多方面的优化MSC-Based配方在钠Iodoacetate-Induced骨关节炎模型结合有利的HA / PG水凝胶和荧光示踪剂

文摘

由于传统的补救措施的有界性关节软骨self-rehabilitation和增量的老年人,骨关节炎(OA)的发病率正在增加。实证研究揭示了间充质干细胞的优势,并承诺势/基质细胞(msc)耐火OA,而缺乏系统性和详细的探索MSC-based治疗很大程度上阻碍了大规模在再生医学中的应用。碘乙酸,我们最初利用味精(MIA)诱导OA兔模型和研究人类脐的疗效cord-derived UC-MSCs在串行剂量梯度与灿烂的透明质酸和/或丙二醇水凝胶(哈哈/ PG),分别。之后,我们变成了一个dual-luciferase记者跟踪系统和评估的时空分布和metabolokinetics bifluorescence表达UC-MSCs (BF-MSCs) OA老鼠。上述试验,我们验证了HA / PG和中msc(的组合 细胞/毫升)最终体现最优功效OA兔子。此外,借助生物荧光成像(BLI)技术在体外和动态在活的有机体内跟踪,我们直觉上划定的时空分布和治疗过程在OA BF-MSCs老鼠,充分证实了钢筋的HA / PG BF-MSCs OA治疗。总的来说,我们的数据一致地证明的中间剂量UC-MSCs结合公顷/ PG水凝胶是满足最佳MSC-based配方阻止OA进展,促进软骨修复,提供压倒性的新的引用和开明的MSC-based软骨缺损的治疗策略。

1。介绍

骨关节炎(OA)被公认为是最普遍和频繁的慢性退行性关节疾病属性等多维因素老化,超重,创伤,先天性异常,和关节畸形,特别是,预期寿命的增加(1,2]。尽管引人注目的进步和巨大的影响已经由多学科的策略,包括手术(例如,微裂缝和mosaicplasty),抗炎药物(如非甾体类抗炎药),联合润滑剂(如透明质酸),甚至细胞疗法(例如,自体软骨细胞移植),然而,自我修复和再生能力的限制在OA个人仍然阻碍进步的缓解关节软骨的退化3- - - - - -5]。

间充质干细胞/基质细胞(msc)异构和immune-privileged人口有多向分化潜力(如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和angiocellular),以其公认的组件在造血微环境以及得天独厚的资源转化医学(6,7]。数十年来,我们和其他调查人员照亮的识别和应用优势,并承诺从成人和围产期组织来源和人类一起多能干细胞(hPSCs)治疗难治性复发性疾病如再生障碍性贫血,acute-on-chronic肝功能衰竭(ACLF) fistulizing克罗恩病、急性心肌梗死(AMI)、危重肢体缺血(CLI) 2019 - (COVID-19)和冠状病毒病引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [8- - - - - -13]。最先进的更新显示的可能性msc作为替代选择软骨修复,特别是同种异体UC-MSCs得天独厚的优势在扩散和免疫调节和noninvasiveness12,14]。虽然在临床前试验利用UC-MSCs OA管理部分实现,然而,重启功能主管关节软骨远未满意,更不用说msc在安全性和有效性的细致的评价,也是大规模应用在治疗OA的先决条件(4,15]。

为目的,我们起初地利用完善的MIA-induced OA兔模型,并验证了优化组合方案的疗效比较中HA / PG和/或UC-MSCs在不同梯度(低、中或高剂量)。借助系统和详细的评估包括多个临床病理观察关节缺陷和疾病的分数染色以及综合主成分分析(PCA),我们终于澄清了最优功效的中间剂量UC-MSC和HA / PG复合。之后,我们采用上述复合时空的评估改善影响MIA-induced骨关节炎大鼠模型基于BLI dual-luciferase记者跟踪系统的信号。综上所述,我们介绍了多层面的优化配方治疗解剖OA的中等剂量的UC-MSC和有利的HA / PG水凝胶复合。

