的进步女性生殖细胞诱导多能干细胞

文摘

生殖细胞有能力维持物种的连续性通过跨代遗传和表观遗传信息传递。雌性生殖细胞主要发展在胚胎阶段,通过后续发展阶段包括原始生殖细胞,oogonia,卵母细胞。然而,由于使用早期人类胚胎的局限性在活的有机体内研究模型,在体外研究模型需要揭示了早期的女性生殖细胞发育过程及相关机制。出生后,毛囊的数量随着年龄的增长逐渐减少。各种条件破坏卵巢功能会导致卵巢功能早衰。替代疗法解决这些问题需要调查。生殖细胞分化的多能干细胞在体外可以模拟早期胚胎发育的雌性生殖细胞和澄清在发展过程中未解决的问题。此外,多能干细胞可能为女性生育能力保留在适当的应用前景在体外分化。老鼠的雌性生殖细胞已经成功地重建在体外并交付给后代的生活。然而,推导功能人类女性生殖细胞尚未完全实现由于技术限制和伦理问题。提供一个更新的和全面的信息,本文主要研究中心在老鼠和人类女性生殖细胞的分化多能干细胞发育机制的进一步研究提供参考和女性生殖细胞的潜在的治疗应用。

1。介绍

目前,各种原因造成女性不孕是成为加剧生殖问题。辅助生殖技术(ART)是一种有效的治疗non-germ细胞(GCs)引起的不孕。然而,造成不孕GCs异常尚未有一个很好的替代治疗(1]。治疗不孕症在这些患者需要精确详细的理解女性GCs分化和病理缺陷发生在女性GCs异常。然而,女性GCs形成主要发生在胚胎阶段。由于有限的收购和道德抑制为研究目的,早期人类胚胎早期女性GCs发展尚未透露有意2]。因此,建立一个合适的在体外女性GCs发展模型是必要的调查和生育重建。

小鼠模型是最常用的研究哺乳动物雌性GCs形成、专业化和差异化3]。重大成果获得多能干细胞在诱导鼠女GCs已经提供显著的参考重建人类女性gc在体外从已经被4- - - - - -8]。胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能)有能力自我更新和multilineage分化包括女性GCs [9- - - - - -12]。然而,老鼠之间略有不同的感应协议已经和人类已经被基于的差异在活的有机体内女性GCs小鼠与人类之间的形成(4- - - - - -8]。

2。雌性生殖细胞发展在活的有机体内

鼠标原始生殖细胞(包括)第一次被发现是在原条的后端在胚胎的胚外中胚层6.25天(E6.25) [13),其次是包括规范在E9.5 E7.25和迁移。E10.5左右,包括到达生殖嵴和进入胚胎性腺E11.5 [14]。最终性的命运不仅受性腺的体细胞的染色体宪法也(14]。在交织的信号从胚胎性腺的体细胞,包括“双电位的”,这意味着包括可以适应男性或女性的命运(14]。后殖民胚胎卵巢,包括开始E12.5性分化和发展成oogonia E13.5 [15]。之后,在E14.5 oogonia进入初级卵母细胞减数分裂我和形式被逮捕在减数分裂我双线期,直到排卵。在出生,初级卵母细胞周围颗粒细胞,按顺序生成原始,小学,中学,和窦的毛囊16]。初级卵母细胞完成减数分裂我出生后六周左右,形成次级卵母细胞。次级卵母细胞并逮捕了排卵是在减数分裂中期II (MII)在受精之前。信息产业部卵母细胞被认为是作为功能性卵母细胞可能与精子受精(图1)。

