初级纤毛在间充质干细胞衰老作为生物标志物:影响成骨细胞的分化潜能与刺猬信号调控有关

文摘

骨组织工程学需要播种的扩张治疗骨病变细胞,如自体间充质干细胞(msc)。这个过程的一个主要障碍是msc的表型和分化能力的损失受到通道。最近的研究表明,初级纤毛,原始的多个信号转导的细胞器,尤其是刺猬信号,在衰老中发挥作用。因此,我们探索衰老之间的关系,主要纤毛,刺猬信号在msc。体外老化的msc扩张伴随着细胞倍增时间增加。msc通道4岁的成骨的能力是主要的破坏相比,细胞。P4 msc表现出减少的频率和长度初级纤毛与纤毛Arl13b染色强度下降。衰老的差别也导致了对这些组件和CDKN2A刺猬的表达。抑制ciliogenesis Gli1的基因表达降低,刺猬的关键分子信号通路和高山,成骨细胞的分化的一个标志。本研究表明,衰老的MSC诱导成骨细胞的分化能力的丧失和灭活刺猬与减毒ciliogenesis相关信号,表明初级纤毛发挥调停作用和生物标志物的MSC衰老; thus, future antisenescence strategies involving manipulation of primary cilia could be developed.

1。介绍

骨组织工程学疗法治疗已经发展一些具有挑战性的骨骼病变,如骨骼缺陷(1,2]。由于有限的骨替代品的质量,植入总是需要种子细胞的扩张,如自体间充质干细胞(msc),这是有吸引力的候选人用于再生治疗(3]。这种治疗策略的一个主要障碍是因此损失的衰老msc的表型分化潜力受到通过体外(4从捐赠者体外岁]或收获5在临床使用。在细节,减少增生性衰老msc展览活动和分化潜能,扩大形态和染色体不稳定(5]。例如,msc显示能力降低分化成成骨的血统和表达下调的表达碱性磷酸酶(ALP)、胶原蛋白1型(I)上校4],RUNX2 [6连续使体外后)。底层机制包括伴随老化CDKN2A / p16基因的超表达(7),以及p21、p53和一些细胞因子和生长因子(8]。几种处理方法已被证明影响MSC衰老。基因改造是可行的,可拆卸的p16恢复衰老msc的表型(7]。改变培养条件包括氢气的应用(9,抗氧化剂10),和机械应力11]。添加一些药物细胞培养,比如lysophosphatidic酸(12和生长因子12),也会抑制衰老。然而,在MSC衰老的机制需要进一步的研究来确定新的目标并提供洞察力。

刺猬家族包括三个蛋白质配体:声波刺猬(嘘),印度刺猬(本次),和沙漠刺猬(DHH)。刺猬信号通路,受体patched-1 (Ptch1)通常驻留在主纤毛。绑定到配体后,Ptch1退化和运输的纤毛,而波动性(Smo)蛋白质被贩卖到纤毛和被激活,导致下游效应激活。突变体影响纤毛的表达和/或逆导致中断刺猬信号(13]。最近的一项研究表明,本次配体可以防止MSC衰老通过抑制p16基因表达、p53和SA -β加和促进MSC骨(14]。此外,嘘了msc的刺激成骨细胞的分化15),而刺猬拮抗剂显示延迟骨折愈合(16),这表明刺猬信号在骨形成的促进作用。有趣的是,衰老标记CDKN2A受刺猬转录因子Gli2在初级cilia-dependent和cilia-independent礼仪17]。一些研究也表明,衰老是由刺猬信号初级纤毛的形成与变化。

在这项研究中,我们主要决定衰老msc在成骨分化的影响,初级纤毛的表情,和刺猬信号激活。初级纤毛的频率和长度的变化是根据衰老和刺猬信号的变化,而抑制ciliogenesis抑制Gli1和高山的表情。这个证据表明初级纤毛中扮演中介的角色和MSC衰老的生物标志物,为未来的发展提供新的目标antisenescence策略。