2。材料和方法

2.1。兔子

据王等人,哈特曼等人报道,随着年龄的增加,骨关节炎,关节软骨细胞的生物力学和代谢能力明显退化。老兔子容易软骨退化,影响模型的一致性和病理变化(16,17]。因此,28日健康新西兰白人男性兔子( 公斤)购买和隔离进行进一步的实验分析(玉达生物技术有限公司、天津、中国)。伦理委员会批准的所有程序都是天津医科大学眼科医院(批准文号:TJYY2018061114),和在活的有机体内荧光示踪实验研究SD大鼠和机构批准的动物保健和使用委员会放射医学研究所、中国医学科学院北京协和医学院。对于每一个SD大鼠,用异氟烷麻醉进行;双腿被注射用MIA如前所述[18,19]。UC-MSCs的总量(100μl /关节, 细胞/毫升)注射到膝盖的关节。同时,我们确认,所有程序在兔子和老鼠执行依照1975年的赫尔辛基宣言》(2008年修订)关于人类和动物的权利。

2.2。MIA-Induced兔骨关节炎模型

MIA-induced骨关节炎兔模型显示与几位修改之前报道15,20.,21]。短暂,28个兔子被随机分为7组:(i)负对照组(NC,没有任何治疗; ),(2)生理盐水组(MIA-induced OA,盐水注射; ),(3)HA组(MIA-induced OA, HA注入; ),(iv)公顷/ PG集团(MIA-induced OA, HA / PG注射; ),(v) HA / PG + UC-MSC(高)组(MIA-induced OA, HA / PG和 细胞/毫升注射; ),(vi) HA / PG + UC-MSC(中间)组(MIA-induced OA, HA / PG和 细胞/毫升注射; ),(七)HA / PG + UC-MSC(低)组(MIA-induced OA, HA / PG和 细胞/毫升注射; )。所有适用的机构和/或国家动物保健和使用指南。详细的程序和引物序列提供补充信息:补充过程和补充表S1。

2.3。准备UC-MSC和HA / PG水凝胶复合

UC-MSCs买来的细胞产品国家工程中心、国家干细胞工程技术研究中心(天津IMCELL干细胞和基因科技有限公司有限公司,天津)。不同浓度的UC-MSCs通道三个( 细胞/毫升, 细胞/毫升, 细胞/毫升)彻底混合1%玻璃酸钠/丙二醇(2:1、山东弗雷达生物技术有限公司,有限公司,中国;哈: Da,要求中国对医药产品)的良好生产规范MSC /水凝胶复合的一代。FCM分析的详细过程和抗体提供补充信息:补充过程和补充表S1-S2。

2.4。宏观分析

在OA的宏观分析股骨髁部和胫骨高原兔子是根据标准进行报道(22]。,上述膝关节后被精心收集了安乐死的考试在联合广泛严重的炎症或纤维化。然后,每只兔子的股骨和胫骨髁修复程度是评估宏观上通过修改版本的骨关节炎研究学会国际(OARSI)评分系统22]。详细3独立观察员分级OARSI利用随机和盲方法。这些观察员的一致性是由社会团体内部的相关系数,这是用于评估之间的关系相同的单一病理切片。

2.5。组织病理学分析

准备组织病理学分析显示为我们最近报道与几个修改6]。全层样品(包括股骨髁部和胫骨高原)有序的固定,脱钙,石蜡包埋,deparaffinized。OA的评价,故事的部分被使用光学显微镜(日本奥林巴斯,BX51)苏木精和伊红())后,Safranin-O /快速绿色或阿尔新蓝染色(北京Solarbio科技有限公司,中国),分别。骨关节炎的变化的等级评估是基于根据Mankin染色区域的得分和公式: (23]。详细的过程和存在分析提供补充信息:补充过程和补充表S1。

2.6。滑液中细胞因子表达的OA兔子

检测OA-associated炎症细胞因子和生长因子表达式,从每个膝关节滑液收集的兔子。首先,我们进行了滑液的制备:20 x稀释清洗解决方案:1:20双蒸馏水稀释(例如,1毫升的集中清洗解决方案增加了19个毫升重蒸馏的水)。白细胞介素- 6 (il - 6)的浓度,interleukin-1β(il - 1β)、转化生长因子-β1 (TGF -β1),和矩阵metalloproteinases-13 (MMP-13)检测与商业酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国研发系统,Inc .)根据制造商的指示我们最近描述(12,24]。详细的信息可以在补充信息:补充表S3。

