间充质干细胞表促进功能恢复和减轻神经性疼痛亚急性脊髓损伤模型

文摘

干细胞疗法已被证明改变脊髓损伤(SCI)的后遗症。尽管理想的治疗途径仍然未知,提供大量的干细胞受伤的网站使用微创技术是实现最大经济复苏的关键。这研究是确定政府进行骨髓干细胞(BMSC)表了自己的无支架优于髓内细胞移植在大鼠亚急性SCI模型。成年女性Sprague-Dawley老鼠受到SCI 30 g剪辑压缩Th6 Th7,是企业综合管理水平的细胞表( 细胞,硬膜下),细胞悬液( 细胞,髓内),或者控制在受伤后七天。电动机和感官评估以及组织学评估,进行确定的功效不同的细胞移植过程。虽然细胞表和细胞髓内注射组显示显著的运动康复与对照组相比,细胞板组显示更好的结果。此外,细胞板组显示的一个重要感官复苏相比其他群体。组织学评估显示,细胞板组显示小损伤病灶体积,减少炎症和神经胶质过多症与其他组。Sensory-related纤维的μ阿片受体(铁道部,中间神经原)和羟色胺转运蛋白(计画,下行疼痛抑制通路),位于脊髓背角的尾侧的SCI,只保留在细胞表组。干细胞也可以发现在peri-injured脊髓细胞表组。BMSC细胞表能够促进功能恢复,减轻神经性疼痛比髓内注射更有效,从而为SCI作为良好的治疗选择。

1。介绍

世界上超过一百万名患者患有瘫痪造成脊髓损伤(SCI) (1]。除了下肢轻瘫,SCI患者常常抱怨进行性神经性疼痛水平以下的伤害(2]。良好,疼痛强烈影响恶化的物理、心理和社会功能康复和原因限制通过干扰日常生活和睡眠3- - - - - -5]。因此,有效的治疗方法的发展不仅可以改善运动功能障碍,还感觉障碍,因为科学。

干细胞疗法,再生神经网络或改善神经损伤,有望成为一种很有前途的候选人SCI,和众多的临床调查已经启动,与不同的结果(6,7]。虽然细胞移植的方法,如细胞的类型、剂量,移植的路线,和时间,不同试验和没有统一的共识最安全、最有效的治疗策略,髓内注射移植仍然是最受欢迎的路线。这是因为髓内移植提供最多的细胞显示优势和提供更大的功能恢复在血管内(动脉和静脉)移植动物实验(8,9]。然而,脊柱内注射干细胞的主要问题是,它具有机械损伤的风险在注射过程中,当细胞需要注射针头可以损伤脊髓或血管。为了克服这个问题,干细胞与支架已经深入调查(10- - - - - -14]。重要的是,如果含有干细胞的支架成功地连接到脊髓表面,它可以提供一个足够数量的细胞受伤部位,同时避免额外的伤害。然而,支架已报告在细胞封装在脚手架有限可能显示有限的细胞存活和分化,不充分整合到宿主组织,加重炎症(15- - - - - -19]。在细胞和组织工程取得了最新进展干细胞表的发展,而不需要创建生物材料支架的单独从干细胞和临床试验的应用这些表其他疾病已经启动(20.- - - - - -24]。然而,数据支持使用SCI的干细胞表还没有完全阐明(25]。因此,本研究的目的是检查硬膜下政府的治疗效果的骨髓间充质基质细胞(BMSC)表在SCI压缩模型,尤其是关注感觉障碍的缓解。

2。材料和方法

2.1。实验伦理

所有实验协议被批准的北海道大学研究生院医学动物实验伦理委员会(参考号17 - 0065)。所有程序都是由机构和政府指导方针后(适当的进行动物实验的科学指南委员会日本)。

2.2。隔离和bmsc的文化

bmsc孤立于10周大,绿色荧光蛋白(GFP)表达转基因Sprague-Dawley (SD)大鼠(静冈市,日本SLC有限公司日本)如前所述。(26,27)细胞通过三次之前被用于实验。

