通过调制Wnt Chaetocin促进成骨分化/β-连环蛋白信号在间充质干细胞

文摘

间充质细胞stemXin (msc)是一个伟大的骨再生的细胞来源。虽然MSC与生长因子和支架相结合提供了一个有用的临床策略为骨组织工程,MSC成骨分化的效率还有待提高。表观遗传修饰与msc在成骨诱导分化能力。在这项研究中,我们评估Chaetocin的影响,lysine-specific组蛋白甲基转移酶的抑制剂,在msc的分化。我们发现,msc治疗Chaetocin证明增加成骨的能力和减少脂肪形成的能力。成骨的标记的表达(Runx2和OPN)在由Chaetocin msc诱导成骨的归纳。Moveover,在msc治疗Chaetocin提高Wnt /β连环蛋白信号通路及其下游目标。最后,我们表明MSC和Wnt /骨形成增加的β连环蛋白信号活动治疗Chaetocin使用体内骨形成化验。我们的数据揭示了一个关键的角色在MSC Chaetocin成骨分化和提供新的见解骨组织再生和修复。

1。介绍

骨折愈合是一个复杂的过程,并不完全令人满意。严重损伤后修复骨组织再生医学的一个巨大挑战。越来越多的证据表明,间充质干细胞(msc)显示巨大的体外扩张潜力和分化特性,使他们有吸引力的骨组织工程的工具。(1,2)实现更好的成骨分化功效是MSCs-based骨再生领域的中心目标。msc血统的机制控制的承诺是由多个因素,包括生长因子、转录因子和表观遗传因素。(3,4特别是],大多数酶表观遗传因素,使它们适合药物干预的目标。DNA甲基化和组蛋白修饰的主要表观遗传调控机制。(5]

Runt-related活性的转录因子2 (Runx2) (6),主调节器的成骨分化,可以由表观遗传因素。例如,DNA甲基化和乙酰化组蛋白H3和H4地位的促进骨钙素(OCN),港口Runx2的结合位点,可以改变的可访问性Runx2的启动子。(7,8)的一项研究表明,治疗5-aza-2 DNA-demethylating代理 - - - - - -脱氧胞苷和chromatin-acetylation代理trichostatin人为msc导致脂肪细胞的分化。(9]

组蛋白甲基化过程中有着重要的作用,建立和维护稳定的基因表达模式在细胞分化和胚胎发育。(10)组蛋白demethylases KDM4B和KDM6B是必不可少的成骨的承诺通过H3K9me3 msc和H3K27me3修改,建议一个有前途的战略,通过操纵提高成骨分化的表观遗传因素。(3]然而,lysine-specific组蛋白甲基转移酶的抑制效果msc分化没有被探索。Chaetocin是一种真菌霉菌毒素隔绝毛壳菌属minutum和lysine-specific组蛋白甲基转移酶的抑制剂,包括SUV39H1和G9a。(11,12)已经表明,抑制H3K9me3-specific甲基转移酶由Chaetocin ROS-dependent方式可以防止细胞生长。(13]然而,其潜在的对MSC分化的影响还不太清楚。

评估的影响Chaetocin msc分化,我们对待mouse-derived msc Chaetocin和检查了他们的成骨的脂肪形成的属性。我们也检查了表达成骨的标记(Runx2和OPN)和脂肪形成的标记(Pparg和Fabp4)在分化诱导。我们的研究结果表明,Chaetocin促进成骨分化但抑制脂肪形成的msc分化。此外,在msc治疗Chaetocin增加Wnt /β连环蛋白的活动。最后,我们表明,骨形成的MSC可以增强体内Chaetocin待遇。我们的数据揭示了一个关键的角色在MSC Chaetocin成骨分化,为骨组织工程提供新的见解。

2。材料和方法

2.1。道德

所有实验协议和程序批准口腔科,深圳的第七人民医院(协议编号2018021001)。依照e-Guidelines动物过程进行了实验动物保健和使用的口腔科,深圳的第七人民医院。

2.2。MSC隔离和文化

从股骨和胫骨骨髓msc的成年c57bl / 6小鼠如前所述。(14)细胞培养α最小基本介质(αmem;热费希尔科学,与10%胎牛血清(中国)补充的边后卫;Gibco,中国)和100μg / ml penicillin-streptomycin (Gibco中国)在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂在37°C。Chaetocin实验,5μ使用M Chaetocin(谢立克,中国)。DMSO作为控制。