鼠标包括差异化的监管下发生连续的转录因子(TFs)(图2)。骨形成蛋白(BMP)和无翼/集成(WNT)通路引起一系列下游TFs [17]。BMP4激活WNT3,位于上游的中胚层的TF - BRACHYURY (T) (17]。T激活关键GCs标记BLIMP1早期,PRDM14,实现协同TFAP2C BMP4 [17]。BLIMP1表达前体的鼠标热解色谱、诱发PRDM14 TFAP2C,激活生殖系途径,大力压制体细胞中胚层的途径(15,18]。PRDM14专门用鼠标热解色谱。研究显示,老鼠热解色谱PRDM14对表观遗传重编程至关重要(19]。因此,这些TFs之间的相互作用对于女性gc的后续分化至关重要。在规范,在E7.25,老鼠包括表达多能性标记OCT4、NANOG, SOX2, KLF2, PGCs-specific标记SSEA1和斯特拉(图1)[18,20.]。OCT4,鼠标的专业化和维护的关键包括展出高表达,直到性分化[15]。SOX2直接有利于生存和增殖的鼠标热解色谱(21]。迁徙鼠标热解色谱主要表达SSEA1和趋化因子受体CXCR4 (19,20.]。DAZL和瓦萨号开始表达性分化迫在眉睫。DAZL被认为是生殖细胞内在能力的因素,这是必要的接收信号从胚胎性腺的外在因素。性分化后,减数分裂我是由视黄酸在E12.5 (RA)。RA诱导减数分裂前的基因STRA8 meiosis-associated基因REC8表达在胚胎卵巢。STRA8上调synaptonemal复杂protein3 (SCP3)和一代,这两个代表在E13.5减数分裂启动(22]。总之,这些stage-specific标记不仅提供了洞察GCs发育机制,还提出了具体的评估分化标记细胞在女性GCs开发,以及诱导雌性GCs通过过度分化。

在人类中,包括分化与鼠标包括大体相似,但不同发育时间(图1)、TFs交互和某些特定的标记(图2)。人类首次发现热解色谱大惊小怪和Felix背墙的卵黄囊内胚层发育周3 (Wk3) [23,24]。在后来的研究中,研究人员发现人类热解色谱中指定后早期postimplantation胚胎的外胚层大约在Wk225,26]。然后,人类包括开始迁移Wk4 [27,28),进入生殖性腺Wk5-6 (29日]。Wk6-8期间,包括sex-differentiated与性腺的体细胞胚胎卵巢(30.]。包括之间的交互和性腺的体细胞,oogonia细胞形成Wk9和应对RA信号在Wk14 Wk11分化成初级卵母细胞(26,31日]。随后,初级卵母细胞组装成原始卵泡颗粒细胞的一层(32]。出生时,大约有300000原始卵泡,和这个数字出生后大多会随着年龄的增长而减少33]。随后folliculogenesis、完成减数分裂我和代MII卵母细胞进行的大多是类似的方式与老鼠不同的时间点。

人类包括规范发生在BMP4,加工,SOX17 BLIMP1, TFAP2C转录网络大约类似于老鼠(图2)。加工,这是一个关键因素在人类中胚层的前体细胞,位于下游的苯丙酸诺龙和WNT信号,同时在SOX17上游,BLIMP1, TFAP2C [34]。SOX17人类热解色谱的一个重要说明符也激活BLIMP1 TFAP2C,进而激活生殖系通路和压抑中胚层,内胚层,神经通路(34]。关键在鼠标包括形成中胚层TF-T,然而,不是对人类至关重要34]。KLF4,天真的多能性因子,表达人类包括在老鼠BLIMP1紧(35]。相比之下,SOX2和PRDM14,鼠标的关键包括差异化,不是高表达在人类热解色谱(7,36]。人类迁移包括主要表达早期GCs标记BLIMP1 TFAP2C, SSEA1以及多能性标记OCT4 NANOG。的迁移,DAZL和下级瓦萨号表示26]。RA响应基因STRA8、RDH10 CYP26A1开始最早Wk11表达,表明即将启动的减数分裂。减数分裂前期女性GCs主要表达SCP1 TEX12, SPO11。初级卵母细胞的特点是ZP1-3, NOBOX, OOSP2表达式(26]。

这些上述转录因子和女性GCs标记对应于不同发育阶段微分系统的建立提供了重要参考在体外。与此同时,建立在体外模型,进而阐明女性gc期间上述机制的形成。继续描述研究将阐明如何老鼠和人类已经被诱导成女性GCs,分别。