2。材料和方法

2.1。MSC文化

老鼠安乐死颈椎脱位,然后彻底清洗被浸在酒精2分钟。打开股骨和胫骨,手术刀被用来降低皮肤和肌肉。骨髓中提取了冲洗使用培养基烧瓶。介质是由补充L-Dulbecco修改鹰的介质(美国Gibco L-DMEM)与10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),100国际单位/毫升青霉素,100μg / ml链霉素(PS)。48小时后,媒介改变了不依从细胞移除。附加的细胞在培养瓶培养融合和扩展,直到他们达到80 - 90%。细胞与骨髓组织,汇集从三个单独的老鼠,是培养和转移到6-well板为主的msc(定义为P0,播种密度10⁵/)或通过P4,然后转移到6-well板(播种密度为10⁵/)。另外,msc都是从年轻或年长的老鼠(1个月和18个月大)通过上面提到的协议。siRNA可拆卸的本次事件或IFT88使用标准协议进行。msc与100 nM转染核针对本次事件或IFT88炒序列(负控制核(广州生物有限公司,中国)。培养的细胞在37°C 5%孵化有限公司₂。

成骨细胞的分化诱导msc的治疗与10毫米β甘油磷酸盐、100 nm地塞米松和50μg / mL抗坏血酸,这是一个行之有效的策略18]。我们一周的细胞治疗探讨msc的分化能力,因为一个高度矿化层2周后培养的msc形式。这个矿化影响的能力刮msc,导致一个非齐次RNA样本。

2.2。BMSC识别

P0和P4 msc分析表达CD29, CD34, CD44通过流式细胞术如前所述[19]。在检测之前,P0 MSC能力的多元智能和脂肪形成的chondrogenic分化被我们组确认。然后,大约 msc (P0和P4)被转移到管子,然后沾phycoerythrin-conjugated anti-CD29, CD44, CD73, CD90、CD105、CD34和CD44在4°C 30分钟。与冰冷的PBS缓冲液洗涤后,分析了MSC标记的表达流式细胞术(beckman coulter电子,是海里,FL)。不同数量的彩色P0 msc和P4 msc。

2.3。检测的MSC增殖和分化能力

确定主键或通过msc的增殖活性,细胞被收集和坏死细胞和锥虫蓝染色鉴定。细胞数量确定最后的5天文化时期,和细胞倍增时间计算是基于一项研究[4]。诱导成骨分化,MSC培养基(DMEM + 10%的边后卫+ p)替换为分化培养基(αmem包含10毫米β甘油磷酸盐和50μg / mL抗坏血酸)为一个星期。感应的时间(> 2周)引起的高矿化层的形成防止刮msc及成功的免疫荧光标记的初级纤毛。高山染色法是利用对表达式求值的高山在盖玻片上培养的msc与碱性磷酸酶染色设备。

2.4。采用免疫染色

P0和P4上培养的msc直接盖玻片,然后用4%多聚甲醛固定为5分钟。细胞被洗3次在PBS和孵化5分钟0.25% Triton-X / PBS permeabilise细胞。然后,5%的细胞被封锁山羊血清/ PBS 1小时。一夜之间,msc被孵化与主要抗体。初级纤毛是使用anti-acetylated immuno-labeledα微管蛋白(1:2000 T7451 Proteintech,美国)或anti-Arl13b抗体(1:2000年,17711 - 1 - ap, Proteintech,美国)。在4°C孵化后一夜之间,样本洗3次0.1% BSA / PBS然后用Alexa萤石孵化488 -和Alexa萤石633 -共轭二次抗体稀释1:100 1小时。细胞与DAPI复染色5分钟来识别核。随后,msc在PBS洗了三次。msc还immune-immunofluorescent贴上ki - 67抗原(1:1000),因此,计算阳性细胞的百分比。幻灯片被共焦显微镜检查,和图片是使用图像管理软件。共焦z-stacks涵盖整个细胞的深度(大约10节)收集使用0.5μm步长。纤毛长度从产生的最大量化使用ImageJ投影图像,在以往的研究软骨细胞纤毛(20.),通常平躺在盖玻片基底表面的细胞。纤毛区测量随着像素数量的最大投影图像上的每个纤毛占领,也用于。纤毛的数量决定于共焦图像重建在一些随机的视野与纤毛患病率(%)被计算为纤毛细胞的百分比除以整个细胞。