2.3。成骨细胞分化和msc的分析

msc被镀到6-well板块到达~ 80%融合。然后生长介质改为成骨细胞诱导介质(OIM)。OIM是由high-glucose DMEM谷酰胺(热费希尔科学、中国),10%的边后卫(Gibco,中国),100年μg / ml青霉素和链霉素(Gibco,中国),β甘油磷酸酯10毫米(西格玛奥德里奇,中国),2.5μg / ml抗坏血acid-2-phosphate(西格玛奥德里奇,中国),2.5μg / ml两性霉素B(西格玛奥德里奇,中国)和0.1μM地塞米松(西格玛奥德里奇,中国)。对碱性磷酸酶(ALP)染色,msc在OIM培养7天第一次在10%福尔马林固定的1 h在室温下然后染色使用高山染色工具包(西格玛奥德里奇,中国)根据制造商的指示。高山活动评估使用碱性磷酸酶活性检测设备(Yeasen,中国)根据制造商的协议。茜素红S (ARS)染色,msc在OIM培养14天染色1% ARS 20分钟的解决方案。

2.4。脂肪形成的msc分化和分析

msc被镀到6-well板块到达~ 80%融合。生长培养基就变成脂肪形成的分化培养基含有10μg / ml胰岛素(西格玛奥德里奇,中国),1μM地塞米松(西格玛奥德里奇,中国),和500年μM IBMX(西格玛奥德里奇,中国)。分化msc首次与10%福尔马林溶液固定30分钟然后用0.3%油红O染色溶液10分钟。

2.5。MSC-Mediated异位骨形成

msc与40涨跌互现μg(磷酸三钙/羟磷灰石(TCP /公顷)粉(Sigma-Aldrich,中国)和皮下注射到老鼠裸体(昆明模型动物中心,中国)。小鼠随机分成两组各8动物,管理和DMSO溶液或Chaetocin(0.5毫克/公斤体重),腹腔内每隔一天。组织被收获42天进行组织学分析。脱水和嵌入在石蜡组织块。嵌入组织块切成5μ米厚度和苏木精和伊红染色法染色方案。部分脱水,permeabilized和密封。部分在显微镜下观察并拍照。

2.6。实时定量逆转录PCR(存在)

从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体,中国)根据制造商的指示。使用1逆转录执行μ使用MultiScribe g的RNA逆转录酶工具包(应用生物系统公司、中国)根据制造商的指示。存在,SYBR绿色装备(Bio-Rad实验室有限公司,中国)使用根据制造商的指示。GAPDH是作为内部控制。的引物序列中存在表中列出1。

2.7。免疫印迹分析

使用核细胞细胞溶解提取工具包(罗福斯生物制剂,中国)收集核蛋白质。样本用于电泳分离,然后转移到硝化纤维膜。阻塞后5%的牛奶在室温下2小时,增加了膜的主要抗体β连环蛋白(Abcam,中国),组蛋白H1 (Abcam,中国),Axin2 (Abcam,中国),Myc(研发系统,中国),Ccnd1(美国圣克鲁斯生物技术)和GAPDH(σ,中国)一夜之间在4°C。之后,膜与二次孵化抗体(Abcam,中国)为1小时37°C。膜被完全沉浸在增强化学发光(Yeasen,中国)来获取图像。

2.8。统计分析

所有数据被当作南达科他州均值±。学生的 - - - - - -测试是使用两组之间差异被认为是具有统计学意义,P < 0.05。所有统计分析使用SPSS 16.0软件进行了分析。

3所示。结果

3.1。Chaetocin促进成骨分化的msc

组蛋白甲基化状态起着至关重要的作用在调节染色质结构变化,并确定的可访问性相关基因启动子转录因子在MSC分化。以确定的影响组蛋白甲基转移酶抑制剂Chaetocin成骨分化,我们首先检查osteogenesis-related基因的表达在成骨诱导msc(数字1(一)和1 (b))。相比于控制msc、mRNA的表达Runx2和OPN在细胞治疗调节Chaetocin在第三天,7和14(数据吗1(一)和1 (b))。我们进一步探讨Chaetocin对成骨分化的影响通过执行高山染色和ARS染色检测高山活动和矿化(数据1 (c)和1 (d))。控制相比,高山活动和矿化在msc Chaetocin处理显著增加(数据1 (c)和1 (d))。因此,治疗Chaetocin可以促进成骨分化的msc。