2.3。制备BMSC表

BMSC细胞表创建与一些修改(如前所述28]。简单地说,8.8厘米²文化菜鬼屋方面聚合物(poly-N-isopropyl-acrylamide)涂层(CellSeed Inc .、东京、日本)被用来准备后的BMSC表制造商的指示。伴着被播种到盘子的 细胞/盘密度3毫升的最低基本培养基(MEM)α(美国表达载体,32571 - 036)含10%胎牛血清的边后卫,0.2% 100单位/毫升青霉素G, 82μ和光纯g / ml L-ascorbic酸(kouichi化学工业,013 - 19641年,大阪,日本)。盘子上的细胞孵化的孵化室(5%股份有限公司₂在37°C)和95%的空气,媒介改变了每周两到三次,直到细胞达到融合。经过7天的文化,融合bmsc的菜是孵化20°C,在10到20分钟,细胞分离和浮动自发到介质作为单细胞表(图1(一))。计数细胞数量在每个表的BMSC表( )使用0.05%胰蛋白酶消化(Gibco、东京、日本),然后呢 从每个单元表获得的细胞。调整细胞的数量与髓内注射组,切成表 毫米广场和调整,大约 细胞将被移植。

2.4。实验动物

60野生型8到12个雌性SD大鼠(250 - 300 g)(克丽日本,Inc .,东京,日本)被用于这些实验。女性使用,因为排尿SCI后出现的管理问题。动物被允许免费的水和食物,保存在一个受控环境(25°C,湿度50%,和12小时光暗周期)。

2.5。SCI模型

的方法诱导SCI之前已经报道过了。(29日- - - - - -31日)短暂,一分钟压缩修改动脉瘤夹(瑞穗、东京、日本)被用来诱导胸SCI。剪辑是为了有30 g闭合力,叶片是平和申请平等脊髓的压力。麻醉诱导与异氟烷的起始浓度4.0%,维持在2.0%,30%₂气体和70% N₂啊,通过一个面具。麻醉后,椎板切除术被执行在卧姿椎段Th6 Th7。然后,剪辑是捏脊髓硬膜外的插入在Th6 / Th7水平一分钟。老鼠提出电动机低赤字(低音部,比蒂和Bresnahan (BBB)得分超过2点24小时后侮辱)被排除在后续实验。执行手动压缩大鼠膀胱的排尿一天3次,直到自发膀胱控制。

2.6。细胞移植

细胞移植是SCI后7天。所有实验动物随机分为下列组:硬膜下的BMSC移植细胞表组(细胞表组, ),BMSC细胞悬液髓内注射组(髓内注射组, ),和对照组( )。在移植过程中,老鼠麻醉如上所述。细胞表组,硬脑膜在SCI的纵向(图切割约2毫米1 (b)),和细胞表慢慢滑下硬脑膜(图1 (c))。然后缝合硬脑膜时以10 - 0的尼龙线(图1 (d))。髓内注射组, 细胞悬浮在生理盐水直接注入脊髓受伤1毫米的喙的网站使用立体定向仪(模型dki - 900;大卫·科夫仪器Tujunga, CA)32,33]。在对照组,只有硬脑膜切口进行以同样的方式,在细胞中单移植组,和硬脑膜缝合不移植细胞。

2.7。神经系统评分

蒙蔽独立观察员进行所有评估在两天1、7、14、21、28岁,35岁,42岁到49岁post-SCI损伤如前所述。(31日- - - - - -33]BBB后肢运动测试是评估来确定电动机赤字通过观察运动5分钟在一个开放的领域。冯·弗雷单丝测试(触摸测试感官评估者装备,Stoelting有限公司木材戴尔,IL)进行评估痛觉过敏的感觉障碍。短暂,老鼠被放置在地板上,冯·弗雷头发被用来评估神经性疼痛的阈值,以应对机械侮辱从0.008到300克后爪子和背树干表面,主要是尾巴基地。影响,诱导一个一致的快速回避行为(一个吓坏了的举动引起疼痛)和发声被认为撤军阈值。最小的影响后爪或树干造成撤军行动,在大多数情况下,树干,被认为是其阈值。老鼠与神经性疼痛反应甚至非常轻微的感觉,而正常老鼠常常忽略,不要移动低压触摸或缓慢推进高压刺激34]。动物死在研究时期被排除在分析之外。

