylated-Smad1/5/9 (pSmad1/5/9; 1 : 1,000; Affinity Biosciences; AF8313) were performed overnight in order to the membranes’ molecular probing. Then, membrane incubation was implemented using horseradish peroxidase-conjugated mouse or rabbit secondary antibodies (1 : 15,000; Beyotime), after which SuperSignal West Pico Substrate (Thermo) was applied for band enhancement. Quantification analysis was conducted by ImageJ 16.0v software and relatively normalized toβ肌动蛋白(1:5000;中山金桥生物技术,中国)。
2.6。Immunofluorescent染色
BMMSCs收获和4%多聚甲醛和0.1%处理Triton x - 100解决方案(Beyotime)固定和透化作用,分别,然后孵化山羊血清(Beyotime)为5%。然后BMMSCSs LC3;探讨了主要抗体,Runx2,和高山(1:100)在一夜之间在4摄氏度,和二次抗体(1:200年,Beyotime)被用于另一个小时在室温下。DAPI (Beyotime)是用于细胞核对比染色。激光扫描共焦显微镜用于染色可视化(LSM 510;德国蔡司)。职业形象+ 6.0 v软件进行定量分析的目的。
2.7。定量逆转录-聚合酶链反应(存在)
细胞总RNA提取首先执行了试剂盒试剂(表达载体),然后,互补DNA合成了PrimeScript™RT试剂盒(豆类、东京、日本)和gene-specific引物(表1)。存在是由SYBR绿色Q-PCR大师混合(热)7900 ht夏令时间PCR系统。使用2−相对表达水平进行了分析ΔΔCt计算方法与GAPDH正常化。
2.8。试剂和化学物质
KGN(美国TX Selleck化学品)溶解在二甲亚砜(DMSO)股票的解决方案。细胞治疗0.005% DMSO作为控制。其他试剂应用于研究列出如下:3-methyladenine (3-MA;美国莱克化工、TX)(5毫米24 h)用作自噬抑制剂。两个信号抑制剂LDN - 193189 (LDN;0.5μM 12 h)和activator SB4 (0.1μM 24 h)从MedChemExpress购买(美国新泽西州多国评价)。
2.9。统计分析
进行了数据处理和分析SPSS 23.0 v (IBM、纽约、美国)以及GraphPad Prism 8.1 v Mac(美国CA GraphPad软件)。所有的值显示为计算平均值和标准偏差( ),代表至少三个独立的实验。比较两组独立样本被处决测试分析或Mann-Whitney rank-sum测试。以上两组之间的差异分析,单向方差分析与图基进行测试。统计学意义的标准设置 。
3所示。结果
3.1。BMMSCs KGN促进成骨的能力
的浓度KGN被建议在先前的研究28- - - - - -32),最优浓度骨生成的KGN BMMSCs 10μ在这项研究中(图S1)。KGN确定扩散能力的影响,CCK-8进行,结果表明单KGN治疗10μM 72 h不影响细胞生长(图1(一))。Ki67,细胞增殖活性的一个标志33),也通过免疫荧光染色,它显示无统计差异(数据1 (b)和1 (c))。接下来,我们测试是否KGN BMMSCs促进成骨的能力。ARS染色证明矩阵矿化明显增强了KGN治疗14天与对照组相比(数字1 (d)和1 (e))。免疫印迹分析还表明,KGN调节高山蛋白质含量在BMMSCs(数字1 (f)- - - - - -1 (h))。此外,相对表达水平高山和Runx2KGN感应后还显示一个上升趋势(数据1(我)和1(j))。这些数据表明KGN可以提高BMMSC成骨分化在不影响细胞增殖活动。
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3.2。BMMSCs KGN上调自噬活动