2.7。主成分分析(PCA)

PCA用于显示当前的多元数据集的内部结构为一组坐标对应的高维数据空间中,我们和其他研究者报道6,25]。治疗组的影响及其相关性与其他特征确定基于XLSTAT利用主成分分析法(PCA)统计软件(美国纽约Addinsoft)。

2.8。在活的有机体内跟踪BF-MSCs(有/没有公顷/ PG) OA老鼠

在活的有机体内跟踪的BF-MSCs SD大鼠进行了基于生物荧光成像(BLI)信号(p / s /厘米²/ sr)为我们和我们的合作者最近报道与几个修改(11,26]。BF-MSCs与萤火虫荧光素酶(美国人)和绿色荧光蛋白(GFP)表达D-luciferin(33就做好了准备μl /毫克;关节内注射前开曼化学、美国)。然后,BF-MSCs的总量(100μl /关节, 细胞/毫升)注入每一个膝关节。图片是1 h, 48 h, 96 h和144 h和10分钟的曝光时间。详细的程序都可以在补充信息:补充程序。所有适用的机构和/或国家动物保健和使用指南。

2.9。统计分析

所有统计分析进行了正如我们之前描述的(12,27,28]。为三次实验进行了一式三份,和数据都显示为 (SD)。解剖为目的的多个参数之间的差异(包括Anderson-Darling测试,D 'Agostino-Pearson综合正常测试,Shapiro-Wilk正常测试,并与Dallal-Wilkinson-Lilliefor Kolmogorov-Smirnov正常测试值)的膝关节(8 4兔子每组膝关节),我们最初地检查了高斯分布,发现各自的价值总结NS,满足了标准的单因素方差分析。因此,单向方差分析(方差分析)是用于统计分析。值被认为是显著时 。 , , ,和 ;NS意味着不重要。

3所示。结果

3.1。温和UC-MSC和HA / PG综合有效地改善关节软骨的病理损害OA兔子

为了系统地,一丝不苟地解剖疗效和优化MSC-based配方在骨关节炎,我们最初地利用完善的钠iodoacetate-induced鼠模型(15,20.,21)(图1(一))。安乐死在13周后,完整的股骨和胫骨中膝关节的兔子表示组仔细通过外科手术中描述的材料和方法。区分这些生理盐水组(生理盐水注射OA兔),胫骨关节表面的显示部分改善病理损伤的关节软骨UC-MSCs或HA / PG水凝胶注射后,尤其是OA兔子与HA / PG +高或HA / PG +中间剂量UC-MSC政府(图1 (b))。同样,根据总形态学观察软骨磨损和软骨下骨暴露,MIA-induced OA关节内注射的兔子公顷/ PG +高和HA / PG +中间剂量UC-MSCs体现可比在股骨恢复功能(图1 (c))。

进一步定量确定改善关节软骨的病理损伤,我们求助于OA得分基于OARSI宏观评价体系和证实,兔子与HA / PG +高或HA / PG +中间剂量UC-MSC注入显示比其他组得分显著降低,而无法区分宏观观察这两个族群之间的差异(22)(图1 (d))。有趣的是,我们发现OARSI宏观得分兔股骨的HA / PG +中间剂量UC-MSCs进一步减少与HA / PG +高剂量UC-MSC集团,在一致性与流畅的形态特征的关节(数字1 (d)和1 (e))。总的来说,这些数据表明,适量UC-MSC和HA / PG复合显示优势改善宏观上兔子OA关节软骨的病理损害。