2.8。SCI评价病灶体积

Hematoxylin-eosin染色的染色神经元和Luxol快蓝染色(局部反馈)髓鞘被用来估计SCI评价病灶体积,SCI后49天,之前报道(29日,31日]。牺牲的时候,老鼠与4.0 - -5.0%异氟烷麻醉深度N₂O / O₂(70:30),以避免痛苦。他们用生理盐水灌注transcardially(50毫升),其次是多聚甲醛(50毫升的4%)。脊髓(Th2-Th11)被固定在4°C 3天,多聚甲醛浸泡在脱钙液制成的PBS(-)含有50毫克/毫升EDTA / 2 na (349 - 01865、Dojindo、日本)和50毫克/毫升EDTA / 4 na(349 - 01885年,Dojindo,日本)14天。然后,块嵌入石蜡和矢状部分(10μ(4米厚)或横向部分μ米厚的)被安装到幻灯片为疣状。病变长度和体积进行评估(如前所述)(29日,31日,35]。脊髓的短暂,矢状部分被使用,和脊髓受伤的中心之间的距离和最尾和吻侧点决心中止的局部反馈染色半自动地分析了BZ-X分析仪(日本基恩士,大阪,日本)。分析了损伤体积以下公式: (H1是震中之间的长度和吻侧端,H2是震中和尾之间的长度,和是中心的直径)。

2.9。免疫组织化学

炎症是SCI后评估49天( 每个)使用的脊髓矢状部分。神经炎症检查基于Iba1和CD68分泌物,如前所报道(31日,37,38]。Anti-Iba1抗体(1:1500年在室温1小时,019 - 19741,Wako、日本)和anti-CD68抗体(1:1000年在室温1小时,MCA341GA, Bio-Rad)被用于免疫组织化学。主要抗体反应后,Histofine®简单染色鼠马克斯PO (Nichirei生物科学Inc .)是采用1小时。然后,民建联替代工具包(Nichirei生物科学Inc .)是按照制造商的指示使用。从peridamaged获得图像病变(5毫米吻侧和尾从受损病变的中心)。总共有五个不重叠的领域选择,细胞表现出积极信号是半定量的计算使用自动细胞计数软件(BZ-X分析器,日本基恩士,大阪,日本)。创伤后神经胶质疤痕形成使用矢状部分进行了分析;神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP);稀释1:200;BD生物科学,富兰克林湖,NJ)作为主要的抗体,Alexa萤石488(分子探针Inc .,尤金,或者美国)作为二级抗体。 Theμ阿片受体(铁道部;生成和天才的渡边正彦博士,札幌北海道大学(日本),39,40羟色胺转运体(计画;从渡边正彦博士生成和天赋,札幌北海道大学(日本),41)和降钙素相关基因肽(CGRP怎样;稀释,1:8000;σC8198),其次是488年Alexa萤石,被用来评估sensory-related突触和神经细胞。领域的计画、铁道部,CGRP-positive细胞脊髓背角的10毫米尾震中受伤的半自动地从横截面分析42]。考察了移植GFP-positive bmsc immunofluorescent染色使用初级兔单克隆抗体anti-GFP(稀释,1:75;2956年代;细胞信号技术、日本)和证实了双荧光免疫组织化学(26]。神经核抗原抗体(NeuN,稀释1:100;美国微孔,MAB377 Billerica的)被用来确定GFP-positive移植细胞的分化转移peridamaged周围区域。总共五个不重叠的病变的吻侧和尾受损区域是随机挑选的,所以和阳性细胞是半定量的计算。GFP-positive细胞的数量,以及双阳性NeuN和GFP的比率,计算如前所述[28]。