3所示。从已经被女GCs感应在体外

最常用的ESCs已经被认为是和万能。老鼠和人类的ESCs来自内细胞团(ICM)胚泡在1981年和1998年,分别为(37,38]。ESCs有自我更新能力和multilineage分化潜力三个生殖细胞层。然而,人类的ESCs的建立需要摧毁人类胚胎早期,从而导致伦理问题。同时,异种移植ESCs-derived细胞可能可能引起免疫排斥反应。这些担忧被建立则松了一口气。2006年,科学家诱导小鼠细胞则通过引入四个关键转录factors-OCT3/4 SOX2, KLF4, c-MYC-into鼠标成人成纤维细胞(9]。随后,人类则是来自成年人类成纤维细胞(10,39]。这些细胞则已经成为有吸引力的替代的ESCs ESCs的类似的生物学特性在细胞形态、基因表达式和表面抗原。则是在体外在不损害早期胚胎,消除道德担忧ESC采集和应用程序。此外,自体移植细胞来源于个人ESCs则避免同种异体免疫排斥。更重要的是,他们也有能力区分成multilineage细胞包括女性gc [10]。因此,已经被研究了生成女性GCs,尤其是细胞则被视为相对理想的再生医学的干细胞来源。

一般来说,ESCs /被诱导到生殖系的细胞则通过自发分化途径,与一些细胞因子,直接感应或germline-specific基因的超表达。引起女性GCs被stage-specific标记的表达以及形态或功能。科学家们从已经在诱导雌性GCs取得很大的进步4,6- - - - - -8]。老鼠和人类之间的感应方案略有不同已经根据他们的女性GCs发展差异。

3.1。从老鼠已经被女GCs感应在体外

研究老鼠女GCs感应已经获得显著的成就在最近二十年(表1)。在体外女性GC感应在2003年首次证明从鼠标的ESCs [40]。在这项研究中,老鼠的ESCs自发分化在没有生活和馈线细胞悬浮状态。文化的第12天,高GFP + /瓦萨号+表达式中发现大量殖民地,最有可能代表postmigratory热解色谱。这些GFP + /瓦萨号+包括自发形成oogonia-like细胞进入减数分裂大约16天,oocyte-like细胞产生20% 26天左右。Oocyte-like细胞表现为透明带(ZP)像大衣,ZP2卵母细胞标记和ZP3表达式。随后,他们形成小follicle-like细胞(方法),可以培养成组织结构形态类似于原始卵泡。在第43天,一些卵母细胞完成减数分裂我甚至可以通过parthenogenic blastocyst-like结构形式激活(40]。这些结果表明ESCs鼠标有可能自发进行超越性别决定和分化成鼠标女GCs大约在开发阶段和时机在薇芙o (41]。这个开创性的研究显示,老鼠的ESCs可能是卵母细胞生成新的细胞来源。然而,在这项研究中,oocyte-like细胞并没有被证明是成熟的卵母细胞。除此之外,他们没有定向分化和诱导生成效率相当低。添加一些生长因子信号被认为直接区分已经生殖系,加强分化效率(42]。研究人员收集了睾丸细胞培养的条件培养基因为睾丸包含许多生长因子如BMP4,自洽场,生活,βFGF, GDF9。ESCs鼠标生成胚胎体(EBs)悬浮培养,进一步诱导成oocyte-like细胞包围着一个或两层平台式细胞和颗粒细胞相似在活的有机体内。这表明睾丸细胞培养可以提供重要的生长因子也对卵泡形成(42]。然而,在他们的研究中,卵母细胞表达的oocyte-like细胞标记SCP3 ZP3和无花果α但不是ZP1 ZP2,表明这些oocyte-like细胞在卵母细胞生长的早期阶段。除此之外,他们没有发现染色体联会尽管SCP3存在。关于卵母细胞生成热解色谱和性腺的体细胞之间的相互作用在活的有机体内,从小鼠卵母细胞的自发分化ESCs被视为一种罕见的事件,和性腺的体细胞被认为必要oocyte-like细胞感应(43]。关于这一点,研究人员用一个两步的方法来诱导oocyte-like细胞从老鼠的ESCs43]。首先,包括通过EB诱导形成4天。他们培养老鼠ESCs LIF-free DMEM含有10%的边后卫EB。EBs表示OCT4、c - kit FRAGILIS,斯特拉和MVH。他们排序SSEA-1和c - kit阳性细胞代表早期热解色谱然后cocultured性腺的体细胞进行进一步的10天。分化细胞表达女性oocyte-specific标记图α、NOBOX GDF9, ZP1-3。然而,这些标记不能检测到在EBs单独培养。这是证明颗粒细胞可以增强女性GCs感应。然而,像先前的研究42),卵母细胞还逮捕了在早期减数分裂阶段即使cocultured颗粒细胞。因此,卵母细胞增长可能需要一些额外的因素没有被包含在这些研究[42,43]。研究人员认为RA除了可能导致完成减数分裂,因为它可以刺激STRA8 REC8进入减数分裂在活的有机体内(44]。然后,老鼠ESCs-derived EBs在RA补充培养10 - 15天(45]。RA治疗后,研究人员发现方法和假定的胚泡(问)卵母细胞。此外,这些问卵母细胞受精和精子发育成胚泡。因此,RA证实女性GCs重建的关键。