3.2。临床病理的评估比骨骨软骨缺损证实疗效的温和UC-MSC和HA / PG复合

在初步确定的改善疗效温和UC-MSC和HA / PG复合病理损害,宏观上指定的组我们随后分析了潜在的区别,在组织学水平。如图所示的代表的显微照片股骨髁部和胫骨高原),阿尔新蓝,和Safranin-O /快速绿色染色,兔子与HA / PG +中间或HA / PG +高剂量UC-MSC治疗表现出更少的关节软骨损失和表面不规则性以及典型的和同质关节软骨结构包括光滑、连续的表面和强劲的蛋白染色(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。相比之下,区分上述两组和NC组,表面不规则,颤或裂口,细胞结构的变化,并观察潮标和损失在不同程度上其他MIA-induced OA组(生理盐水、公顷或HA / PG集团)(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。

此外,定量分析了OA关节软骨病理部分的兔子是由测量区域的百分比与特定的染色,因为我们之前报道中描述和补充信息(25]。如图所示的计算基于上述)染色,HA / PG水凝胶结合剂量(低,中,高)UC-MSCs展出的比例明显高于彩色区域与生理盐水组相比,而类似于NC组(图3(一个))。阿尔新蓝染色,兔子获得HA / PG +中间剂量UC-MSC治疗表现出正面面积的比例明显高于胶原染色与生理盐水组相比。然而,没有观察到显著差异UC-MSC HA / PG +中间剂量与NC组(图3 (b))。一致,我们发现积极的地区的比例的趋势Safranin-O染色显示组中类似于阿尔新蓝染色。,兔子与HA / PG +中间剂量的UC-MSC政府表现出的比例明显高于阳性区域proteoglycan-associated GAG染色比其他OA组(图3 (c))。同时,我们旨在进一步解剖可能关节软骨的微观变化的基础上修改Mankin得分。关于Mankin分数)染色,兔子与HA / PG水凝胶+ UC-MSC注入显示得分低于其他组(生理盐水、公顷或HA / PG)在某种程度上(图3 (d))。不同于那些高或低剂量的UC-MSC治疗,兔子与中等剂量显示进一步减少Mankin分数阿尔新蓝和Safranin-O染色,分别为(数字3 (e)和3 (f))。综上所述,这些数据进一步证实了温和的最好功效UC-MSC和HA / PG复合压制OA兔子临床病理的变化。

3.3。UC-MSC和HA / PG复合一致地强化关节液的减少促炎细胞因子

广泛的研究表明多种促炎细胞因子的参与在骨关节炎关节软骨的损伤加速。因此,我们好奇是否OA的改善症状是由于重要的促炎细胞因子的减少。为目的,我们利用ELISA检测到指定的组。与NC组相比,我们直观地观察到il - 1的高程异常βil - 6, MMP-13, TGF-1β表达在联合液体盐水组(生理盐水注入MIA-induced OA),而dysupregulation被公顷/ PG和/或抑制UC-MSC治疗,特别是,进一步缓解HA / PG + UC-MSC管理局(数字4(一)- - - - - -4 (d))。与此同时,我们也注意到加强抑制对il - 1的影响β和MMP-13联合流体中UC-MSC和HA / PG复合(数字4(一)- - - - - -4 (d))。

全面评估改善效果,探索最优配方MIA-induced骨关节炎,我们利用主成分分析(PCA)在我们和其他人报道(6,25]。基于19显示参数参与病理损伤的关节软骨、骨软骨缺损的临床病理的变化,和促炎细胞因子,欧几里得几何地图显示当前多元数据集的内部结构为一组对应的高维数据空间中坐标。从PC1的角度(F1, 46.69%),兔子与HA / PG + UC-MSC(中间)注入更紧密的关系显示参数包括百分比和Mankin分数)/ Safranin-O /阿尔新蓝染色和TGF -β1相对于其他组(生理盐水,哈哈/ PG和HA / PG + UC-MSCs(低剂量))。至于PC2 (F2, 14.51%), HA / PG + UC-MSC(中间)政府远亲的参数包括炎性细胞因子(il - 6、il - 1β和MMP-13),这表明抗炎属性(图的优势4 (e))。总的来说,这些数据进一步体现适度UC-MSC和HA / PG复合举行有利的前景作为治疗OA的最优配方。

