Icariin促进生存、增殖和分化的神经干细胞在体外和阿尔茨海默病鼠模型

文摘

阿尔茨海默病(AD)包括基底前脑胆碱能神经元的变性。神经干细胞(NSC)移植已成为一种很有前途的治疗方法治疗广告。Icariin (ICA)是主要的活性成分淫羊藿中国传统草药。本研究的目的是调查的效果和机制ICA的nsc增殖和分化的基底前脑fimbria-fornix横断(FFT)大鼠模型。在目前的研究中,ICA促进了生存、增殖,nsc迁移在体外。在FFT老鼠,ICA提升nsc增殖和分化成神经元和女士的胆碱能神经元的数量增加和基底前脑的一家。这些结果表明,联合治疗的ICA口服和NSC移植可能提供一个新的潜在的和有效的广告方法治疗。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD),最常见的痴呆症,包括基底前脑胆碱能神经元的变性。神经干细胞/祖细胞多能干细胞具有自我更新能力和分化成神经元和神经胶质细胞的能力。神经干细胞(NSC)移植已成为一种很有前途的治疗方法治疗神经退行性疾病,如广告(1]。然而,nsc需要连续支持神经营养因子长期生存在移植后分化成特定的神经元类型(2]。在广告使用外源性NSC移植治疗,NSC的关键一步是诱导分化成特定的神经元。

NSC移植的焦点是维持活动,增殖和定向分化的NSC移植后。生长因子如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)和神经生长因子(神经生长因子)据报道,促进nsc的分化成神经元在体外和在活的有机体内(3- - - - - -5]。表皮生长因子(EGF)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)诱导nsc增殖和细胞集群的形成和neurospheres6]。然而,生长因子不安穿过血脑屏障和展示短半衰期(1,7]。发现新的小分子取代生长因子,维持移植干细胞的活性和增殖成为这个地区的一个关键问题(1,8]。

淫羊藿(yinyanghuo)是一种广泛使用的中药几千年了。淫羊藿黄酮(EF)是主要的活性成分提取淫羊藿,据报道,神经保护和抗炎作用9,10]。在我们之前的研究中,我们发现,淫羊藿黄酮有效地促进了神经干细胞的增殖和分化在体外(11]。Icariin (ICA)是淫羊藿黄酮类化合物的主要活性成分。淫羊藿已经发现浓度近年来,表现出神经系统药理作用在几种疾病,包括广告、脑缺血、多发性硬化、帕金森病(12- - - - - -17]。我们之前的研究表明,ICA促进了神经干细胞的增殖在体外(18]。然而,ICA在广告NSC移植模型的影响还没有被调查。

的fimbria-fornix横断(FFT)大鼠模型一直是一个AD动物模型,因为FFT胆碱能神经纤维的损伤预测隔海马体和大脑皮层,从而引起胆碱能系统损伤和学习和记忆障碍(19,20.]。在目前的研究中,我们首先研究了ICA的影响生存,nsc增殖、迁移和分化在体外。然后,我们使用FFT老鼠作为广告模式和调查的影响ICA口服NSC增殖和分化的基底前脑的FFT NSC移植后大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。药物和材料

Icariin (ICA) ( 通过高效液相色谱法)从陕西Scidoor购买高科技生物有限公司(西安,中国)。生长介质由无血清条件杜尔贝科修改鹰的介质/火腿F-12介质(DMEM / F12 Gibco) 20 ng / ml EGF和10 ng / ml bFGF(美国Gibco)。NSC增殖培养基是由DMEM / F12和B27(2%)补充20 ng / ml bFGF。基本培养基组成的DMEM / F12和B27 (2%)。NSC的分化培养基由DMEM / F12, B27 (2%)、GlutMAX(1%)、和的边后卫(1%)(美国Gibco)。所有细胞板或眼镜与poly-D-lysine预镀(σ,美国)。

