干细胞的治疗效果在男性不育大鼠模型:组织学、分子、生化和功能研究

文摘

氨甲叶酸(简称MTX)为甲酰叶酸拮抗剂,广泛使用的化疗和免疫抑制药物,但它是有毒的生殖系统。近年来,干细胞应用的时代成为一个有前途的点作为一个可能的治疗在男性不育的代理。本研究的目的是评估在组织干细胞的治疗效果,分子、生化和功能水平methotrexate-induced睾丸损伤模型。材料和方法。三十老鼠被随机分成三组(每十大鼠):组1(控制):动物收到的腹腔内注射4周每周2毫升磷酸盐,组2 (MTX-treated组):动物腹腔内注射甲氨蝶呤(8毫克/公斤)曾经为4周,每周和组3 (ADMSC-treated组):methotrexate-treated动物收到一剂 干细胞/老鼠在第五周。在第八周,收集血液样本荷尔蒙分析;然后,动物被牺牲了。睾丸解剖;正确的睾丸与苏木精和伊红染色。随机的部分是取自群3和荧光显微镜检查。左侧睾丸被分为两个标本:第一个是用于电子显微镜和第二个是均质分子和生化评估。结果。组2显示明显的组织学变化,减少游离睾酮水平,减少干细胞因子表达式,氧化态和功能障碍。结果显示这些参数的重要改进。结论。干细胞移植脂肪tissue-derived (ADMSCs)可以提高睾丸损伤的组织学和功能在老鼠模型中。

1。介绍

近年来,干细胞应用的时代成为一个有前途的研究可能在男性不育治疗代理(1]。隔离的骨髓间充质干细胞是面对痛苦,发病率和低细胞数量。脂肪tissue-derived间充质干细胞(ADMSCs)来自间质,它包含一个支持性的基质,很容易孤立;因此,它代表了干细胞的来源会对几个字段(产生深远影响2]。

化疗药物已报告造成永久性精子缺乏和男性不育3]。氨甲叶酸(简称MTX)为甲酰叶酸拮抗剂,广泛使用的化疗和免疫抑制药物。有毒副作用的甲氨蝶呤在各种动物。这似乎是肝毒素的肾毒性,危害生殖系统(4]。根据不同的调查,男性因素不育似乎是25% -50%的病例5]。睾丸损伤是最重要的MTX的潜在副作用。研究报道,MTX诱导生产过剩的活性氧(ROS)和氧化应激。MTX-induced ROS的显著影响男性生育能力。活性氧引起DNA损伤,内皮功能障碍,总值和线粒体膜损伤,损伤细精管,精原干细胞的细胞凋亡(细胞)6]。

大麻等人表明,睾丸内皮细胞(tec)的一部分SSC利基产生胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)和其他因素来支持人类和小鼠精原细胞在长期的文化7]。

ROS也导致线粒体膜损伤刺激睾丸生殖细胞的凋亡,与随后的精子数减少和精子DNA损伤后管理(6]。

谷胱甘肽(GSH)是一个重要的胞质抗氧化剂和需要NADPH的有效措施。MTX抑制了NAD (P)端依赖脱氢酶和辅酶ii苹果酸脱氢酶,降低NADPH的可用性。因此,作为一种抗氧化剂谷胱甘肽的有效性随MTX(中8]。此外,它破坏了细胞膜不饱和脂肪酸,增加脂质过氧化和生产丙二醛(MDA),这被称为一种常见氧化标记(9]。

所以ADMSCs可以通过几种机制组织修复和再生,他们可能会分泌细胞因子和生长因子,刺激经济复苏10]。此外,它会抑制免疫反应11]。精原干细胞(精原细胞)复制不仅维持干细胞池也区分为spermatogonia,精母细胞和精子。利基的睾丸细胞的命运决定的主要监管机构,因为它是由支持细胞(SC),细胞因子,生长因子,血管12]。

睾丸内皮细胞(tec)是一个关键的人口生殖细胞分泌GDNF,纤维母细胞生长因子2 (FGF-2),基质细胞衍生因子- 1 (SDF-1)、巨噬细胞炎性蛋白- 2 (MIP-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP-2)。ROS-induced睾丸内皮细胞的功能障碍干扰细胞的自我更新8]。