万能的成功建立后,2009年,荒唐的鼠标由鼠标通过四倍体的细胞则形成互补,证明老鼠细胞则有女性GCs能力(46]。类似于鼠标的ESCs感应在先前的研究中,老鼠被诱导成圆形的细胞则oogonia-like通过EB形成细胞悬浮培养与RA补充,BMP4,自洽场,EGF, GDNF [42,45,47]。这表明,万能的ESCs可以诱导成女性GCs通过类似的归纳方法。

上述研究确立了女性的一些有用的方法GCs感应;然而,他们未能为连续系统的感应协议提供清晰的从已经过渡到热解色谱和后期女性gc。由于热解色谱自然前体配子(24),感应功能PGC-like细胞(PGCLCs)在重组配子已经被认为是一个重要的过程在体外。老鼠epiblast-like细胞(EpiLCs)拥有细胞特征类似于pregastrulating外胚层和作为适当的前体的感应鼠标PGCLCs [16]。研究人员发现2 ilif介质,它包含了生活和MAPK / GSK3通路抑制剂,能使老鼠的ESCs展览特点类似于ICM和揭示更多有效的生殖系能力(4,48]。鼠标基态已经在2 ilif介质,进一步归纳学报,βFGF, KSR条件2天老鼠EpiLCs形成的。这些老鼠EpiLCs BMP4的进一步诱导条件下,生活,自洽场,EGF生成鼠标PGCLCs(4 - 6天49]。这些老鼠PGCLCs表现出类似的转录组和表观遗传资料与热解色谱E9.5迁徙的老鼠在活的有机体内。PGCLCs的表观遗传资料评估H3K9me2组蛋白的化学修饰和H3K27me3代表和5 mc在热解色谱形成水平,相比之下,他们的表情在活的有机体内。结果表明,H3K9me2和5中mc含量增加的ESCs differetiating EpiLCs而他们在EpiLCs区分成PGCLCs显著降低。然而,H3K27me3水平下降期间的ESCs differetiating EpiLCs和增加在EpiLCs differetiating PGCLCs。这些动态规则是类似的在活的有机体内包括分化。之后,老鼠PGCLCs组成了一个“重组”卵巢与性腺的体细胞通过聚合;然后,不育的“重组”卵巢移植小鼠卵巢囊(4]。“重组”卵巢模拟女性GCs内部环境在活的有机体内经历了第一次减数分裂和成年问卵母细胞生成。这些问卵母细胞多层颗粒和类似于成年收件人卵泡膜细胞在活的有机体内。然后问卵母细胞进行了在体外成熟(IVM)成长为信息产业部卵母细胞,这可能是受精在体外受精(IVF)和获得健康的后代,使正常的印记模式(4]。因此,这是一个了不起的成就在女性GCs从已经被开发在体外。然而,在这项研究中,重组PGCLCs被移植到不育小鼠卵巢囊,这意味着接下来的卵子发生并非完全完成在体外。因此,研究人员尝试第一个完成在体外调整鼠标的哺乳动物卵子发生热解色谱在文化系统中含有雌激素受体拮抗剂(50]。雌激素受体拮抗剂改善正常次级毛囊里面包含一个初级卵母细胞。在体外卵子发生竣工后三个过程包括初级卵母细胞通过分化在体外分化(试管),成年问卵母细胞的生长在体外增长(IVG),并通过IVM MII卵母细胞的成熟。通过试管受精(MII卵母细胞传递健康的后代50]。之后,老鼠PGCLC感应在体外从老鼠卵子发生热解色谱指在上面的研究结合重建小鼠卵母细胞形成的整个过程在体外。已经被认为是第一个分化EpiLCs和生成PGCLCs BMP4,制药业,自洽场,EGF条件。然后,PGCLCs与E12.5聚合为“重组”卵巢性腺的体细胞,并进一步生成MII卵母细胞通过试管,IVG, IVM的过程。这些信息产业部卵母细胞与野生的精子受精在体外类似的权重和交付健康生育后代,存活率,生育和基因表达动态野生类型(图3)[5]。除此之外,从受精胚泡PSCs-derived卵母细胞被证明产生的ESCs可以完成整个女性GCs代。因此,鼠标女性生殖系周期完全成立在体外从已经。