2.2。准备和nsc的识别

单细胞分离胚胎第14天端脑的老鼠和镀到细胞培养瓶中生长介质无血清条件培养液DMEM / F12包含20 ng / ml EGF和10 ng / ml bFGF。文化是维持在37°C在湿润的气氛中95%的空气/ 5%的股份有限公司₂。文化7天后,增殖细胞形成浮动球形骨料,所谓neurospheres。Neurospheres收集和机械分离单细胞悬液和山肩NSC增殖介质产生二次Neurospheres。

在NSC增殖培养基文化4天之后,二级neurospheres 24-well板后再悬浮山肩。24 h后,neurospheres贴上10μM 5-bromo-2 - - - - - -脱氧尿苷(BrdU)(美国Sigma-Aldrich)。48小时后,细胞收获BrdU染色和免疫荧光染色的巢蛋白应用于识别nsc。

培养7天,二级neurospheres山肩NSC分化培养基。经过7天的分化,immunofluorescent染色标记的神经元(β-III-tubulin)和星形胶质细胞(神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP))进行了识别neurospheres的分化能力。

2.3。使用CCK8细胞生存分析

研究ICA NSC生存的影响,从初级neurospheres分离单个细胞( 细胞/毫升)resuspended NSC增殖培养基和培养24小时。中被替换为基础培养基含有不同浓度的ICA(最终浓度0.1,1、10和20μ米)和孵化细胞48 h。细胞生存进行了分析使用CCK8之前报道(18]。

2.4。使用BrdU细胞增殖试验

ICA在NSC增殖的影响,研究二级neurospheres培养4天的山肩NSC增殖培养基和培养24小时48-well板。中被替换为基础培养基含有不同浓度的ICA(最终浓度0.1,1、10和20μ米)或NSC增殖培养基(包含EGF和bFGF,积极控制)和孵化细胞48 h。10μM BrdU添加和培养24小时。BrdU-positive细胞的数量取决于BrdU染色。

2.5。量化细胞的迁移距离

检查ICA对neurosphere分化的影响,主要neurospheres均匀播种在35毫米盘的底部。Neurospheres镀是在低密度(每道菜10 - 15 Neurospheres)以确保大单个球体之间的距离和孵化有基本的DMEM / F12培养基没有bFGF和EGF。文化被接受ICA(0、0.1、1.0、10和20μ米)。在1、3、7、14天,量化过程的增长是评估在端到端距离的广泛的过程(NIS-Elements BR软件)。10 - 15的长度最长的过程是从neurospheres边缘的估计或细胞体的过程。

2.6。nsc的分化

分离单个细胞( 细胞/)从二级neurospheres镀与ICA在NSC 24-well板块分化培养基(0.1、1.0、10和20μ米)或没有ICA。孵化是在电镀后7天,终止和Tuj1的数量或GFAP和Hoechst-positive细胞免疫荧光染色后计算。

2.7。动物和FFT手术

男性Sprague-Dawley老鼠(250 - 270克体重)从北京获得至关重要的河实验动物技术有限公司,北京,中国。老鼠接受了单边fimbria-fornix横断(FFT) ( )或虚假的操作( )。单方面执行FFT使用钢丝刀附加到立体定位框架(SN-2类型、Narishige有限公司、日本)麻醉后如前所述[21]。虚假的手术只动物是由打开颅骨。轴索显微外科术的效率被证明尼氏小的染色22]。老鼠被放置在加热垫复苏麻醉手术后维持体温。所有动物保健和生物伦理学委员会批准的实验程序的首都医科大学宣武医院。

2.8。NSC移植和ICA治疗

老鼠被随机分为4组(图1(一)):虚假的操作组,模型组,NSC移植组和NSC移植结合20毫克/公斤ICA ( )组。分离、培养nsc如上所述,单个细胞从二级neurospheres贴上10μM BrdU。国家安全委员会( )是stereotaxically注入大鼠基底前脑( , ,和前囱)FFT后手术。胃内的管理ICA(20毫克/公斤/天)或车辆启动后3小时以内FFT手术和持续了28天。