3.4。建立Bifluorescence表达BF-MSCs签名Immunophenotype和Multilineage分化

的时空解剖metabolokinetics UC-MSCs OA的治疗,我们利用生物荧光成像(BLI)技术与lentivirus-mediated dual-fluorescence记者构造(pLV-Fluc-eGFP)我们和合作者近日报道11,26,29日,30.)(图5(一个))。不断充实后,UC-MSCs表达高水平的设计师小金和GFP(表示BF-MSCs),也表现出成人msc代表immunophenotype(数字5 (b)和5 (c))。同时,进行multilineage分化检测,我们发现BF-MSCs足以,分别生成脂肪细胞,成骨细胞,和软骨细胞在指定的条件下如图所示红色O,茜素红,阿尔新蓝染色和存在的脂肪形成的分析(PPARγ和ADIPOQ),成骨的(RUNX2和BGLAP),chondrogenic - (能和SOX9(数字)相关基因5 (d)和5 (e))。此外,借助放大曲线和核型分析,我们验证了BF-MSCs基因编辑后表现出令人钦佩的在体外扩散和染色体稳定性(数字5 (f)和5 (g))。综上所述,与bifluorescence建立BF-MSCs表达式进一步拥有体面的签名在活的有机体内分析。

3.5。BF-MSCs表现出稳定的荧光强度在体外和在活的有机体内

进一步评估GFP的敏感性和美国人在BF-MSCs以及荧光增强作用效果的HA / PG水凝胶,我们起初地执行在体外是剂量依赖性实验通过种子细胞到12-well板在不同密度梯度。在一致性与我们先前的报道,美国的GFP和BLI信号强度显示适切地匹配强度与BF-MSCs的密度在体外在预处理与萤火虫荧光素酶底物D-luciferin(数字6(一)- - - - - -6 (c))[8,29日]。

为了验证的时空metabolokinetics BF-MSCs以及增强疗效的温和UC-MSC和HA / PG复合在活的有机体内,我们转向另一个行之有效的MIA-induced OA对SD大鼠(图模型6 (d))。不同于对照组只有UC-MSC注入(HA / PG)表示,有温和的老鼠UC-MSC和HA / PG综合管理显示延迟下降BLI信号的强度梯度BLI信号在活的有机体内成像系统(20),该建议的可信度HA / PG BF-MSCs增强作用的影响。此外,移植UC-MSC和HA / PG复合可以维持网站OA关节软骨的老鼠和生存一周(数字6 (d)和6 (e))。因此,BF-MSCs也足够敏感细胞的时空分布和代谢分析跟踪在活的有机体内和HA / PG水凝胶表现增强住宅UC-MSCs OA。

4所示。讨论

骨关节炎是关节软骨的本金和具有挑战性的障碍由于多种致病因素和人口广泛的人口,特别是长老正面临和挣扎在难治性慢性疾病的负担(2,4,5]。尽管取得了多方面的改进的多学科治疗如手术和抗炎药,然而OA的发病机理和功效与退化和功能巧妙地损失仍然复杂确定(3,31日]。承诺的,我们利用MSC-based cytotherapy和有利的HA / PG水凝胶复合材料优化的配方MIA-induced骨关节炎模型在兔子和老鼠。此外,辅助BLI信号,我们凭直觉和动态发现的时空metabolokinetics msc在活的有机体内,这将一致地对基础和临床研究的安全性和有效性评估MSC-based cytotherapy。

报道的msc、UC-MSC被认为是一种更可取的来源与优势包括长期为众多的复发和扩散和免疫调节属性难治性疾病重构包括软骨再生(12,32,33]。与此同时,我们也和其他研究者最近报道的矛盾的和有争议的功效UC-MSCs移植物抗宿主病等疾病,急性肝衰竭,细胞活力和剂量和骨关节炎MIA-induced属性,分别是(34- - - - - -38]。考虑到安全性和有效性或有风险,这是系统的重要性和必要性,一丝不苟地解剖的最优配方MSC-based疗法之前,大规模的临床应用。,进行关节内注射不同浓度梯度的UC-MSCs,我们发现中度MSC应用表现一致的功效,但最好在关节液抑制促炎因子的免疫调节能力。此外,BLI dual-fluorescence表示BF-MSCs足够的信号在活的有机体内细胞metabolokinetics的实时评估。