塞尔托利氏细胞分泌多种生长因子如胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)干细胞因子(SCF),维甲酸(RA),和骨形态发生蛋白4 (BMP4) (13]。GNDF已被证实能促进精原细胞的自我更新;自洽场、bmp和RA诱导精原细胞分化[14]。自洽场是一种细胞因子,激活酪氨酸激酶受体c - kit,负责监管spermatogonia增殖和分化和调和RA和BMP4的影响在精原细胞分化[15]。在目前的研究中,我们旨在评估ADMSCs methotrexate-induced睾丸损伤的治疗作用在大鼠使用组织学、分子、分子和功能参数。

2。材料和方法

2.1。动物和实验设计

研究了30日Sprague-Dawley白化大鼠体重介于200到250 g购买动物屋的兽医学院,苏伊士运河大学。所有老鼠关在实验室控制条件下,和他们商业鼠饲料和饮用水,随意。老鼠被随机分成三组(每组10)。第1组(对照组):动物收到每周的腹腔内注射2毫升磷酸盐为4周。组2 (MTX-treated组):甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸拮抗剂,具有抗肿瘤的特征。注射用甲氨蝶呤(Mylan)瓶从Al-Gomhoria制药公司购买,埃及开罗。动物腹腔内注射的剂量MTX 8毫克/公斤体重曾经为4周(每周16]。组3 (ADMSC-treated组):与MTX治疗大鼠4周收到一剂PKH26-labelled ADMSCs /鼠( )(175)^th上周,通过尾静脉注射。

老鼠每周称重一次。在8^th下星期,收集血液样本荷尔蒙分析全身麻醉。然后,通过颈部位错动物被牺牲了。阴囊的睾丸被轻轻地解剖自由和体重。正确的睾丸是沉浸在Bouin固定解决方案,加工成石蜡切片,苏木精和伊红染色光显微镜检查。随机无污点的部分是取自ADMSC群和immunofluorescent显微镜检查。左侧睾丸被分为两个标本:第一个是用于电子显微镜检查和第二个样品是用于均质化和生化分析。

2.2。制备ADMSCs

腹膜后脂肪组织分离出健康老鼠十四周岁后麻醉和划痕。收集到的脂肪在血管解剖和反复用磷酸缓冲盐(PBS)。然后,它被切成小块 然后用0.075%的I型胶原酶消化37°C为30分钟。High-glucose杜尔贝科修改鹰的含有10%胎牛血清的培养基,用于阻止酶的反应;然后,离心分离是为了获得一个沉淀。细胞被播种在75厘米²培养皿中使用完整的新媒体(Lonza Bioproducts,比利时、德国)孵化有限公司5%₂48小时。第三段之后,这些细胞被收获用0.25%胰蛋白酶1分钟(18]。

2.3。表征ADMSCs

孤立ADMSCs身体特征,通过纺锤状形态和塑料坚持文化的菜肴和immunophenotypically CD34-ve、CD29 + ve,使用流式细胞仪和CD105 + ve单克隆抗体FITC (CD34(目录# ma1 - 10204、表达载体),CD29(目录# 11-0299-42,英杰公司),和CD105(目录# ma1 - 19594、表达载体))。所有单克隆抗体FITC评估根据制造商的指示。

2.4。标签的ADMSCs

CD34-ve特征、CD29 + ve CD105 + ve ADMSCs标签在连接程序PKH26红色荧光染料(Sigma-Aldrich、德语、商品目录号。MINI26)。最终的浓度 M PKH26染色和 细胞/毫升2毫升总量是彩色根据制造商的指示。

收获后,细胞在上面的数在1毫升的稀释剂C resuspended(提供的工具包),移液,以确保完整的色散。1毫升的细胞悬液迅速加入1毫升PKH26染色,立即与移液混合。样品在25°C孵化2 - 5分钟,温柔的反演混合管的保证。然后,通过添加血清反应是停止1分钟。细胞在2000转离心10分钟25°C,和10毫升的完全培养基添加到细胞。