在上述里程碑的研究中,含“重组”卵巢性腺的体细胞中起到了至关重要的作用在促进分化进一步阶段(4,5]。然而,研究诱发女性GCs没有性腺的体细胞仍然有用,他们可以揭示女性GCs发展机制。germline-related基因的超表达女性GCs感应还提供了一个独特的方法。瞬态DAZL的过度表达,为生殖细胞发育和分化是至关重要的,可以抑制NANOG多能性基因的表达,促进减数分裂进程oocyte-like细胞的形成(51]。同时过度PRDM14单独或三个生殖系基因BLIMP1 PRDM14, TFAP2C可以诱导生殖系感应(52]。超表达仅NANOG还发现诱导包括形成。在这项研究中,发现NANOG绑定到PRDM14 BLIMP1增强,表明上游PRDM14和BLIMP1 NANOG功能(53]。这些TF-based生殖系开辟了新的可能性产生的诱变以及女性GCs没有细胞因子和阐明转录网络更精致。其他一些研究人员扩大PGCLCs通过营地信号刺激(54]。扩大PGCLCs维护性未提交的热解色谱的特点,之后性分化启动与性腺的体细胞的存在在活的有机体内。BMP2和RA协同进一步诱导PGCLCs扩大为主要oocyte-like细胞表达瓦萨号和SCP3与E15.5初级卵母细胞在活的有机体内(54]。因此,BMP和RA证明synergically启动性别决定没有性腺的体细胞(55]。有可能进一步延长减数分裂与额外的细胞因子暴露。这些发现提供了一个框架,用于性分化和减数分裂启动。

如上所述,鼠标女GCs戒律在体外使用不同的方法(从已经被51- - - - - -53]。这演示了老鼠已经被作为一个有效的来源女GCs再生。正确的重建期间发生的表观遗传重编程的女性GCs形成最近吸引了注意力。考虑到卵母细胞和性腺的体细胞都是源于胎儿卵巢,研究者认为则来自性腺的体细胞可能生殖系后生记忆比其他体细胞更类似于卵母细胞细胞衍生万能(56]。以前,研究人员认为老鼠万能老鼠卵巢颗粒细胞能自发分化成细胞表达卵母细胞标记发生率更高(57]。最近,研究人员取得了颗粒细胞衍生高生殖系能力的细胞则通过化学方法包含巴豆钠。下面这些万能干细胞诱导成PGCLCs EpiLCs形成;然后,PGCLCs形成的“重组”卵巢E12.5性腺的体细胞。PGCLCs接受正常的减数分裂,形成全球之声可能产生健康的后代在IVM和卵母细胞体外受精治疗。此外,“重组”卵巢内分泌功能,展出包括FSH、E2、抗苗勒氏管激素的分泌。因此,本研究从germline-derived万能干细胞生成的卵母细胞58]。这些改进提供了新的万能干细胞来源和诱导卵母细胞干细胞的方法。

总的来说,通过二十年的努力,研究人员取得了健康的后代从信息产业部卵母细胞从老鼠已经被诱导。两个遗传操作通过overexpressing相关基因和环境修改策略使用性腺的体细胞成功地生成鼠标女性从已经被gc。环境改造策略主要是欢迎因为它可以模拟在活的有机体内环境(57]。从已经通过生成PGCLCs EpiLCs,随后结合PGCLCs与性腺的体细胞被接受作为最有效的协议为鼠标女GCs感应(5,41,59]。更多的扩展研究关于归纳法的细节已经使用这种感应协议和调查显示女性GCs成因机制的进一步理解,进而导致提高文化系统和感应效率(54,55,58,60]。