2.5。定量聚合酶链反应(qPCR)

量化基因表达,msc与试剂盒刮和收集。互补脱氧核糖核酸合成使用Quantitect逆转录工具包(美国表达载体)。SYBR绿色(美国应用生物系统公司)是用于PCR。放大条件如下:95°C 3分钟紧随其后40 95°C的周期为15秒和60°C 30年代。放大了使用StepOnePlus™实时PCR系统(美国应用生物系统公司)。高山mRNA,坳l mRNA, RUNX2 mRNA, SMO mRNA, Ptch-1 mRNA, GLI 1 mRNA, GLI 2 mRNA表达水平正常化GAPDH表达水平使用ΔCt方法。在这项研究中使用的引物序列如果1中列出。

2.6。免疫印迹分析

细胞治疗与里帕裂解缓冲从整个细胞中提取的蛋白质。蛋白质受到10% sds - page和转移到硝酸纤维素。印迹进行与成骨的初级抗体标记RUNX2 (sc - 390351),高山(sc - 365765),我坳(sc - 59772),以及CDKN2A (sc - 1661)和本次事件(sc - 271101),这都是购自圣克鲁斯生物技术公司。GAPDH是用作管家蛋白。增强化学发光试剂被用来识别结合抗体。最后,所有的乐队都呈现使用ImageJ软件分析。

2.7。统计分析

GraphPad棱镜(美国GraphPad软件GraphPad Prism 5.01)被用来进行统计分析。数据从P0和P4 msc在列 的意思(sem),主要是利用学生的分析 - - - - - -测试。 被认为是显著的。直方图,上面的星星酒吧指示意义对应的组相比,在#符号表示不同于对照组没有诱导成骨分化。

3所示。结果

3.1。减少增生性活动和保护乙肝表面抗原表达在扩大msc

msc被保持在基础培养基,然后进行扩张。如图1(一)显微镜证实,msc纺锤状;10天,支流P0 msc几乎是100%,但是P4 msc汇合的80%。细胞数量倍增时间(图1 (b))显示次数增加逐渐增加趋势。P4和P5 msc展出大大延长一倍时间比P0 msc(约2倍变化),这表明扩张降低增殖能力。然而,没有差别主要在细胞倍增时间msc是从年轻动物和那些收获从旧的动物。因此,本研究主要使用(P0)和通道(P4) msc探索衰老的机理。

表面标记表情小学和通过msc随后测量(SI2通过流式细胞术证实干细胞的保存。P0和P4 MSC没有显示特定的MSC表面抗原的不同表达CD29, CD44CD73 CD90 CD105(阳性细胞的人口非常大,从80%到95%),或特定的HSC表面抗原CD34、CD45(从1%到4%的细胞)。P0和P4 msc表达这些标记的数量是相同的。

3.2。主要msc表现出成骨的潜力比年龄P4 msc

接下来,我们试图确定成骨分化能力之间的差异P0和P4 msc。msc与分化培养中一周,P0和P4 msc能区分,如亮场图像和高山染色所示,表明成骨细胞的分化(图的出现2(一个))。细胞形态学P0和P4 msc与梭形没有显著变化,在单层安排。msc逐渐聚集形成细胞集群高山较强表达(更大的颜色反应)在P0 msc。此外,P0 msc表达高水平的基因高山和上校,但不是RUNX2,比P4 msc(图2 (b))。同样,高山和坳1蛋白表达的调节在初级msc但不是RUNX2(数字2 (c)和2 (d))。CDKN2A的蛋白表达,这是一个中介衰老的重要因素,是提升在P4 msc(图2 (e)),确认其与衰老的协会。这些结果表明,衰老P4 msc具有成骨分化能力水平的降低。