评估是否KGN BMMSC的自噬活动在成骨分化的影响,进行了TEM来确定自噬小体的形成在BMMSCs形态,这被认为是标准检测自噬(34)(图2(一个))。LC3,自噬的标志,也分析了免疫荧光染色。结果表明,LC3的表达水平明显增加后KGN感应(数字2 (b)和2 (c))。此外,自噬的面板标记被用来检测自噬活动。ATG7和裂解LC3产品、LC3II KGN治疗后都提出了一个高水平,证明KGN是与自噬(数据密切相关2 (d)- - - - - -2 (f))。一致,结果中存在还透露autophagy-related标记的表达显著增加Beclin1,Atg12,Dram1,Atg3(数据2 (g)- - - - - -2 (j))。综上所述,这些结果显示钢筋的自噬活动KGN-treated BMMSCs。确认这个结果,早期的自噬抑制剂3-MA BMMSCs,有效抑制自噬水平,为西方墨点法评估(数据2 (k)- - - - - -2(米))。
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3.3。KGN改善骨BMMSCs通过自噬激活
自噬中扮演一个重要的角色在BMMSC分化为主要功能的细胞在骨形成,调节生理功能维持骨内稳态(35]。尽管KGN已经被证明能够提升BMMSCs自噬活动和促进成骨分化,底层机制仍然是难以捉摸的。因此,3-MA应用感应KGN识别其前BMMSC成骨分化过程中自噬的作用。治疗后14天,3-MA被发现有减毒KGN引起的钙结节的数量(数字3(一个)和3 (b))。与对照组相比,免疫荧光染色还表示,高山和Runx2的KGN-induced表达被抑制3-MA(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。与此一致的是,高山和Runx2的蛋白质和mRNA水平表现出明显的下降,当3-MA参与(数字3(g) -3 (k))。这个建议自噬执行KGN引起成骨分化的重要功能,而抑制自噬导致成骨分化的抑制。
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3.4。KGN促进骨生成的BMMSCs Smad1/5/9信号后自噬激活
考虑Smad信号在MSC成骨分化的重要作用[12),我们调查是否Smad1/5/9通路参与KGN-induced成骨分化。测试是否自噬和Smad1/5/9通路介导的成骨分化,3-MA和LDN申请上述两个禁忌,分别。根据西方墨点法评估,KGN调节Smad1/5/9的磷酸化,和3-MA减弱这种影响(数据4(一)和4 (b)),而Smad1/5/9保持稳定。此外,Smad1/5/9的磷酸化水平被LDN压缩(数字4 (c)和4 (d))。LDN治疗后,钙结节被ARS与KGN组相比显著降低,表明成骨效果大大削弱了LDN(数字4 (e)和4 (f))。一致,LDN也抑制蛋白质和mRNA水平的高山和Runx2引起KGN(数字4(g) -4 (k))。同时,也提出了类似的发现在免疫荧光染色(数字4(左)- - - - - -4 (o)),这表明LDN封锁了KGN-induced高山和Runx2表达水平。
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此外,进一步证实Smad1/5/9通路参与KGN-induced骨生成,我们使用它激活SB4(数字5(一个)和5 (b))的KGN治疗后24 h。如上所示,3-MA抑制Smad1/5/9的磷酸化作用,而这种作用被SB4救起(数字5 (c)和5 (d))。与此一致的是,ARS染色表明,钙盐沉积KGN减少3-MA,而SB4减少抑制效应(数字5 (e)和5 (f))。这些结果证实使用免疫印迹(数字5 (g)- - - - - -5(我)),存在(数字5 (j)和5 (k))和免疫荧光染色法(数字5(左)- - - - - -5 (o))。这些结果证实,KGN增强BMMSC通过Smad1/5/9通路后自噬激活成骨分化。
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4所示。讨论
作为骨组织工程的重要组成部分,BMMSCs有multilineage分化,迁移和旁分泌的影响,和低免疫原性风险,使它们广泛研究骨质疏松和骨缺损修复(36]。近年来,KGN大多集中在再生医学的研究。大多数研究都集中在软骨修复和骨关节炎治疗KGN角色。Johnson et al。3]首先证明KGN可以诱导MSC分化chondrogenic CBF的加强核易位β为了发展与RUNX1复合物以及促进表达坳二世。到目前为止,chondrogenic KGN的促进和保护功能也被证明(37,38]。王等人。7)透露,KGN减毒活性氧在细胞内环境和提升人类BMMSCs的成骨分化。然而,KGN和骨生成改进之间的关系还没有完全理解。在这项研究中,我们证实了重要的诱导作用在促进BMMSC KGN上调自噬骨的活动与Smad1/5/9通路。几项研究揭示了一个早期osteogenesis-associated标记的表达明显增加,如高山和Runx2在BMMSC成骨分化(39- - - - - -41]。在我们的研究中,KGN高山和Runx2主导性的表达水平升高。同时,BMMSCs核扩散活动没有影响,表明KGN提升BMMSC成骨分化能力而不影响其增殖能力。