3.2。从人类已经被女GCs感应在体外

鼠标PSCs-based女性GCs归纳为人类女性GCs代奠定基础在体外(表2)。2003年女GCs感应鼠标ESCs后(40ESCs),研究人员发现,人类也可以自发地分化成EBs在悬浮培养并生成公认的女性GCs表达瓦萨号和SCP3以及卵母细胞GDF9标志。这表明人类ESCs会自发地进入女性生殖系,进行减数分裂61年]。促进分化,研究人员补充说BMP4分化文化,发现它可以增加“瓦萨”号的诱导效率和表达式和SCP3而自发分化62年]。RA补充也可以提高人类的ESCs诱导卵母细胞和原始拥有相似的细胞形态学的方法在活的有机体内同行(63年]。然而,透明带矩阵并不在这些原始的研究发现。增加性腺的体细胞被认为是促进女性GCs归纳。当人类和ESCs与性腺的体细胞诱导的细胞则在初始阶段,包括c - kit表达增加,SSEA1,瓦萨号(12]。即使这些上述研究生成女性GCs表达GCs标记,这些研究也显示较低的诱导效率和特征生成的细胞(不足64年,65年]。

在老鼠身上,GCs-specific基因的超表达没有鼠标女性GCs感应细胞因子提供了一种新的方法(51,52]。因此,研究人员还过表达GCs-specific基因在人类已经提高感应效率(66年- - - - - -69年]。戴兹的过度表达,DAZL,众议院推动减数分裂开始,形成后期女性GCs表达SCP3 [66年- - - - - -68年]。此外,斯特拉与RA诱导过度导致瓦萨号upregulation [69年]。然而,人类已经被感应效率是密切相关的多能性状态(70年]。研究人员发现传统的人类已经被展览影射多能性(70年)和贝尔属性更类似于鼠标postimplantation和epiblast-derived干细胞(EpiSCs) [71年,72年),这对女性命运GCs本质上缺乏竞争力。天真的人类生殖系规范已经容易响应信号,具有较高的诱导效率相比,人类已经被灌输(70年]。如果人类已经被灌输可以转化成天真已经,鼠标PGCLCs感应方法可直接应用于人类已经。4我介质(p38 MAPK GSK3的,和物抑制剂)促进影射人类已经被转移到天真的状态(73年]。鼠标PGCLCs方法后,人已经被认为是preinduced TGF幼稚的状态β,βFGF,生活了2天,然后实现人类PGCLCs BMP2/4下生活,自洽场,EGF条件(图8天3)[7]。因此,一个健壮的方法对人类PGCLCs成立。在另一项研究中,影射人类万能feeder-free条件下培养βFGF,然后刺激学报和WNT信号受体激动剂(CHIR99021) 2天。获得的细胞多能性和中胚层基因表达,表明他们相应的初始mesoderm-like细胞(iMeLCs)。然后,iMeLCs被培养在GMEM / KSR BMP4,生活,自洽场,EGF 4天条件和生成人类PGCLCs对应人类包括位于第七在活的有机体内(图3)[6]。另一个团队也实现了人类PGCLCs分化从人类已经被几乎同时浓度的方式。他们与学报诱导人类已经进入mesodermal-like细胞,βFGF,低浓度(BMP4 5 ng / ml),然后生成mesodermal-like细胞分化人类PGCLCs高浓度(BMP4 [100 ng / ml)36]。因此,人类PGCLCs成功推导在体外使研究人员揭示更多女性GCs分化机制重建它们在体外。

进一步诱导老鼠PGCLCs继续存在E12.5性腺的体细胞;然而,人类性腺的体细胞是很难被收购从早期胚胎。因此,另一种方法,不需要人类胚胎性腺的体细胞被要求提高在体外分化。超表达DAZL和议会使人类的ESCs退出多能状态,进入减数分裂。然后,随后GDF9和BMP15增强的方法诱导表达ZP2和NOBOX74年]。因此,他们提供了一个重要的新模型生成方法从人类的ESCs没有性腺的体细胞。然而,建立人类女性gc在体外,性腺的体细胞都是必不可少的考虑在活的有机体内女性GCs发展。考虑到限制人类胚胎性腺的体细胞收购,在最近的一项研究中,研究人员代替人类胚胎性腺的体细胞与老鼠(75年]。人类与小鼠性腺的体细胞PGCLCs聚合形成一个“卵巢异基因的重组。”“卵巢异基因的重组”,人类PGCLCs诱导121天(图3)[8]。早期生成的细胞,包括基因BLIMP1 TFAP2C, SOX17,和NANOS3下调;DAZL、瓦萨号和RA STR8和SCP3进一步调节响应基因,而关键减数分裂基因一代,γH2AX或SCP1没有充分调节。因此,这些细胞产生“卵巢异基因的重组”对应RA-responsive女性GCs和oogonia,表明这些细胞在减数分裂输入信号相应状态但尚未启动的减数分裂重组。此外,这些oogonia-like细胞表达了类似的DNA脱甲基和擦除特性与Wk10 oogonia印记在活的有机体内。这些结果表明,小鼠性腺的体细胞提供了合适的环境对人类PGCLCs进入性别分化。然而,人类PGCLCs没有进入减数分裂后种植到121天,这期间人类包括完成减数分裂我在活的有机体内(1]。这可能是因为信号来自小鼠性腺的体细胞进行减数分裂是不够的。从理论上讲,人类PSC-induced人类性腺的体细胞会替代人类胎儿性腺的体细胞,能进一步加强人类PGCLCs postmeiotic阶段。在先前的研究中,人类的颗粒细胞,诱导人类万能干细胞被移植到POF老鼠卵巢。他们发现改善卵巢成熟和提高通过激素分泌卵泡增长(76年]。最近,其他研究者也从人类细胞则通过EB派生的颗粒细胞形成,这些颗粒细胞也有助于雌二醇合成在体外(77年]。接下来,这些人类iPSCs-derived颗粒细胞是否可以作为人类性腺的体细胞和总PGCLCs促使卵母细胞进一步分化和支持形成需要调查。