2.9。免疫荧光染色和BrdU染色

免疫荧光分析培养neurosphere或细胞,细胞在冰冷的4%多聚甲醛固定15分钟,然后洗了三次磷酸盐(PBS) 0.01 (pH值7.4)。免疫荧光分析的大脑,大脑切片后获得程序在前一篇文章22]。使用血清阻塞后,大脑切片或培养细胞在4°C主要抗体孵育过夜。在这项研究中使用的抗体列出如下:anti-Nestin (1: 200;美国Sigma-Aldrich SAB4200347),反β-III-tubulin (Tuj1;1:500;美国Sigma-Aldrich MAB1637),反- nf - 200 (1): 200;美国Sigma-Aldrich N0142)、anti-ChAT (1: 200;A01192-4博士德,武汉,中国),anti-GFAP (1: 200;美国sc - 33673, Santa Cruz)。部分被孵化的Alexa萤石第二抗体(1:200;美国热费希尔科学)2 h和赫斯特33342年复染色(C1022 Beyotime,中国上海)20分钟。部分被覆盖了与安装介质(ZSGB-Bio,北京)。

nsc增殖活动和验证nsc移植后调查BrdU标记和染色。培养细胞或大脑部分2 M盐酸处理,在37°C 30分钟变性DNA,并添加硼酸在0.1 M缓冲区(pH值8.5)10分钟。部分被孵化anti-BrdU抗体(1:200;美国Sigma-Aldrich B2531)和Alexa萤石第二抗体。荧光信号被激光共焦显微镜可视化系统(TCS SP5、徕卡、德国)。

2.10。统计分析

所有的数据进行了分析使用软件包SPSS 11.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。比较两组之间的显著差异,小动物——一张长有学生的 - - - - - -测试使用。其次是单向方差分析分析Dunnett事后考验被用来确定以上两组之间的统计学意义。数值数据被提供 平均误差(SEM),值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。识别nsc隔绝鼠体外胚胎第14天

immunofluorescent染色结果表明,neurospheres immunopositive巢蛋白,nsc的标志(图2(一个)A1)。BrdU标记和immunofluorescent染色表明BrdU被纳入neurospheres大多数细胞的细胞核和显示阳性染色(图2(一个)A2)。在不同条件下,一些细胞免疫反应性的神经元标记Tuj1和一些星形胶质细胞标记GFAP(图2(一个)A3-A6)。这些结果表明,培养细胞表现出的特点nsc由于其自我更新和multipotency可以用来移植研究。

3.2。ICA促进了nsc在体外的存活和增殖

为观察ICA NSC生存的影响,分离细胞从初级neurospheres镀96 -孔板和培养48 h与不同浓度的ICA在基本培养基(0、0.1、1、10和20μ米)。CCK-8细胞活性测定结果表明,10和20μM ICA处理促进了nsc的生存( ,图2 (b))。

二级neurospheres山肩在NSC增殖培养基(包含EGF和bFGF积极控制)或基本中不同浓度的ICA和BrdU (10μ米)被添加到调查ICA对细胞增殖的影响。从Hoechst-positive BrdU-positive细胞细胞的百分比显示,10和20μM ICA处理明显促进了nsc的扩散没有EGF和bFGF ( ,数据2 (c)和2 (d))。

3.3。ICA nsc迁移和分化的影响在体外

检查的影响从neurosphere ICA NSC迁移模式,neurospheres被播种在低密度,确保大型距离个人领域,在基础培养基没有bFGF和EGF孵化。个人nsc迁移迅速离开球,导致细胞形成单层的边缘领域,尤为明显的外围连接neurospheres。我们选择了4个时间点,即,1,3,7,和 14 days, to examine the spheres’ motility. ICA treatment promoted greater migration of NSCs than that of the control at all selected time points with a longer migration distance ( ;数据3(一个)和3 (b))。14天,大多数的细胞死在基础培养基对照组,而许多单个细胞长,直,和纤细的流程迁移距离的核心neurospheres 1、10和20μM ICA组( ;数据3(一个)和3 (b))。