2.5。光显微镜检查

三个字段每五个串行部分从每个动物组织学评估中随机挑选。生殖上皮厚度和管直径测量使用斐济ImageJ程序(1.52版本我,美国国立卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)。评估生殖上皮厚度和管直径是根据jtb(表完成的1)。彩色部分的考试是由使用徕卡DM 1000光学显微镜。

2.6。荧光显微镜检查

跟踪动物注射后ADMSCs检测它们对组织的影响是很重要的。PKH26-labelled细胞很容易通过考试发现随机选择从茎cell-treated组无污点的石蜡切片,用荧光显微镜(德国Leistungselektronik Jena GmbH)。

2.7。电子显微镜检查

左睾丸的标本被分成小块,磷酸盐2.5%戊二醛溶液中浸泡两个小时(pH值7。4)在4°C,用磷酸盐缓冲洗净,然后后缀一小时四氧化锇的缓冲溶液在1%。超薄部分被削减美国使用RMC超微切片机,染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,然后检查与1200前合影Π(JEOL、日本)电子显微镜单元(Ain Shams大学理学院开罗)。

2.8。化的睾丸组织

组织切片被冲毁在0.01改性磷酸盐(MPBS)。组织蛋白提取试剂添加根据1 g的比例(5 - 10毫升)和混合冰水。后混合,混合物在5000 - 10000转离心10分钟。上层清液的一部分立即测试,部分是储存在-20°C到-80°C。

2.9。分子的评估

免疫印迹的睾丸组织匀浆做是为了评估相对表达的可溶性形式的干细胞因子(SCF)在六个样本冷冻睾丸组织匀浆(从每组两个)。这项技术是根据制造商的指示(表达载体、目录# pa5 - 79558)。

2.10。生化氧化态的评估

oxidant-antioxidant状态的据估计通过测量睾丸匀浆脂质过氧化物丙二醛(MDA) (Biodiagnostic,埃及,猫。不。医学博士25 28),减少谷胱甘肽(GSH) (Biodiagnostic,埃及,猫。不。GR 25 10),和总抗氧化能力(TAC) (Biodiagnostic,埃及,猫。不。助教25 12))。MDA的比色测定、谷胱甘肽和TAC是根据制造商的指示(http://www.bio-diagnostic.com)。

2.11。功能评估有效的配子形成(无血清睾酮水平)

血清睾酮水平评估使用游离睾酮酶联免疫试剂盒(MyBioSource、埃及(目录# MBS262755))。

3所示。统计分析

所有数据被编码和分析使用社会科学统计软件包(SPSS)软件版本19。结果表示为均值和标准差。单向方差分析被用来比较不同组的方法。事后测试完成。关联和预测之间的关系值是使用简单,多元回归分析在两个或两个以上的变量,分别。差异被认为是重要的时候 。

4所示。结果

4.1。物理数据

老鼠的体重和左、右睾丸重量各学习小组进行评估。在单向方差分析,没有发现显著差异在不同的学习小组( ,分别为0.3和0.6)(数据没有显示)。

4.2。移植ADMSCs Immunophenotypic表征

扩张后,细胞从老鼠腹膜后脂肪组织获得immunophenotypically流式细胞术的特征。细胞表现出明显的表达CD29(79%)和CD105(70%),如图1(一)和1 (b)分别,而表现出消极表达CD34(图1 (c))。

4.3。苏木精和伊红结果

组织学模式显示对照组大鼠睾丸的正常结构的细精管正常的圆形或椭圆形的轮廓。这是常规的基底膜和肌肉的细胞包围。小管内衬正常生殖上皮。超过80%的检查小管有10分(表2,图2)。Spermatogonia小圆顶状水泡或不透明的核,大多边形初级精母细胞。小圆早期精子的细胞和晚期细长的精子附着在顶端的塞尔托利氏细胞和少量的细胞质小凝聚核;同时,成熟精子中解放出来的尾巴在小管的内腔。塞尔托利氏细胞出现三角形细胞躺在基底膜。间质组织中血管,集群的多边形嗜酸性细胞圆形中央肃然起敬核和睾丸间质细胞。小管周围肌肉的细胞持平核(图3(a))。