2.10。背侧皮质脊髓束的量化

评估的背侧皮质脊髓束(dCST),动物( 每个)使用SCI后49天如前所述[31日,32]。大鼠麻醉,中线切口伤口重新开放。一个10μl汉密尔顿注射器针头插入10毫米中心的吻侧损伤的深度1.5毫米到脊髓。Fluoro-Ruby (FR;2μl;10000分子量,d - 1817;分子探针,尤金或)被用作荧光示踪轴突和使用自动显微镜下注射泵注入脊髓0.5毫米中线两侧的侧脊髓/ 3分钟。针是保存在现场为3分钟,然后慢慢撤回最小化示踪剂泄漏。关闭皮肤后,动物们回到了笼子。五天后,老鼠牺牲的可视化残余dCST轴突。横向部分10毫米尾受伤部位的检查。dCST显示存在于腹侧背细绳的三分之一,双边和FR-labeled轴突的数量计算。

2.11。测量肝细胞生长因子(HGF)细胞的分泌能力表通过酶联免疫吸附试验(ELISA)

营养因子的分泌细胞表和干细胞进行评估调查治疗机制与轻微的修改(如前所述43]。细胞表准备如前所述,nonsheet细胞由简单地删除从MEM -抗坏血酸α;细胞表不能准备不抗坏血酸( )。经过18天的文化、媒介细胞表组更改为媒介没有抗坏血酸,和细胞表是一个额外的培养四天。nonsheet组准备介质,不含抗坏血酸,同样的持续时间。确认后产生的细胞表成功表组而不是nonsheet集团中收集了肝细胞生长因子(HGF)测量。HGF浓度(DBB00、研发系统、明尼阿波利斯、MN)使用酶联免疫试剂盒测定根据制造商的指示和分光光度计(型号550读者;Bio-Rad大力神,CA)。HGF的表达在中调整了每组细胞的总数。

2.12。统计分析

所有的数据收集,分析蒙蔽的方式。并给出了数据 (sem)。所有统计分析使用JMP Pro 14 (SAS研究所,Inc .,卡里NC)。两组之间的差异被一个未配对研究 - - - - - -测试或Mann-Whitney测试。三组之间的差异进行使用单因素方差分析(方差分析)其次是土耳其HSD测试或Steel-Dwass测试。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。BMSC细胞板改善功能性运动恢复和减弱痛觉过敏

细胞表组显示显著的运动功能恢复髓内注入和对照组相比,从移植后一周开始,而髓内注射组没有显示对照组相比显著复苏直到移植后6周(图2(一个))。此外,细胞板组有明显改善神经性疼痛阈值(痛觉过敏),移植后4周(图开始2 (b))。相反,髓内注射组和对照组相比没有任何改进。

3.2。电池片减少了SCI区域

与对照组相比,细胞板组显示显著减少损伤病变长度(数字3(一个)- - - - - -3 (d)(图)和损伤卷3 (e))决定停止侮辱的局部反馈染色7周( )。另一方面,髓内注射组显示统计损伤体积较小的病变长度,但没有差异与对照组相比。

3.3。细胞板变弱激活和炎症细胞的浸润在受伤部位

活化的小胶质细胞被Iba1染色SCI后7周检查的吻侧和尾部分科学中心(图4(一))。活化的小胶质细胞的数量在吻侧端显著低于细胞表组与对照组( ),而直接注射组显示更少的活化的小胶质细胞与对照组相比,但没有达到统计学意义(图4(一),2 - 4和4 (b))。虽然没有统计学意义,细胞板组显示更少的活化的小胶质细胞直接和对照组相比在尾的SCI(图4(一)、5 - 7、4 (c))。类似的结果也与巨噬细胞被CD68渗透染色观察,细胞板组的显示显著降低表达CD68-positive的巨噬细胞与对照组相比两边的病变的中心,而髓内注射组中发现没有区别(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。

