表面改性与NGF-Loaded壳聚糖/肝素纳米粒子改善心血管支架的生物相容性

文摘

晚期血栓形成和再狭窄药物洗脱支架的安全性仍然是主要的挑战。摘要修改赋予表面选择性的抗凝、促进内皮再生最近成为一个火锅。在这项研究中,发现壳聚糖和肝素形成三维纳米粒子的自发的静电相互作用。基于特定的绑定属性之间的肝素和神经生长因子(神经生长因子),一种新型的NGF-loaded肝素/壳聚糖纳米粒子表面改性的构造。材料表征的结果表明,纳米颗粒被成功固定表面的材料。体外血液相容性和内皮细胞相容性试验显示修改后的表面可以选择性地抑制血小板粘附和平滑肌细胞overproliferation,同时加速药物通过促进内皮细胞增殖,提高内皮祖细胞的动员。

1。介绍

经皮冠状动脉介入通过使用药物洗脱支架(DES)系统是治疗心血管疾病的主要方法。通常,DES主要由金属支架、抗增殖药物(雷帕霉素、紫杉醇等)和聚合物涂料。然而,由于聚合物的生物相容性不足和抗增殖药物的特异性的影响,推迟内皮愈合和慢性炎症支架植入术后可能发生的风险,提高晚期支架内血栓和再狭窄1]。在这方面,研究者建议摘要修改的血管支架表面可能有助于改善生物相容性,降低术后并发症的发生率。

血管内皮细胞是血液和血管组织之间的天然屏障,介导的代谢药物在血液与组织间的交换,可以合成多种生物活性物质,以确保正常的收缩和舒张血管以及抑制血液凝固和维护平滑肌细胞的生物学功能(2,3]。因此,人们普遍认为在支架表面迅速形成一个完整的内皮细胞层将是一个理想的方式来减少移植后并发症的风险(4]。自从发现内皮祖细胞(EPC),血管内皮损伤后再生和愈合的机制已被重新定义为欧共体联合行动,周围血管组织和EPC增殖和迁移从骨髓动员和归航。药物的过程在活的有机体内很大程度上取决于细胞因子和细胞外基质蛋白的有序协同效应对ECs和内皮祖细胞(5,6]。因此,各种细胞因子和粘附蛋白包括VEGF (7],SDF-1 [8)、层粘连蛋白(9),胶原蛋白(10),纤连蛋白(11)被纳入材料表面加速药物。然而,随着生物活性大分子,蛋白质和细胞因子半衰期较短在活的有机体内以及如何预防快速失活的生物大分子在活的有机体内依然有问题,迫切需要解决。

近年来,多功能纳米颗粒系统显示巨大的潜力在控制生物分子的释放和调节血管细胞的行为。与其它控制释放系统相比,纳米颗粒系统的独特nanoeffect大大增加药物装载能力,可以独立的活跃分子从周围的环境以避免快速失活。在这方面,研究者们提出了构建摘要nanocoating表面三维结构心血管材料来提高生物分子的生物活性和延长作用时间,从而达到长期、有效监管的血管内生物反应(12]。周et al。13)共价固定化VEGF-loaded聚已酸内酯(PCL)纳米粒子在非细胞支架,发现nanocoating可以显著减少生物分子的突然释放,促进材料表面的药物。穆罕默迪et al。14]介绍了肝素/壳聚糖纳米粒子表面阳极氧化镍钛合金和证明了nanocoating可以提高表面的血液相容性,通过控制生物分子释放内皮细胞相容性。在我们之前的研究中,一种新颖的肝素/ poly-l-lysine支架表面改性纳米粒子构建。我们证明了这种nanocoating可以有效抑制血液凝固,减少再狭窄的发生(15,16]。然而,一些缺陷如内皮细胞相容性差和高分子量的重要细胞毒性poly-l-lysine继续解决。

在这项研究中,一种新型的肝素/壳聚糖纳米粒子含有神经生长因子(神经生长因子)是专为心血管材料的表面改性。壳聚糖(CHS)是一种天然polycationic多糖,具有良好的抗菌功能,促进损伤修复,减少炎症反应。此外,CHS也是最常用的药物载体由于其显著的优点,如生物相容性,生物降解能力,易于化学改性的特点(17,18]。神经生长因子是一种重要的神经营养因子,它扮演着一个重要的角色在维持血管内皮组织的正常功能(19]。研究表明,神经生长因子可促进血管内皮祖细胞的动员和导航(epc),显示可能加速血管内皮损伤的修复(20.,21]。神经生长因子也是heparin-binding蛋白质;在这项研究中,神经生长因子是加载到肝素/壳聚糖纳米粒子通过特定的神经生长因子之间的相互作用和肝素改善细胞相容性和加速药物。根据一系列的材料特性,在体外血液相容性和细胞相容性评价,本研究证明,纳米粒子的表面改性可以有效地改善材料的抗凝性能和加速内皮再生。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