确定ICA nsc的分化的影响,单个细胞分离从neurospheres受移植者,与ICA在基本培养基培养。孵化终止在镀后7天,Tuj1或GFAP和Hoechst-positive细胞的数量统计。Immunofluorescent染色显示没有区别组织Tuj1或GFAP-positive细胞(数据的百分比3 (c)和3 (d))。

3.4。ICA促进了nsc移植后的存活到FFT鼠模型中

单边FFT鼠模型建立的动物模型广告(19,20.]。nsc BrdU标记( ;4μl) stereotaxically注入FFT大鼠基底前脑。一群老鼠FFT与NSC移植治疗结合20毫克/公斤ICA,观察ICA在NSC的影响在活的有机体内(图1(一))。

FFT手术选择的位置如图1 (b)尼氏小染色(图和验证1 (c))。和Immunofluorescent BrdU-positive细胞染色后28天FFT显示交通站点和针,指示NSC移植成功的人物1 (d)和1 (e))。我们分析了针铁轨附近BrdU-positive细胞的数量不同的基团。与国家安全委员会组织相比,ICA处理显著增加的数量BrdU(+)细胞附近的针跟踪NSC移植后28天( ;数据1 (f)和1 (g))。这些结果表明ICA可以增加nsc移植后的存活或扩散在活的有机体内。

3.5。ICA提升NSC分化为神经元和星形胶质细胞

nf - 200作为成熟神经元的标记。双重immunofluorescent染色BrdU和nf - 200应用于检测神经元分化从nsc的数量。与vehicle-treated NSC组相比,ICA BrdU / NF200-positive细胞的数量增加( ;数据4(一)- - - - - -4 (c))和BrdU的百分比/ NF200-positive细胞( ;图4 (d))。这些结果表明ICA处理增加的数量和百分比nsc分化成神经元。

GFAP用作标记星形胶质细胞。双immunofluorescent BrdU和GFAP染色应用于检测的数量从nsc星形胶质细胞分化。与vehicle-treated NSC组相比,ICA BrdU / GFAP-positive细胞的数量增加( ;图5(一个)- - - - - -5 (c)),没有影响的百分比BrdU / GFAP-positive细胞(图5 (d))。这些结果表明ICA处理增加的数量从nsc星形胶质细胞分化。

3.6。ICA的基底前脑胆碱能神经元的FFT老鼠

FFT后,胆碱能神经元的百分比在病变边(侧)完整的边(侧)内侧隔(MS)和斜角带垂直的肢体(一家)明显下降( ;图6)。NSC组和ICA-combined NSC治疗组,胆碱能神经元的百分比在损伤到完整和女士一家明显高于模型组( ;图6)。ICA-combined NSC组有更多的胆碱能神经元和女士一家与NSC集团( ;图6)。这些结果表明,NSC移植改善胆碱能神经元的损失由FFT和女士一家的基底前脑和ICA治疗结合NSC移植最好对胆碱能神经元的存活率的影响。

4所示。讨论

广告是一个非常复杂的病理生理学神经退行性疾病。细胞外老年斑-淀粉样蛋白的组成β(一个β神经原纤维缠结)和细胞内(非功能性测试)由过度磷酸化τ导致神经元变性和突触丢失,特别是基底前脑胆碱能神经元的损失(22,23]。NSC移植提供了一个有前途的神经退行性疾病的治疗策略。然而,所知甚少这一现象能坚持多久在广告(NSC移植后1]。结合NSC移植与管理有效的药物可能是一个更有效的治疗广告(8]。

在目前的研究中,我们成功地分离,培养,确定端脑的nsc胚胎第14天老鼠(图2(一个))。nsc可以自我更新和分化成神经元和胶质细胞。然后,我们研究了ICA的影响生存,nsc增殖和分化。我们的研究表明,ICA有效提升nsc作为单个细胞的生存在体外没有显示毒性的浓度0.1 ~ 20μM(图2 (b))。ICA BrdU-labeled neurospheres培养细胞的数量增加(数据2 (c)和2 (d)ICA),胃内的管理也增加了BrdU-labeled附近NSC移植细胞的基底前脑FFT老鼠(数字1 (f)和1 (g))。这些结果表明ICA直接提升NSC增殖在体外和FFT NSC移植后大鼠模型。