3.3。减少初级纤毛在衰老和纤毛Arl13b染色强度msc

初级纤毛的相关变化通过免疫荧光染色下探索乙酰化的初级纤毛α微管蛋白(红、图3(一个))或Arl13b(绿色图3 (d))。共焦显微镜最大强度投影图像的msc图所示3(一个),他们演示数量减少的主要纤毛衰老P4 msc、P0 msc睫毛80%以上至60%的P4 msc。睫毛和纤毛长度计算如我们之前所述研究[20.]。在这项研究中,血清饥饿24 h的影响在纤毛测量MSC纤毛也探索(SI3)。由于抑制P4 MSC增殖(SI3),血清饥饿被用来逮捕细胞G0期。serum-maintained条件,纤毛较低的数量,但是没有区别P0和P4 msc。相反,在serum-starved细胞,减少睫毛和纤毛长度被观察到在P4 msc (SI3B, C,和数字3 (b)和3 (c))。我们也测量了纤毛表达msc通道(SI 0 - 4倍3D, E),发现的数量逐步减少纤毛与扩张,符合中给出的结果数据1 (b)和2。衰老可能与初级纤毛的数量的变化。

由于刺猬信号Arl13b的监管作用及其对纤毛的浓缩,我们为乙酰化——彩色初级纤毛α微管蛋白跟踪纤毛和Arl13b纤毛(图上评估其铀浓缩3 (d))。正如所料,减少纤毛区(数字3 (e)和3(一个))的整体强度降低Arl13b纤毛(图3(f))在P4 msc、暗示有纤毛和相关信号的变化。

3.4。衰老在msc是伴随着灭活刺猬信号

刺猬信号的参与在衰老然后探讨聚合酶链反应和免疫印迹分析表达式的刺猬组件。刺猬配体的蛋白表达本次事件是减少在P4 msc(图4(一)),这表明刺猬信号是灭活在扩张。Ptch-1的信使rna表达水平、Gli1 Gli2也下调岁P4 msc(数字4 (b)和4 (c),大约损失了50%的基因表达)。然而,SMO信使rna的转录活动并没有改变。这些关键的刺猬组件丰富的纤毛,Gli可以调节CDKN2A表达式(17]。随后,siRNA i.h.h(用于废除刺猬信号。本次淘汰赛的表达升高CDKN2A P0和P4 msc(数字4 (d)和4 (e)),进一步表明在MSC衰老刺猬信号的参与。

3.5。损耗IFT88初级纤毛的变异基因表达的差别会导致对这些高山和Gli1

探讨原发性纤毛的作用在MSC衰老,初级纤毛被耗尽的siRNA针对IFT88(图5(一个))。的IFT88 gene-encoded intraflagellar运输蛋白质IFT88初级纤毛结构中扮演着中心角色维护和功能。水合氯醛也添加到确保纤毛的清除。因此,初级纤毛的损失确认(图5(一个)),减少睫毛从80%到10%(图5 (b))。有趣的是,基因转录活动Gli1和高山相比,声音,初级纤毛的损失抑制刺猬信号和成骨分化。这些结果表明,初级纤毛刺猬signaling-mediated监管所需的MSC衰老通过cilia-mediated关键转导Gli1等因素。

4所示。讨论

本研究主要表明减少MSC被扩张的成骨的能力伴随着初级纤毛和失活的刺猬信号,指示MSC衰老的“初级cilia-hedgehog-CDKN2A”机制。我们的结果与先前的研究在其他细胞类型显示刺猬配体本次促进初级纤毛的形成在人类乳腺上皮细胞(17),抑制衰老和CDKN2A表达在人类msc (14刺猬的差别,引发对这些信号在通过人类成纤维细胞(21]。明确联系因此提出初级纤毛在要求和/或导致刺猬信号调控衰老的msc,从而影响成骨分化能力。