316 l不锈钢(316 l SS)加工成圆形(Φ10毫米~ 1.2毫米厚度)和镜面抛光。多巴胺(DA)、甲苯胺蓝O(31)和肝素(玫瑰)从Sigma-Aldrich购买。壳聚糖(CHS, ),罗丹明123年,阿尔新蓝购自上海阿拉丁生物化学科技有限公司有限公司

2.2。CHS /玫瑰Nanocoating建设

首先,一定量的CHS和玫瑰粉溶解在0.1 M乙酸/醋酸钠缓冲液( ),分别。然后,相同体积的CHS是一滴一滴地添加到消息灵通的溶液(浓度比率1毫克/毫升:7.5毫克/毫升)在室温下磁力搅拌下获得CHS /消息灵通的纳米颗粒悬浮。CHS / Hep@NGF纳米颗粒制备、15毫克/毫升玫瑰首先与相同体积的200 ng / ml神经生长因子混合解决方案获得Hep@NGF混合物。polydopamine涂层表面制备了316 l SS(称为SS-DA)根据描述的方法在我们以前的工作(16]。之后,SS-DA沉浸在0.5毫升CHS /玫瑰或CHS / Hep@NGF纳米颗粒悬浮和在室温下孵化轻轻摇晃12 h收购nanocoating(称为SS-DA-NP或SS-DA-NP@NGF)。

2.3。大小和电动电势测定

平均尺寸和粒子分散指数(PDI)以及法制备的纳米颗粒的电动电势测定动态光散射(DLS)使用ZETA-SIZER莫尔文Nano-2S90(英国莫尔文莫尔文有限公司)。

2.4。FTIR和XPS分析

傅里叶变换红外光谱(FTIR)和x射线光电子能谱(XPS)是用于检测表面化学结构的改变和元素组成在纳米粒子固定。那些时光IS20红外光谱分析是进行Nicolet红外光谱仪(美国热)使用衰减全反射的模型。红外吸附4000至650厘米⁻¹在室温下被记录。XPS分析是由使用VGESCALAB MK II光谱仪和单色Mg Ka x射线源(1253.6 eV)。测试室的压力设置为 。结合能的规模是引用通过调整c1峰在284.6 eV。

2.5。AFM分析

NP改性后表面形貌的改变是由原子力显微镜(AFM)(被Nano-Instruments CSPM 6000年,中国)在利用模型在室温下使用CSPM成像仪与后续的图像分析软件。AFM分析,样本之前仔细冲洗两次水和表面吹干。

2.6。水接触角测定

样品的亲水性是由测量静态水接触角使用克鲁斯GmbH DSA100可在室温下2测角仪。滴的水被加入到干表面,然后,接触角的计算是一个圆DSA 1.8软件的部分功能。至少有三个不同的网站被纳入为每个样品测量。

2.7。定量表征的玫瑰和胺组

暴露的密度胺组和肝素是由二酸橙(AO II)和数据分析,分别。具体方法是根据我们之前的研究16]。

2.8。体外血液相容性评价

新鲜全血从一个健康志愿者实际上与柠檬酸钠(3.8 wt. %) 9: 1和离心机在1500 rpm 15分钟获得富含血小板血浆(PRP)。接下来,50μl PRP被添加到每个样品表面和孵化2 h的37°C。随后,样本轻轻冲洗用生理盐水和用于形态学观察、乳酸脱氢酶(LDH)释放,和P-selectin表达测定。具体方法是根据我们之前的研究15]。

2.9。体外细胞相容性评价

2.9.1。EC和SMC增殖试验

内皮细胞(ECs)被孤立在DMEM / F12培养基培养人脐静脉和含15%胎牛血清的边后卫和20μg / ml内皮细胞生长(ecg)的补充。平滑肌细胞(smc)被孤立在DMEM / F12培养基培养人脐动脉和(高葡萄糖)包含10%的边后卫。细胞播种之前,dopamine-coated样本被高压灭菌、消毒和随后nanocoating建设在无菌条件下进行。

细胞增殖测定,ECs或smc被播种在每个样品的表面的密度 细胞/厘米²和孵化37°C下5%的股份有限公司₂1天,3天。在每个时间点,上层清液被删除了,500μl新鲜培养基含有10% CCK-8试剂添加和孵化4 h。然后,200年μl培养基被转移到一个96孔板,在450 nm和吸光度测定。样本与生理盐水轻轻冲洗和固定在2.5%戊二醛在室温下至少6小时。随后,50μl罗丹明123的解决方案是添加到每个样本和孵化的表面在室温下30分钟。最后,样本被彻底的形态学与生理盐水冲洗附着ECs被倒置荧光显微镜观察。