3.2。Chaetocin抑制脂肪形成的msc分化

之前的研究表明,msc与多个血统相关联,包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。协会的msc与脂肪细胞导致骨量之间的不平衡和脂肪和骨折的风险增加。因此,我们试图探讨msc的Chaetocin对脂肪形成的分化的影响。相比控制msc、adipogenesis-related基因的mRNA表达,Pparg和Fabp4大幅减少,msc治疗Chaetocin(数字2(一个)和2 (b))。此外,油红O染色结果表明,油滴形成显著抑制msc Chaetocin处理(数据2 (c)和2 (d))。因此,治疗Chaetocin可以抑制脂肪形成的msc。

3.3。Chaetocin激活Wnt /β连环蛋白成骨诱导期间活动

正如我们显示Chaetocin抑制脂肪形成的基因而促进成骨的基因表达。似乎Chaetocin不一定直接调节H3K9me3水平的这些特定的基因。因为Wnt /β连环蛋白活动已知名的功能在msc促进骨生成和抑制脂肪生成,我们推断Chaetocin可能调节Wnt /β连环蛋白信号转导在msc。的确,我们的免疫印迹结果表明,核的水平β连环蛋白在msc治疗Chaetocin较高而控制msc(图3(一个))。Wnt /的信使rna表达水平β连环蛋白目标基因(Ccnd1,Axin2,Myc,Dkk1)也被增加在msc Chaetocin处理(图3 (b)),这表明Chaetocin Wnt /β连环蛋白信号转导。

3.4。Chaetocin促进体内异位成骨

确定Chaetocin可以扮演一个角色在MSC-mediated体内骨形成,msc与TCP /公顷和混合注入裸小鼠。老鼠然后处理控制车辆或Chaetocin 6周和牺牲样本集合。他染色(图4(一))显示,对照组和实验组显示osteoblast-like细胞被发现。量化的骨区域显示,治疗Chaetocin导致体内骨组织的增加(图4 (b))。此外,我们的免疫组织化学染色β连环蛋白结果证实核的存在β在样例接受Chaetocin连环蛋白信号。总的来说,我们的数据表明,Chaetocin可以提高MSC-based骨形成。

4所示。讨论

msc具有多种分化潜能,可以诱导分化成两个相互排斥的血统:成骨细胞和脂肪细胞。(15)如何更有效地诱导msc成成骨细胞已经在骨组织工程中一个重大的挑战。之前的研究表明,组蛋白甲基化参与MSC分化。例如,KDM4B和KDM6B MSC细胞命运中发挥了关键作用的承诺通过移除H3K9me3和H3K27me3 lineage-specific基因的不同。(3]此外,H3K27甲基转移酶抑制需要EZH2 MSC分化。(16]Chaetocin最初发现组蛋白甲基转移酶的抑制剂(VAR) 3 - 9。(11]Chaetocin抗癌治疗的角色已经深入研究;然而,它的功能在msc分化没有被探索。

在这项研究中,我们发现Chaetocin会影响成骨的msc和脂肪形成的能力。治疗Chaetocin促进了msc和诱导的成骨分化osteogenic-related基因的表达。相反,Chaetocin压抑msc的脂肪形成的分化和减少油滴的数量。Chaetocin可以抑制组蛋白甲基转移酶的活性SUV39家庭,比如SUV39H1 G9a, H3K9 di - tri-methylation所需和mono - dimethylation H3K9的分别。(17,18]尽管Chaetocin的具体分子机制可能影响MSC骨生成脂肪生成并不是在最近的研究中,特征可能是高度MSC分化受Chaetocin介导通过H3K9甲基化状态的改变。此外,Chaetocin如何发挥不同的功能在不同的上下文中也难以捉摸,我们推测,Chaetocin会影响骨的,通过Wnt / adipolineage承诺β连环蛋白的活动,而不是直接的监管这些血统因素。

我们的数据还显示,在msc治疗Chaetocin提升Wnt /β连环蛋白的活动。有趣的是,一些组蛋白demethylases与Wnt /β连环蛋白的活动。例如,KDM7A可以调节脂肪形成的,通过调节Wnt /成骨分化β连环蛋白信号。(19此外,JMJD2D可以与之交互β连环蛋白激活靶基因的转录。(20.]因此,Chaetocin-mediated可能抑制组蛋白甲基转移酶参与Wnt /β连环蛋白信号。事实上,我们的细胞培养试验和体内骨形成实验表明Wnt /β当接受Chaetocin连环蛋白被激活。有人猜测如果Chaetocin可用于骨质疏松症患者改善骨质的形成。

总之,我们证明Chaetocin治疗可以改善通过表观遗传调控msc的骨生成。我们的研究提供有用的见解为更好的探索Chaetocin骨组织工程的使用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由深圳的科技项目(JCYJ20180302144621755)。