3.4。细胞抑制轴突纤维胶质疤痕形成和保存

神经胶质疤痕与GFAP染色检查。细胞板组(图5(一个))明显下降GFAP-positive疤痕区域4毫米尾损伤中心和髓内注射组(图5 (b))也显示减少胶质疤痕而对照组(图5 (c); 细胞板组; 髓内针组)。分析了残余或再生轴突与FR染料染色。染料,注入的吻侧一侧脊髓受损,可以找到的尾侧脊髓受伤使一个监控交付的剩余或再生轴突染料通过受损的病变。FR-labeled轴突的数量在腹侧背细绳的三分之一dCST尾一侧是显著增加细胞表和髓内针组与对照组相比,表明干细胞可以保存或受损病变(图中脊髓轴突再生6 (d))。

3.5。细胞表保存了下行抑制系统和局部感觉神经疼痛

使用多个染色Sensory-related神经进行评估。细胞表保留铁道部的表达,表明当地感觉神经、脊髓背角的髓内注入和对照组相比(数字7(一)- - - - - -7 (e)),以及疼痛下行抑制系统的表达以计画染色(数字7 (f)- - - - - -7 (j))。另一方面,没有显著差异表达的外围输入神经,CGRP怎样,在组(数字7 (k)- - - - - -7 (o))。

3.6。移植细胞在脊髓和神经分化

组织学评价显示,移植细胞从细胞表和髓内注射组尾和吻侧的SCI病变(数字8(一个)- - - - - -8 (c)),而对照组没有GFP-positive细胞被发现。此外,大约40 - 50%的移植细胞从两组阳性神经元标记(NeuN)(数据8 (d)和8 (e))。

3.7。bmsc在细胞表显示HGF分泌能力高于相同数量的Nonsheet bmsc

电池片之间的功能差异和nonsheet细胞进一步检查营养因子的表达能力,HGF。是使用ELISA检测,胶质瘤的浓度和细胞的细胞表组发布更多HGF相比,相同数量的nonsheet细胞(图9)。

4所示。讨论

干细胞治疗被认为是能够改善甚至扭转SCI产生的损害。(36]虽然众多临床试验采用髓内或静脉注射方法与比较满意的检查结果(44,45),最有效和最小侵入性治疗方法仍有待确定。在这项研究中,我们能够表明硬膜下管理BMSC细胞表优于BMSC的髓内针,不仅恢复运动功能也减轻感官科学引起的干扰。此外,细胞表能够减少炎症和损伤体积和保护神经元轴突和网络。表似乎也表达大量的营养因素,细胞可以迁移到受损的脊髓,实现神经细胞表型。

SCI后神经性疼痛(痛觉过敏/触诱发痛)是一种严重的后遗症,影响病人的生命流动障碍和精神抑郁。虽然神经性疼痛的确切机制还没有完全阐明,过度的炎症介质,离子通道障碍,破坏下行antinociceptive血清素激活的束被认为是参与传入神经异常敏感(42,46]。我们以前报道,免疫抑制剂FTY720缓解神经性疼痛引起的SCI (31日),但缓解疼痛的程度更强时细胞表应用。此外,这个救援髓内注射组中尚未实现。鉴于FTY720已经被证明可以减少炎症细胞的聚集和脊髓,观察效果,在细胞表和髓内团体,上级回收率很可能在细胞表组是由一个不同的机制。除了免疫低下机制、干细胞被释放各种细胞因子和液保护受损的细胞或remyelinate神经纤维(36,47]。这些营养因素可能拯救当地环境和修复异常传入通路。这是证明的事实,当地(铁道部)和后代(http)痛抑制神经元,以及网络作为一个整体,提高了电池片移植,而外围C纤维。鉴于疼痛通路位于脊髓背角,植入细胞的表在这个位置提供了一个以最小的侵袭性治疗的反应。除此之外,有两个因素可以解释细胞表在细胞悬浮液的优越性在减少神经性疼痛。首先,细胞表能够产生大量的胶质瘤,营养因素对脊髓恢复至关重要,48而细胞悬液。许多营养因素已报告显示类似的分泌模式,因此,细胞板分泌其他因素,包括脑源性神经营养因子、TGF-b1,液,在大量改善炎症(43]。较高的营养因子分泌细胞表可以归因于细胞稳定;msc稳定通过整合蛋白有助于防止粘附基质细胞凋亡,所谓的女性(49]。大量的营养因素抑制局部炎症。第二,管理单元表脊髓损伤,避免直接注入本身会引起一定程度的机械损伤。很多报告显示针束损害和细胞道局部损伤大脑intraparenchymal移植动物模型(50,51]。避免额外的脊髓损伤是至关重要的,因为相比,脊髓的大小是有限的,大脑的。抑制疼痛的推广活动自愿后肢的运动,从而提高运动机能。