NSC增殖和迁移和神经分化是在中枢神经系统(神经发生和再生的关键过程24,25]。在目前的研究中,我们发现了ICA的nsc迁移和分化的影响。结果表明,ICA迁移距离较长的治疗提高nsc迁移,后3、7、14天neurospheres被播种。此外,nsc可以存活时间更长(播种后至少14天)与ICA治疗基础培养基没有bFGF和EGF(数字3(一个)和3 (b))。这些结果表明ICA提升NSC迁移和生存,可能提供更多的容量NSC移植后大脑神经发生和再生。

NSC有可能分化成神经元和神经胶质细胞在一定条件下,这些功能的源代码NSC移植后受损的中枢神经系统的再生(25]。然而,nsc显示更多的分化趋势除了神经元,星形胶质细胞分化成神经元只有一个小的比例在体外和在活的有机体内(26]。在目前的研究中,ICA处理增加了神经元和星形胶质细胞分化的nsc FFT的老鼠的大脑中。此外,ICA的nsc比例的增加分化成神经元(数字4和5)。nsc很少分化成神经元由于不利的微环境在中枢神经系统损伤(27]。所以我们推断ICA治疗可能有利于分化的神经元通过提高FFT的老鼠的大脑中微环境。

神经营养因子脑源性神经营养因子、神经生长因子等已报告改善微环境和促进nsc的分化成神经元3,5]。干预措施,增加神经营养因子可以促进nsc的分化27,28]。我们之前的研究表明,淫羊藿黄酮类化合物增加了BDNF的表达水平和海马的neuregulin 1慢性脑低灌注大鼠模型(9,29日]。ICA是淫羊藿黄酮类化合物的主要活性成分。我们还发现,ICA高架NeuN / NGF-positive细胞的数量的额叶皮质髓鞘脱失小鼠模型(15]。最近,ICA报道来维持的增殖和分化β_{25 - 35}治疗海马神经干细胞通过BDNF-TrkB-ERK / Akt信号通路(16]。在动物模型的抑郁和创伤性脑损伤,据报道,ICA提高BDNF的表达和改进的功能行为疾病模型(30.,31日]。因此,我们推测ICA可能会增加神经营养因子,改善微环境,促进nsc分化成神经元。

在基底前脑胆碱能神经元的巨大损失是AD患者的主要病理改变之一(23]。fimbria-fornix构成主要传入和传出纤维束连接与间脑海马体,前脑,纹状体和前额叶皮层(32]。FFT剥夺了主要的海马胆碱能输入,此外,扰乱了实质性部分的输出海马结构(19,20.]。在目前的研究中,我们应用FFT鼠模型探讨ICA在nsc移植的影响在活的有机体内。结果表明,胆碱能神经元的数量和基底前脑的一家女士在FFT模型组显著下降。日常ICA的联合治疗口服和NSC移植应用FFT手术后的大鼠模型。尽管NSC移植仅增加了女士的胆碱能神经元数量和基底前脑的一家,联合治疗显示更好的效果(图6)。基底前脑胆碱能神经元的损失是与AD患者的认知能力下降24,33]。据报道,胆碱能神经元的移植改善认知能力在广告模型(1,34,35]。因此,我们推测,ICA口服和NSC移植联合治疗可能改善认知功能的广告。

5。结论

在目前的研究中,我们发现,ICA促进了生存、增殖,nsc迁移在体外。在FFT老鼠,ICA提升nsc增殖和分化成神经元和女士的胆碱能神经元的数量增加和基底前脑的一家。这些结果表明,联合治疗的ICA口服和NSC移植可能提供一个新的潜在的和有效的广告方法治疗。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者声明,不存在利益冲突。

作者的贡献

Denglei赵马和音)进行了实验和分析数据。李张和李海滨住宅进行免疫印迹和免疫组织化学。局域网张分析和解释数据。马Denglei林和李起草了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81673406和81673406),首都科技领导人才培养项目(Z191100006119017)和北京医院权威提升计划(DFL20190803)。

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