我们用体外培养的MSC扩张来监视伴随老化改变,没有从捐赠者不同年龄的MSC。事实上,关于是否存在重大争议这种细胞模型表示体内老化(22]。引入扩张复制衰老已广泛应用各种研究人员识别senescence-associated基因(23,24]。我们没有观察到不同的msc的增殖老少捐赠者,但逐渐丧失通过msc的增殖活动观察。明确的表型变化P4 msc也显示,细胞表现出增大和圆形的形态,进一步证实了我们扩张的文化模型的效用。的组织起源,msc可从各种组织,如脂肪组织。在这项研究中,我们使用从骨髓msc孤立,这被认为是best-characterised源到目前为止(3,25]。msc可以表现出减少的表达干细胞表面特异性抗原(26]。我们评估几个MSC标记和两个HSC标记。正如所料,msc展出高比例的细胞表达CD29, CD44, CD73 CD90、CD105,但不是CD34、CD45。这个MSC-marker表达式的维护稳定和以前在P1027]甚至P80 [28]。一致,我们的研究结果建议msc在扩张的整体的稳定性。

以前,我们表示“结构”之间的关系的规定mechanosignaling初级纤毛和炎症反应的关节软骨细胞(20.,29日]。在这项研究中,我们发现减少在msc在初级纤毛长度和数量扩张,依照先前的研究在软骨细胞的另一个细胞类型(30.但不是在成纤维细胞(31日]。由于增生性msc的本质,大约10 - 30% P0-P4 msc Ki67阳性,血清饥饿被用来逮捕细胞G0期,促进ciliogenesis。这也是因为初级纤毛在自行车的吸收导致misestimation当比较初级纤毛数量和长度。根据计算,我们还发现Arl13b升高在P0纤毛细胞染色强度与年龄在P4细胞相比,这表明纤毛形态和刺猬信号之间可能的联系。Arl13b监管GTPase高纯度纤毛,调节刺猬信号(32];在这项研究中,纤毛Arl13b表情的变化可能有影响的转导调节衰老的刺猬组件。然而,最近的一项研究表明,Arl13b也初级纤毛以外的功能33)是不可取的,但显示在纤毛调控机制的复杂性。我们还发现,在衰老P4 msc、本次事件的抑制,Ptch-1, Gli1, Gli2表达式与减少CDKN2A表达式。这减少了本次事件的激活在衰老之前已经报道过了msc (14),进而影响到下游的表达活跃Gli1和Gli2。CDKN2A启动子区域被发现有Gli2强有力的结合位点(17),表示由CDKN2A Gli2的直接监管。之前的研究表明,损耗的突变造成的纤毛IFT88导致骨密度下降(34)和失活的刺猬信号(35]。同样,在这项研究中,损失的初级纤毛的基因转录抑制Gli1和高山P0 msc、初级纤毛的中介功能。

其他MSC影响衰老的因素也导致初级纤毛的变化,进一步强调他们的参与。例如,CDKN2A枯竭或外生本次蛋白促进增加主纤毛上皮细胞(形成的数量17]。机械加载应变的形式或压缩也会引起纤毛缩短和减少刺猬信号(36,37]。氧张力调节衰老(38)而调节初级纤毛拆卸(39]。这些因素可能会改变MSC初级纤毛的形态,可能影响关键刺猬贩卖的组件,如SMO, Arl13b Ptch1,纤毛,从而调节刺猬信号和衰老。还需要进一步的研究来阐明这些潜在的监管机构。

总之,我们主要是确定的机制主要纤毛调解刺猬信号调控MSC衰老,因此影响成骨的能力,这是与初级纤毛数量和长度的变化有关。因此,初级纤毛可以生物标志物的衰老或期货操纵MSC衰老的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者(年代)(s)宣称他们没有利益冲突。

补充材料

补充表1 (SI 1)列出高山的引物序列,GAPDH, RUNX2,坳,Ptch1, Smo, Gli1 qPCR用于这项研究。补充图2(如果2)访问P0具备干细胞和P4 msc用于本研究通过检测表面抗原标记的表达式通过流式细胞术。补充表3 (SI 3)显示,附加信息以初级纤毛在主键或通过msc患病率和长度数据。(补充材料)

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