值得注意的是,近年来,ovarian-related多能干细胞被发现在卵巢表面上皮。起初,小圆细胞直径从2到4μm是来源于卵巢表面上皮的女性没有自然卵母细胞和卵泡。这些细胞表达早期胚胎标记SSEA4 OCT4, NANOG, SOX2, c - kit和拥有一个健壮的增殖能力。因此,他们是非常小的类似胚胎干细胞(VSELs)和卵母细胞视为新的干细胞来源。这些VSELs可以分化成oocyte-like细胞直径在80 - 95μ在20米,这是与人类卵母细胞可以用来施肥。他们还表示“瓦萨”号,ZP2甚至形成了一个带pellucida-like结构。然而,减数分裂标志SCP3并不在这些细胞中发现,表明他们不成熟而在活的有机体内同行(78年]。之后,另一项研究还建立了VSELs更年期女性卵巢,这些VSELs被证明与桑娜pellucida-like自发分化成oocyte-like细胞结构和突出极地身体,就像结构。然而,这些oocyte-like细胞的受精功能没有测试(79年]。最近,一项研究显示从卵巢功能早衰患者VSELs oocyte-like细胞。这些细胞表现出带pellucida-like精子结构和可能的反应。反过来,可以识别oocyte-like精子细胞和绑定到他们强烈。然而,这些oocyte-like细胞不表达ZP1和ZP2尽管存在带pellucida-like结构。因此,无论对精子的反应,这些oocyte-like细胞不能代替功能齐全的卵母细胞在活的有机体内然而,(80年]。仍然需要进一步精确的调查从VSELs实现更多的功能成熟卵母细胞。

总之,类似于鼠标PGCLCs,人类oogonia-like细胞已经成功地从细胞则通过“卵巢异基因的重组”8]。人类PGCLCs代的多级系统的协议是近几年来在这一领域的方法(6,7]。VSELs导致精子活性oocyte-like细胞提供了一个新的前景功能卵母细胞的形成。虽然功能齐全的卵母细胞临床研究仍在远处,这些尝试和改进提供了访问方法来研究女性GCs-specific基因,包括迁移途径、性分化,减数分裂的开始。现在,高效和可再生的协议PGCLCs分化成基因和epigenetically健康,针对病人的卵母细胞在需求。