最先进的进展突出的可行性和协同与msc在再生医学生物材料39,40]。例如,公园等人报道UCB-MSCs和HA水凝胶在修复关节软骨损伤surgery-induced OA兔和大鼠模型,分别是(37,40]。然而,通过使用一个更现实的和棘手的MIA-induced模型特征包括糖酵解蛋白聚糖矩阵损失和破坏以及功能性关节损伤,van Buul等人发现MSC政府只能部分地减轻疼痛没有恢复有利于退行性变化的影响(38]。克服缺点,我们重复MIA-induced OA模型对兔子和老鼠和开展multifaced MSC-based配方的优化更有利的HA / PG水凝胶,这表现出增强治疗效果比HA和作为一个安全的和食品级成分通过美国食品和药物管理局(FDA)在改善骨性关节炎的进展41,42]。因此,我们进行了一种新型复合温和UC-MSCs和HA / PG水凝胶解剖治疗潜力MIA-induced OA模型。

有效评估对安全、效率和重现性的先决条件是在临床前和临床研究的大规模应用MSC-based疗法,特别是药动学和药效学特征在活的有机体内(14,34]。然而,大多数现有的细胞标记方法包括radioprobes和荧光团细胞长期监测不足是由于过度稀释剂在细胞增殖和持久性的信号从发布代理和死细胞43,44]。相反,我们和其他调查人员最近开发的一种间接和dual-fluorescent标签系统在活的有机体内MSC跟踪基于lentivirus-mediated GFP和荧光素酶(Luc),这是主管为示踪剂在外来体囊泡(11,26,45]。在这项研究中,我们的数据表明,该系统还能够追踪的时空metabolokinetics UC-MSC + HA / PG复合。最重要的是,msc在HA / PG显示更好的导航和延迟衰减在受损的关节软骨与单一公顷/ PG灿烂的粘弹性或UC-MSC管理属性,最小影响细胞行为,和封装的微环境由HA / PG (8,11,41,46]。

5。结论

总体而言,我们的数据表明,适度UC-MSCs和HA / PG复合提供一个最佳的配方在MIA-induced骨关节炎模型和再生医学的潜在减轻关节软骨缺陷。与此同时,BLI-based系统满足监控的动态代谢UC-MSCs(有/没有HA / PG)在活的有机体内的评估,希望MSC-based cytotherapy之前大规模应用。

数据可用性

使用的数据来支持这个研究的发现都包含在这篇文章。额外的数据与此相关的研究也可以从相应的作者。

的利益冲突

指定的商业公司包括Health-Biotech (https://www.health-biotech.com/en/intro.html),Amcellgene (https://www.amcellgene.com/en/),追逐太阳(http://www.chasesun.cn/)提供技术支持,我们表示我们的感谢“致谢”部分。

作者的贡献

Ai-tong王、孟赵进行实验,收集、汇编的数据;瀛丰商务、Honghong贾Zongjin Li Zhibo汉,和Zhongchao汉帮助收集和汇编的数据;Leisheng张和郝于导致概念和设计,数据分析和解释,手稿写作和手稿的最终批准。所有作者阅读和批准最终的手稿。Ai-tong王、孟赵的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由天津科技项目为海外学生(jh - 20180070802),中国博士后科学基金会资助的项目(2019 m661033),天津的自然科学基金(jcqnjc12500 19日),中国国家自然科学基金(81330015)、紧急项目由江西省科技部门ZCH(2020年),重点项目资助的上饶科技城2020,ZCH),河北省自然科学基金(H2020206403)。作者要感谢刘Dengke教授的企业博士后工作站天津追逐太阳制药有限公司有限公司的建议。同时,我们感谢武清开发区分别的博士后工作站的技术支持。

补充材料

补充表1:定量rt - pcr分析表明基因的引物序列。补充表2:抗体流式细胞术分析。补充表3:在这项研究中使用的ELISA试剂盒。补充程序:额外的过程伴随着主要的手稿。补充参考文献:额外的引用伴随着主要的手稿。(补充材料)

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