2.9.2。EPC动员和导航

内皮祖细胞的动员和归巢行为引起的材料表面的纳米涂层,研究了体外transwell室方法被刘et al。22]。在细节,3毫升新鲜培养基(αmem培养基含有10%的边后卫)被添加到6-well板,然后2毫升EPC悬浮液的密度 细胞/毫升加入6-well底膜孔径的微孔transwell室8μm。在37°C 2小时孵化后,消毒样本的大小 沉浸在6-well板的媒介,在37°C培养24小时。之后,transwell室与生理盐水轻轻冲洗,然后固定在90%乙醇溶液在室温下30分钟。上层的细胞室的湿棉签擦拭,和室放置在0.1%结晶紫溶液在室温下和彩色15分钟。细胞动员的底层室是一个倒置显微镜下观察。

2.10。统计分析

所有的生物实验进行至少三次。统计数据使用SPSS 22.0软件进行了分析。统计评估数据进行使用单向方差分析。的概率值 被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。大小和Zeta NPs的潜力

如表所示1的平均粒径CHS / Hep@NGF ( )相比略减少CHS /玫瑰( ),这表明,神经生长因子的结合可能增强纳米粒子的密实度。ζ电位的绝对值的CHS /玫瑰和CHS / Hep@NGF大于20 mV,表明粒子系统有足够的稳定,以避免引起的沉降粒子聚集。此外,PDI (CHS的粒子分散指数)/玫瑰和CHS / Hep@NGF小于0.2,表明纳米颗粒有良好的准备大小均匀。

3.2。FTIR和XPS

摘要红外光谱和XPS是用来检测化学组和元素组成的变化前后材料表面NPs的固定。如图1(一),达到1600厘米¹SS-DA光谱代表C = C苯环的债券,达到1502厘米¹代表了苯环的债券。新的吸收峰出现在红外光谱CHS /玫瑰NP-modified样本。其中,峰值为1630厘米¹和1520厘米¹指酰胺我带的拉伸振动和二酰胺乐队。这些山峰主要来源于酰胺和胺在壳聚糖分子。此外,振动的峰值C-O-C债券可以观察到1062厘米¹,这表明肝素的存在。

根据XPS结果(图1 (b)),发现s2的吸收峰,S2p可以观察到的光谱SS-DA-NP SS-DA-NP@NGF,这表明肝素的存在。基本计算结果(表2)进一步证明了神经生长因子的结合可能大幅增加N元素的内容,虽然年代元素内容的减少可能与神经生长因子之间的相互作用所造成的空间屏蔽效应和消息灵通的。总之,上述结果表明,CHS /玫瑰和CHS / Hep@NGF NPs成功固定表面的材料。

3.3。NP-Modified表面的形态

表面形态的变化不同的AFM标本进行检测。如图2,很少数量的粒子表面可以观察到SS-DA,期间可能产生多巴胺的聚合。大量的纳米粒子出现在样品的表面改性的CHS /玫瑰和CHS / Hep@NGF NPs,和粒度在100到200纳米的范围,这与粒度检测的结果是相一致的。此外,纳米粒子表面均匀分布的样本,且没有明显的粒子聚集。

3.4。表面亲水性表征结果

如图3(一个)的水接触角SS-DA显然是与316年相比增加l SS,这主要是由于苯环的多巴胺涂层疏水结构。CHS的固定/消息灵通的纳米颗粒显著提高表面亲水性,主要是由于丰富的氨基等亲水集团,羧基、羟基、磺酸集团在壳聚糖和肝素分子。神经生长因子的结合到纳米颗粒水接触角略有增加,这可能与疏水基的暴露在蛋白质结构。

表面亲水性的变化可能改变蛋白质吸附类型和构象,然后影响其生物相容性。一般来说,高的表面疏水性(水接触 )可能会引发不可逆吸附的蛋白质并摧毁它的构象,而高亲水性的表面(水接触 )表面会形成水膜,导致蛋白质解吸(23]。在这项研究中,NP-modified表面的水接触角的范围在40°60°,这可能促进胶血浆蛋白的吸附,从而提高细胞的相容性。

3.5。肝素的定量表征和胺组

图3 (b)显示肝素的定量表征结果NP-modified表面,SS-DA设置为空白的控制。根据计算,曝光SS-DA-NP肝素是密度 ,虽然SS-DA-NP@NGF-modified表面轻微增加( )。这可能是由于氨基密度的增加合并后神经生长因子(图3 (c)),这可能促进多巴胺涂层的纳米颗粒的共价结合。