MTX组中发现严重破坏的部分细精管不规则轮廓和显著收缩他们的直径和减少生发上皮厚度(图2)。与完整的精子发生的细胞系和支持细胞的损失,一些细精管脱落生殖细胞进入管腔;人空泡形成和成熟的精子,损失显著降低约翰逊分数的值如表所示2。拥挤的血管膜和膜与间质水肿vasculosa观察(数字3(b)和3(c))。

部分从ADMSC-treated老鼠产生逆转MTX-treated老鼠的组织病理学变化。小管大纲是定期之间的小间隙结缔组织,含有组睾丸间质细胞,与对照组相似。有恢复正常的生发和塞尔托利氏细胞显著增加的小管精小管的直径和生殖上皮厚度。还有一个重要的修复约翰逊分数,超过40%的检查小管有9分。这些结果与对照组(表2,数据3(d)和2)。

4.4。荧光显微镜

注入的msc是用荧光染料标记,检测归航的睾丸组织内的细胞是有效地完成的。成像清白的睾丸部分产生的红色荧光团白膜的标记细胞,间质组织,细精管(图的衬里4)。

4.5。透射电子显微镜的结果

4.5.1。对照组

正常睾丸超微结构观察。细精管有规律包含正常肌肉的细胞与基底膜平坦的原子核,道路两旁两种spermatogonia: A型和b型spermatogonia特点是大苍白的卵圆形核包含常染色质和外围的染色质。B型spermatogonia规模较小和更常染色质包含圆形细胞核。初级精母细胞与微弱的颗粒大的球形核染色质和球形线粒体外围(图5(一个))。滋养细胞基底膜的径向延伸的腔小管有大量苍白的原子核,许多光滑内质网,线粒体(图5 (b))。早期精细胞圆形,大,周边的线粒体和大量球形常染色质的核覆盖着一个顶端acrosomal帽(图5 (c))。此外,腔中含有许多正常精子(图的横截面5 (d))。正常的间质组织毛细血管附近含有睾丸间质细胞。细胞与外围大常染色质的核染色质和杰出的核仁和大量的线粒体和脂滴(图5 (e))。

4.5.2。Methotrexate-Treated集团

失去正常的架构和分心的基底膜以扭曲的肌肉的细胞被观察到。我们观察损伤spermatogonia和塞尔托利氏细胞的凋亡严重萎缩的黑暗核和小黑暗细胞质。初级精母细胞坏死和丢失或异常核(数字6(一)和6 (b))。早期和晚期精子在基底间出现在错误的地方。异常acrosomal限制出现在一些早期的精子和精子畸形人物6(一)和6 (c))。有异常的扩大与退化睾丸间质细胞的间质组织包含集群分布的不规则收缩核异染色质(图6 (d))。

4.5.3。ADMSC-Treated集团

睾丸组织的超微结构显示恢复正常组织与常规的基底膜和肌肉的正常细胞。小管内衬正常spermatogonia,初级精母细胞常染色质的核大,支持细胞出现大常染色质的核(图7(一))。空泡形成的一些空间之间仍然存在生殖细胞和延伸早期精子正常的限制。精子部分显示不同的阶段:中央基因丝外致密纤维和线粒体鞘包围,纤维鞘,或原生质膜(数据7 (b)和7 (c))。间质组织是与对照组(图7 (d))。

5。分子和功能评估

5.1。评估的配子形成免疫印迹分析均质干细胞因子(SCF)的睾丸组织

自洽场相对表达的免疫印迹试验做了6个样品均质睾丸组织,每组的两个样本(图8)。如图9(一个)现金流量表,睾丸的显著差异表达水平检测学习小组( )。自洽场表达显著减少MTX-treated组相对于对照组( );然而,ADMSC移植显著增加了自洽场表达式相比MTX-treated组( )。

5.2。评估雄性激素水平血清游离睾酮

血清游离睾酮水平水平评估使用ELISA。一个高度显著差异被发现在所有学习小组( ),有高度显著降低血清睾酮水平在两个MTX -和ADMSC-treated组相对于对照组( )(图9 (a))。然而,ADMSC组显示高度显著提高血清睾酮水平相比MTX-treated组( )(图9 (b))。