我们还发现,类似于髓内注射组,细胞的干细胞道表能够迁移到受损的脊髓和分化成适当的神经细胞表型。这表明细胞表一样有效的髓内注射提供细胞受损的神经组织。这一发现与先前的报道是一致的证明细胞具有较高的迁移能力转化为神经组织(28,50),道细胞促进轴突再生。事实上,在我们的研究中,细胞板和轴突的髓内注射组显示更高的数字dCST。除了直接神经转换,干细胞也可能支持当地的神经发生。静止的神经干细胞已报告的脊髓中央管周围本地化,和干细胞被激活了它们的增殖52]。然而,复苏的精确机制需要进一步检查因为相同级别的细胞移植细胞表和直接注射组之间发生,但经济复苏是更好的电池片组。这可能归因于营养因素更为敏感的复苏的损害。

有趣的是,我们发现细胞表发布大量的营养因子nonsheet相比胶质瘤细胞。HGF报道是最重要的一个神经营养因子负责神经复苏SCI (48]。我们的结果符合Bou-Ghannam等人最近的一份报告显示,细胞表由相同的材料产生了大量的营养因子和抗炎细胞因子,包括胶质瘤血管内皮生长因子、白细胞介素- 10”,相比noncell单层板(53]。BMSC的粘附细胞需要附件周围的表面,和细胞表使这些细胞强烈锚,可能通过整合素连接。然而,我们获得的数据在体外实验,进一步检查需要阐明的功能和机制活动的营养因子和抗炎细胞因子在活的有机体内研究。

这项研究有一些局限性。首先,我们没有检查细胞剂量和治疗效果之间的关系,这是至关重要的,以确定在临床试验中使用的协议。鉴于大鼠硬膜下空间有限,很难多个细胞表陷入这一领域。未来的研究使用大型动物克服这种限制是必要的。第二,不同的时间课程和测试方法没有充分地分析。我们应用细胞表老鼠SCI后1周,这似乎是亚急性阶段;然而,神经性疼痛可能发生几个月后人类的伤害。因此,慢性疼痛的评估模型需要SCI后至少一个月;这是小动物的技术难度与严重的粘连。第三,而细胞表描述能力强抑制神经性疼痛,使用其他方法的感官测试可能会加强我们的数据。 However, there are currently no established sensory testing techniques, other than the one we adopted, to monitor neuropathic pain in rodent models. Fourth, the control groups did not completely compare with each other. Herein, we adopted three different groups: subdural administration, intraspinal injection, and sham surgery, a group that mimics subdural administration. However, the cell sheet and control groups did not receive intraspinal injections of saline or medium, and the intraspinal group was not injected with subdural nonlive cell sheets, which can elucidate the effects of intraspinal damage and sheet directly. We have previously reported that the effects of intraspinal injection of the cell suspension were superior to that of the cell medium [32),但细胞的影响表不使用活细胞不可能产生的。

5。结论

总之,BMSC细胞表能够缓解神经性疼痛和促进运动恢复通过多种机制,包括抗炎效果,小神经胶质过多症的发展,和保存的疼痛抑制通路,而髓内针。总的来说,这些结果表明,细胞片移植是一个良好的细胞交付SCI和治疗选择,尤其是减少神经性疼痛。

数据可用性

使用的实验数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者没有直接的利益冲突有关这篇文章的内容。

确认

这项研究是由日本医学研究和开发署(艾湄湾)(批准号JP17bk0104045),日本社会科学,促进和Fujita纪念基金用于医学研究。

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