肝素是一种负电荷多糖抗凝性能优异。先前的研究表明,肝素暴露密度3 - 7的范围μ克/厘米²可能有助于改善材料表面的血液相容性,防止炎症反应的发生,促进内皮细胞层的治疗(15]。

3.6。体外血液相容性评价

图4(一)荧光染色结果显示血小板坚持2小时体外的材料表面。结果显示,大量的血小板表面观察316 l SS和SS-DA,认真和坚持血小板聚集,表示严重的激活和血液相容性。相比之下,血小板的粘附密度SS-DA-NP和SS-DA-NP@NGF表面大大减少,和粘附血小板主要显示圆形,几乎没有变形和虚足,这表明,纳米颗粒可以有效地减少血小板的活化,提高不够。LDH释放(图的结果4 (b)(图)和P-selectin表达式4 (c))进一步证明了CHS /消息灵通的纳米粒子的表面改性可以显著降低血小板的粘附和激活( )。虽然神经生长因子的结合增加了血小板粘附密度在某种程度上,它仍然显示良好的抗凝属性与316 l SS和SS-DA相比。

3.7。体外细胞相容性评价

图5(一个)荧光染色结果显示血管内皮细胞培养在不同样品表面一段时间了。结果表明,1和3天后文化、附着内皮细胞表面的316 l不锈钢和SS-DA显示典型的鹅卵石形态,表明细胞的生物学功能是正常的。然而SS-DA-NP表面,ECs展览收缩或圆形形态,这表示可怜的细胞粘附和增殖活动。相比之下,SS-DA-NP@NGF表面内皮细胞的形态正常,粘附密度是316 l不锈钢和SS-DA相似。CCK-8结果(图5 (b))SS-DA-NP表面上进一步证明了细胞增殖活动明显减少,但显示SS-DA-NP@NGF表面上没有明显的改变。

ECs的类似SS-DA-NP表面粘附密度和smc增殖活动与316年相比显著降低l SS和SS-DA(数据5 (c)和5 (d))。然而,尽管整合传播的神经生长因子促进粘附smc在某种程度上(图5 (c)),增殖活性显著降低( )相比之下,316 l不锈钢和SS-DA(图5 (d))。

体外cytocompatibility评价的结果表明,表面改性CHS /消息灵通的纳米颗粒是不利于ECs和smc的粘附和生长,这主要是与肝素分子在细胞增殖的抑制作用24- - - - - -26]。神经生长因子的引入改进了两种细胞的粘附和增殖行为在某种程度上,但不同细胞的增强程度是不同的。一般来说,SS-DA-NP@NGF显示表面的选择性的影响促进内皮细胞的生长和抑制平滑肌细胞的增殖。

3.8。EPC动员和导航

如图6,SS-DA-NP@NGF显著对内皮祖细胞趋化作用影响transwell室。细胞培养24小时后,内皮祖细胞的数量通过半透膜底部的底部室显著高于SS-DA SS-DA-NP对照组。结晶紫染色结果表明,内皮祖细胞趋化,SS-DA-NP@NGF显示良好的形态、增殖和细胞扩散和覆盖面积也明显高于对照组。结果表明,SS-DA-NP@NGF提供足够的容量来诱导内皮祖细胞的动员和归巢到材料表面。

总之,自从发现内皮祖细胞,血管内皮损伤愈合的机制已经重新定义了基于ECs周围血管组织的迁移和EPC在受伤部位归巢27]。虽然表面改性壳聚糖/肝素NPs显示优良的血液相容性和抑制平滑肌细胞的生长的能力,足够的财产在促进内皮损伤的修复仍然是有问题的。神经生长因子是一种生长因子,据报道刺激HUVEC增殖和诱导EPC动员和导航21,28,29日]。在这项研究中,人们发现NGF-loaded NPs能有效地提高ECs的粘附和增殖活动在样品表面,表现出强烈的对血管内皮祖细胞趋化现象的影响,表明NGF-loaded nanocoating可以选择性地抑制凝血和内膜的增生,而加速内皮再生。

4所示。结论

在这项研究中,CHS / Hep@NGF NPs成功由壳聚糖之间的静电相互作用,肝素钠,层粘连蛋白和表面的固定化dopamine-coated不锈钢。材料表征结果表明,NPs均匀固定在材料表面。生物评价结果表明,改性表面显示良好的抑制血小板粘附和激活的能力,有助于提高电子商务增长和防止SMC overproliferation。这项工作有可能申请polymer-free冠状动脉支架涂层的设计。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称,他们没有利益冲突。

作者的贡献

海鑫吴歌,道本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

作者承认研究的财政支持浙江省自然科学基金的基金(LQ20H170002)和中国国家自然科学基金(32071329)。

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