5.3。现金流量表理由的睾丸组织和血清睾酮水平的关系

有效的配子形成的功能评估,在血清睾酮水平,显示强阳性与睾丸的自洽场水平显著相关( ),回归模型是很有意义的, , ,和 ,表明睾丸自洽场表达式占方差的68.5%血清中睾酮水平(图10)。

5.4。在均质睾丸组织评估Oxidant-Antioxidant地位

睾丸的TAC、谷胱甘肽和MDA进行评估,以确定可能的oxidant-antioxidant失衡MTX-induced睾丸损伤的作用。学习小组中查出了一个高度显著差异( )。抗氧化能力,代表了在TAC,谷胱甘肽,显示一个高度明显降低MTX-treated组和ADMSC组相对于对照组( )。脂质过氧化反应,也代表着在MDA,明显高于在两MTX -和ADMSC-treated组相对于对照组( )。然而,ADMSC oxidant-antioxidant失衡组显示出了极大的提高,MTX-treated组相比,具有显著改善TAC和谷胱甘肽水平( )和一个高度明显降低MDA水平相比MTX-treated组( )(图11)。

5.5。为研究氧化应激的作用

5.5.1。氧化应激之间的相关性和睾丸自洽场表达式

斯皮尔曼相关,睾丸自洽场呈显著正相关与睾丸TAC谷胱甘肽( 分别和0.87),而与MDA显著负相关( )被发现。总体回归模型是重要的;在进行多元回归分析, , ,和 ,表明睾丸水平的TAC, MDA,谷胱甘肽占92%的方差在睾丸自洽场表达式。

5.5.2。氧化应激与血清游离睾酮水平之间的相关性

使用皮尔逊相关,血清睾酮水平呈显著正相关与睾丸TAC谷胱甘肽( 分别和0.92),而与MDA显著负相关( )被发现。在多元回归分析中,总体回归模型是很有意义的, , ,和 ,表明睾丸水平的TAC, MDA,谷胱甘肽占87.9%的血清睾酮水平的方差。用实验方法的总结和结果如图12)。

6。讨论

本研究旨在阐明tissue-derived脂肪间充质干细胞的治疗作用与甲氨蝶呤的影响。广泛用于治疗癌症和自身免疫性疾病,尽管其不良影响,特别是在睾丸和男性生育能力。在学习的效果MTX对老鼠身体和睾丸重量(左、右),控制老鼠相比没有显著差异(4,20.];我们也没有发现显著差异。

H&E-stained睾丸部分显示拥塞和间质水肿,伤亡和损失的胚细胞和支持细胞,睾丸间质细胞变性,减少意味着生殖上皮厚度、和小管直径表示减少精子发生和不孕。这些组织病理学变化是在协议与以前的研究报道,MTX诱发变性和萎缩的细精管,脱落生殖细胞的基板,在精子的数量和质量下降,严重的生殖上皮的细胞凋亡(19,21,22]。生殖上皮损伤导致显著降低约翰逊分数;同样发现了(21,23]。

电子显微镜结果表明,严重损害了胚细胞,滋养细胞和睾丸间质细胞,证实了光学显微镜的结果。我们的结果同意(24]。他们调查对MTX-induced proanthocyanidin睾丸损伤的保护效应,发现变形的胚细胞凋亡滋养和支离破碎的睾丸间质细胞之间的分离。

干细胞因子(SCF)分泌塞尔托利氏细胞在诱导精原细胞分化中起着重要作用[14]。在我们的研究中,MTX毒性显著降低的自洽场因子表达式支持细胞与对照组相比,造成严重损害细胞光和电子显微镜结果证明了这一点。目前的结果显示,血清睾酮水平明显降低由于受伤发生在睾丸间质细胞后MTX政府,这是按照(6,25]。睾丸激素在精子形成有重要作用,因为它刺激蛋白质合成在所有类型的精子发生的细胞,导致精子发育。所以,睾酮分泌减少导致生殖细胞的蛋白质合成障碍与随后的生殖细胞的退行性变化(26]。