引用

1. a . Oryan卡马利a也展示、a . Moshiri和e . m . Baghaban“间充质干细胞在骨再生医学的作用:证据是什么?”细胞、组织、器官,卷204,不。2,59 - 83年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. c .赵曾z: t Qazvini et al .,“Thermoresponsive Citrate-Based石墨烯氧化物脚手架提高骨再生从BMP9-Stimulated脂肪间充质干细胞,”ACS生物材料科学与工程,4卷,不。8,2943 - 2955年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. z l .你们粉丝,b . Yu et al .,“组蛋白demethylases KDM4B KDM6B促进成骨分化的人类msc,”细胞干细胞,11卷,不。1、50 - 61年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s . g . Almalki和d . k . Agrawal关键转录因子间充质干细胞的分化,“分化,卷92,不。1 - 2,41-51,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. c . m . Teven x刘:胡et al .,“间充质干细胞的表观遗传调控:关注分化成骨、脂肪形成的,“干细胞国际ID 201371条,卷。2011年,18页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 小森,“Runx2的骨骼发展的角色,”实验医学和生物学的发展卷,962年,第93 - 83页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. a . Villagra j·古铁雷斯,裴瑞兹r . et al .,“减少CpG甲基化与转录激活特异性鼠成骨细胞骨钙素基因,”细胞生物化学杂志》上,卷85,不。1,第122 - 112页,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j .沈h . Hovhannisyan j·b·丽安et al .,“骨钙素基因的转录诱导成骨细胞分化过程中包括乙酰化组蛋白h3和h4,”分子内分泌学,17卷,不。4、743 - 756年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j . Zych m·A . Stimamiglio a.c. Senegaglia et al .,“表观遗传修饰符5-aza-2的脱氧胞苷和trichostatin人类间充质干细胞的影响脂肪细胞的分化,“巴西医学和生物学研究杂志》上,46卷,不。5,405 - 416年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. d·杨,b、h .太阳l .秋”的角色组蛋白Demethylase Jmjd3在成骨细胞分化和凋亡,”临床医学杂志》第六卷,没有。3、2017年p。24日。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 格林尼d . t . Bonaldi r . Eskeland e·罗默和a . Imhof”标识特定的组蛋白甲基转移酶的抑制剂苏(VAR) 3 - 9,“化学生物学性质,1卷,不。3、143 - 145年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. e·埃瓦萨y Hamashima, s Fujishiro et al .,“总(+)-chaetocin及其类似物的合成:G9a的组蛋白甲基转移酶抑制活动,“美国化学学会杂志》上,卷132,不。12日,第4079 - 4078页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. h·沙伊布,a . Nebbioso t Prebet et al .,“抗白血病活性chaetocin通过死亡receptor-dependent组蛋白的细胞凋亡和双调制methyl-transferase SUV39H1,”白血病,26卷,不。4、662 - 674年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m . Soleimani和美国Nadri”协议隔离和文化从小鼠骨髓间充质干细胞,”自然的协议,4卷,不。1,第106 - 102页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. a . Barui Chowdhury f ., a·潘迪特,p,“重路由对上皮间充质干细胞轨迹血统的工程细胞,”生物材料卷。156年,28-44,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. y,中州。陈,L.-Y。李et al .,“CDK1-dependent磷酸化H3K27 EZH2抑制甲基化和促进人类间充质干细胞的成骨分化,“自然细胞生物学,13卷,不。1,第94 - 87页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. j . c .大米,s·d·布里格斯,b . Ueberheide et al .,“组蛋白甲基转移酶直接不同程度的甲基化来定义不同的染色质域,“分子细胞,12卷,不。6,1591 - 1598年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. a·h·f·m·彼得斯s Kubicek k Mechtler et al .,“分区和可塑性的压制性哺乳动物染色质的组蛋白甲基化状态,”分子细胞,12卷,不。6,1577 - 1589年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. y . x, g . Wang Wang et al .,“组蛋白demethylase KDM7A相互地调节脂肪形成的并通过调节C / EBP成骨分化α和规范Wnt信号。”细胞和分子医学杂志》上,23卷,不。3、2149 - 2162年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. l . k . Peng口,l . Yu et al .,“组蛋白demethylase JMJD2D交互β连环蛋白诱导转录激活大肠癌细胞增殖和肿瘤生长在老鼠身上,“胃肠病学,卷156,不。4、1112 - 1126年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2021 Youde梁等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。