4所示。当前的挑战和未来的观点

老鼠和人类女性GCs感应在体外从已经取得了显著的改善。时,它给我们的观点也引起了一些挑战已经被来源,女性GCs开发进展,归纳文化条件,和伦理问题。

首先,调查的一个关键问题是干细胞特征的鲁棒性与归纳。ESCs和万能都女GCs重构的能力在体外。尤其是则更受欢迎,因为少有害的访问和免疫排斥反应(10]。研究者证明不同的iPSC行来源于不同的细胞类型具有不同的女性GCs命运能力(81年]。从颗粒细胞来源研究人员演示了小鼠卵母细胞后细胞则具有更高的比其他细胞系生殖系能力,一定的人类颗粒细胞体外受精后丢弃也被视为一个更宽松的万能干细胞产生卵母细胞(细胞来源58]。人类则可以提供特定病人已经可用于调查针对疾病的发病机理在体外(26,82年,83年]。最近,一项研究建立人类万能4我从过早卵巢机能不全患者中。针对病人的细胞则是preinducedβFGF TGF 4天;然后,与先前的研究[7),DNA甲基转移酶抑制剂添加5天。然后,生成的细胞进一步诱导成人类PGCLCs BMP2/4,生活,自洽场,EGF和GMEM / KSR补充。相比人类PGCLCs感应方法,增加DNA甲基转移酶抑制剂增强人类PGCLCs归纳。因此,他们为人类提供了一个互补方式包括分化从特定的万能82年]。此外,已经被多能状态在感应也被认为是一个重要因素。以前,human-primed已经维持2周4我媒介获得天真的多能性,但研究显示天真的人类已经被保持在4我中等长时间有染色体不稳定和结构异常(84年]。当研究人员培养人类的天真已经4我媒介3天而不是2周,他们获得更稳定的人类天真已经能够感应到PGCLCs通过EB形成高收益的13天(85年]。因此,努力协调人类已经多能性状态建立更稳定的GCs感应PGCLCs也是一个重要的问题。

其次,女性GCs开发进展尚未清楚地显示。后女性潜在的GCs分化机制Wk3已经很大程度上获得了;然而,早期胚胎的调查之前Wk2保持很长一段时间不足。最近,一个全基因组DNA甲基化地图在人类胚胎植入前的发展揭示了单细胞染色质整体omic-scale景观序列在人类早期胚胎86年]。这给了我们一个提示关于人类起源包括Wk2之前。单细胞RNA-seq技术最近被用于分析转录组精子机制在不同阶段可以用于包括进一步分析包括迁移、增殖和分化87年]。此外,研究人员使用单细胞转录组和表观基因组测序技术和女性胎儿GCs分为三个连续的分化阶段,包括RA响应阶段,减数分裂的前期阶段,原始卵泡阶段。不同阶段对应不同的基因表达和表观遗传规则(26]。这些不同的表观遗传调控网络的女性GCs顺序发育阶段可以通过全基因组DNA甲基化和研究染色质易访问性使用单细胞分辨率(88年]。这些努力对女性GCs发展机制将有助于更高效和稳定的女性GC感应在体外。

第三,文化状况也会影响女性的生存gc。尽管人类PGCLCs已经又一次重复在体外,U-bottom 96板或其他类似盘子中使用这些研究有限人类PGCLCs规模生产的生产(6- - - - - -8]。最近,一个新的修改系统methylcellulose-based 3 d感应系统结合low-cell附件盘子据报道,从人类产生人类PGCLCs已经在大规模,拥有类似人类包括基因表达和表观遗传修改配置文件(88年]。除了3 d感应系统,3 d bioprosthetic卵巢也证实为卵母细胞培养提供3 d支持。3 d打印的微孔水凝胶支架的孔隙几何形状影响鼠标通过intrafollicular信号和卵巢卵泡生存微环境(89年]。当一个3 d打印的脚手架与卵泡移植手术消毒老鼠,他们能生出健康的后代。在下一步中,3 d打印的卵巢是否可以提供一个环境更相似在活的有机体内卵巢的微环境已经被感应未来需要调查。

最后,生殖医学的伦理问题一直吸引了科学界和公众的关注。建立消除担忧胚胎的细胞则破坏(10),没有严重的异常后代从老鼠已经被5]。然而,当涉及到人类女性GCs感应担忧干细胞来源,技术安全,生成细胞的临床应用,表观遗传调控的后代仍然广泛存在。

虽然完成从人类卵母细胞已经被尚未达到的一道菜,理论上可能可以整合现有的方法如人类PGCLCs感应,颗粒细胞由万能干细胞诱导,问卵母细胞形成,IVM MII卵母细胞治疗形式在体外。如果它是可能的,这将创建一个巨大的希望了解卵母细胞发展的复杂的生物学过程,也将提供一个独特的细胞模型infertility-related药物测试,甚至成为一个更合理的治疗不孕不育的前景。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们真诚地感谢杨长他和李Sizhe关键语言编辑的手稿。这项工作得到了上海市卫生委员会资助(201940204),国家自然科学基金的资助中国(81370700)、跨学科的资金从上海交通大学医学和工程(YG2016MS32)和上海合作创新转化医学中心(TM201827)。

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