中介MTX-induced睾丸损伤可能的潜在机制。它诱发氧化应激损伤睾丸组织通过oxidative-antioxidant不平衡体现在当前的研究中。MTX管理导致脂质过氧化作用显著增加(MDA)增加和抗氧化能力的严重恶化(减少谷胱甘肽和TAC)与对照组相比。这种抗氧化失衡导致自由基产量的增加,DNA损伤、细胞凋亡,和正常精子发生的逮捕。在最近的研究中,oxidant-antioxidant失衡有密切关系的程度代表睾丸损伤的程度减少自洽场表达式从塞尔托利氏细胞和血清睾酮水平。类似的结果为(21,27,28]。

近年来,干细胞应用的时代成为一个有前途的研究可能在男性不育治疗代理(1]。脂肪tissue-derived间充质干细胞为代表的多能成体干细胞由于其相对丰富和易于隔离(29日)具有高增殖能力和生产一个巨大的细胞数量和可以扩展的时间更长比骨骨髓来源干细胞(30.]。

ADMSC-treated集团在目前的研究中,显示改善睾丸组织的结构和功能。H&E-stained睾丸部分显示正常衬里的细精管分离与正常的间质组织中含有正常睾丸间质细胞的约翰逊得分相比,显著改善MTX-treated组。微观电子显微镜结果证实了光的能力。这些结果解释的治疗效果在睾丸组织移植后ADMSCs归航。通过immunofluorescent自导检测睾丸组织的考试。也有显著增加的自洽场水平均质组织的MTX组相比,由于支持细胞的正常结构和功能的恢复与提高干细胞移植后游离睾酮水平,相比MTX-treated组,由于睾丸间质细胞的正常结构和功能的恢复。

与我们的结果一致,萧et al。31日)发现,间充质干细胞从脂肪组织保护从睾丸生殖细胞torsion-induced不孕通过减少氧化应激,防止细胞凋亡,并支持精子形成的分泌自洽场局部注射后的msc。Ommurugan et al。32]得出的骨髓间充质干细胞来源于人类可以是一种有效的治疗MTX-induced gonadotoxicity在老鼠身上,因此会引起不孕的治疗。

ADMSCs能刺激精子发生的细胞增殖和完成他们的部门恢复正常的精子发生(33]。ADMSCs分泌的生长因子,血管内皮细胞生长因子等,减少细胞凋亡,胰岛素样生长因子- 1,也就是认为干细胞增殖,刺激肝细胞生长因子,作为凋亡的因素。这些分泌细胞因子诱导mRNA和蛋白表达来修复受损的睾丸34]。增效ADMSCs对精子发生的影响是显著增加证明了自洽场表达式支持细胞和血清睾酮水平在ADMSC组相比MTX组。这些结果符合Karimaghai et al。35]histomorphometric效应评估的ADMSC异体移植术的细精管胚细胞的再生busulfan-induced缺乏精子仓鼠。

所以我们研究的重要成果之一,临床使用ADMSCs可能是有益的治疗男性不育治疗造成甲氨蝶呤管理。男性患者化疗可能同行脂肪组织msc化疗开始前需要进一步完成化疗计划后作为支持性疗法。

研究成熟精子形态和能动性是我们研究的局限性,以及检测附睾MTX的影响。

7所示。结论

脂肪间充质干细胞(ADMSC)移植减轻氧化应激睾丸损伤、改善足细胞损伤。这反过来又恢复正常的睾丸,刺激spermatogonia细胞增殖和分化。所以它可以提高睾丸损伤的组织学和功能在老鼠模型中。因此,甲氨蝶呤应该明智地使用,因为它会影响睾丸,导致生育率下降,所以安全使用这种药物的患者完成了他们的家庭。研究妊娠的发病率在交配和胚胎发生后是我们的一个建议未来的研究在这个领域。

数据可用性

合理的请求数据。

伦理批准

所有程序中执行这项研究涉及动物的道德标准都是按照制度动物医学院伦理委员会,苏伊士运河大学。

的利益冲突

没有利益冲突。

引用

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