自噬,体内平衡机制在不同条件下,必须消除在静止期细胞废物产生的干细胞(42]。自噬的调制msc可能影响其分化能力,以及扩散的命运,激活和函数(42]。过去的研究表明,自噬在骨重建中扮演不可或缺的部分规定(21]。在我们的研究中,autophagy-related基因的蛋白质含量Atg7以及LC3-II / LC3-I比率都是高架KGN治疗后,和的表达式Beclin1,Atg12,Dram1,Atg3同样得到了提高。这些结果反映KGN的角色在促进自噬BMMSCs活动。此外,3-MA,自噬抑制剂,用于证实自噬KGN治疗期间的参与。由于3-MA-induced自噬抑制,蛋白质和mRNA水平的高山和Runx2 KGN-treated BMMSCs大幅下调,和成骨分化活动减弱。这一发现表明,自噬在KGN-induced成骨分化至关重要。
研究表明,自噬是参与TGF -β/ Smad途径[14,43]。张等人证明了胰岛素抑制成骨的水平的BMMSCs通过抑制自噬活动和加强通过TGF -过早衰老β1信号通路(44]。Smad2/3也受到自噬的磷酸化,从而影响一系列函数(45),如epithelial-to-mesenchymal过渡和细胞迁移46]。然而,自噬Smad1/5/9蛋白质的影响尚不清楚,和当前研究自噬和Smad蛋白质之间的关系主要集中在功能的细胞如成纤维细胞和内皮细胞。在这项研究中,发现KGN诱导BMMSCs Smad1/5/9的磷酸化水平。德克等人的研究也建议KGN可能促使老鼠胚胎肢发展主要是通过上调Smad2/3的磷酸化E11.5肢芽间充质细胞(10]。这种现象可能归因于具备干细胞性质和程度的分化,和各种Smad磷酸化水平KGN的影响在胚胎或成体干细胞可能会影响成骨的能力。此外,我们的研究结果进一步表明,LDN [47),选择性Smad信号通路的抑制剂,可以抑制BMMSCs的分化能力,而激活SB4 [48)可以挽救的抑制影响3-MA BMMSCs成骨分化。这些结果表明,KGN BMMSCs诱导自噬活动和增强成骨分化能力,上调Smad1/5/9的磷酸化水平,在以往的研究并没有发现。因此,我们的研究表明,自噬和Smad1/5/9扮演了一个重要的角色不仅在成纤维细胞或内皮细胞,而且在BMMSCs成骨分化。然而,尽管在BMMSC KGN成骨分化的作用已被证明在体外,更应该进一步开展体内研究。因此,研究特定功能和机制的KGN是不可或缺的,例如,KGN对骨修复和重建的影响在不同的细胞领域(不同年龄阶段,不同类型的骨缺陷,骨质疏松症模型,等等)(49,50),KGN和骨或软骨形成之间的关系在不同条件下也应该阐明。此外,KGN体内的应用值得进一步探索,如KGN结合生物支架材料、种子细胞和生长因子满足骨组织工程的需要,甚至合适的药物输送系统(DDS),以方便控制交付KGN [51- - - - - -53]。更深入的研究来识别KGN机制包括autophagy-related基因敲除和Smad途径验证体内也是必需的,以便更好地理解KGN在骨再生的作用。
5。结论
总之,我们的研究显示,KGN扮演一个关键的角色在促进成骨分化BMMSCs通过自噬的调制和磷酸化水平Smad1/5/9(图6)。研究还提高了对msc的属性和角色的Smad亚型以及自噬/ Smad1/5/9信号通路,从而促进进一步的研究探讨成骨的能力msc在骨再生和骨组织工程的临床治疗。
数据可用性
作者确认所有数据的发现是完全可用的。进一步调查可以直接到相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Huichun燕和婷婷Yu造成了同样co-first作家这个工作。
确认
这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(批准号81970909和81970909),青年科学家基金PKUSS(批准号20110203和20110203),开放的基础军事口腔学国家重点实验室(批准号2020 ka01),宁夏回族自治区的主要研发计划(批准号2020 bcg01001-4),中国口腔疾病基金会(批准号A2021057),国家多学科合作PKUSS诊断和治疗能力建设项目(批准号PKUSSNMP202020),年轻的精英科学家赞助项目(批准号2021 qnrc001),和北京市自然科学基金(批准号7192290)。
补充材料
补充图1:滴定数据的KGN BMMSC成骨。(一)农业研究所和(B)的矿化结节semiquantification KGN-induced BMMSC骨生成在不同浓度从0.1μM - 100μm .规模 μm。(C, D)中存在显示高山的表达水平和Runx2 KGN不同浓度。 和 ,单向方差分析测试。(补充材料)