激活人类脐带血富含血小板血浆提高有益人类脐带间充质干细胞对化疗所致的影响POF老鼠

文摘

保存卵巢功能的卵巢功能早衰(POF)患者接受化疗是生殖医学领域的一个重要问题。目前,人类脐带间充质干细胞(HucMSCs)用于治疗POF,但是效果仍然不是最优。本研究的目的是确定是否人类脐带血富含血小板血浆(ucPRP)提高的有利影响HucMSCs POF的治疗。首先,我们观察到的影响生物活性的变化ucPRP HucMSCs体外。随后,我们跟踪的分布和功能的HucMSCs POF老鼠和老鼠的发情周期和血清性激素,卵泡发育,卵巢血管生成,卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和评估。研究结果表明,添加ucPRP体外加速扩散,减少细胞凋亡的HucMSCs HucMSCs具备干细胞在移植基因。联合移植HucMSCs和ucPRP导致更多的干细胞被保留在卵巢的老鼠,老鼠的发情周期POF被恢复,血清E2水平,抗苗勒氏管激素,和FSH改善受损毛囊开始生长。最后,我们确认的潜在机制的结合HucMSCs和ucPRP救援POF老鼠的卵巢功能是促进卵巢血管生成,促进扩散,减少卵巢颗粒细胞的凋亡。抗苗勒氏管激素的upregulation FHSR caspase-3表达的差别,对这些基因的表达在颗粒细胞潜在的卵巢功能的恢复机制。我们的研究结果表明,联合应用HucMSCs和ucPRP是一种安全、有效治疗POF的移植程序,从而为临床应用提供可靠的实验依据POF的干细胞疗法。

1。介绍

卵巢功能早衰(POF)是临床上定义为在年轻女性卵巢功能下降,主要表现为月经失调,FSH异常增加,雌激素减少波动,甚至不孕不育(1]。POF通常是由遗传等因素引起的,免疫力,放疗和化疗。大约有5%的癌症患者需要化疗是年轻女性2]。恢复卵巢功能在年轻女性接受化疗的相关损失生育是一个迫切需要解决的问题。有很多治疗POF的方法:激素替代疗法(HRT),免疫调节治疗,和卵巢组织冷冻保存。然而,这些治疗方法有一定的局限性,包括乳腺癌或卵巢癌的风险增加,致命的过敏反应,复杂的外科手术,无法促进受损的卵巢组织再生(3- - - - - -5]。

干细胞疗法,最有前途的治疗促进组织损伤修复,已被用于再生各种组织。间充质干细胞(msc)的家庭属于多功能干细胞,干细胞的特征:自我更新,自导,和定向分化能力6- - - - - -8]。在这些细胞中,人类脐带间充质干细胞(HucMSCs)来自胎儿的脐带传递附件,有广泛的来源,更少的伦理争议,低免疫原性,被认为是干细胞治疗的最佳选择(9,10]。最近,两例报道了激动人心的结果,HucMSCs部分提高POF老鼠的卵巢功能11,12]。然而,的低存活率和不确定疗效HucMSCs移植后仍限制其临床应用。改善的功效HucMSCs已成为干细胞移植治疗的最大挑战。

富含血小板血浆(PRP)主要由生长因子如血小板源生长因子(PDGF),纤维母细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和转化生长因子β1 (TGF -β1)。它可以发挥强大的作用,各种类型的组织损伤的修复,包括骨关节炎修复视网膜修复肾脏损伤修复、皮肤损伤修复(13- - - - - -16]。最新的研究表明,自体PRP移植改善卵巢内分泌功能,使一些POF患者有机会怀孕的17,18]。通常,富含血小板血浆和静脉血分离。研究表明,人类脐带血富含血小板血浆(ucPRP)源自脐带生长因子超过富含血小板血浆来源于外周血,PDGF和FGF等。这些生长因子发挥决定性的作用在msc的增殖和分化19,20.]。

HucMSCs和POF ucPRP展示了强大的组织修复功能,我们假设他们的结合使用可以加快恢复受损的卵巢。在我们的体内和体外研究中,我们观察到的影响ucPRP HucMSCs的生存。幸存的HucMSCs挽救受损的卵巢的功能(21]。我们最初探索的有利影响和潜在机制的结合应用HucMSCs ucPRP。已经证明的联合移植HucMSCs和ucPRP结果在一个更有效的临床治疗POF的计划。

2。材料和方法

2.1。HucMSC隔离和文化

我们遵守道德委员会的要求广西医科大学第一附属医院。许可的病人,我们从患者获得捐赠的人类脐带组织诞生了25 - 30岁。使用的简单流程如下:我们把收集脐带PBS中含10%的抗生素(美国Gibco)无菌操作表,删除血液和粘液,将线切成小块的组织(2毫米),坚持在培养皿底部;培养皿倒在2小时的孵化器和组织块被允许干,而alpha-MEM含有10%的边后卫(美国Gibco)补充道,后放在孵化器继续培养,直到HucMSCs爬出来的组织块。confluency细胞达到90%之后,他们培养的5代的后续实验(22]。

2.2。HucMSC识别和分化潜能

根据国际社会的要求为细胞治疗(ISCT)意见书,我们确定了纯化HucMSCs通过流式细胞仪(美国BD生物科学)和人类MSC分析工具包(美国BD 562245)。识别trilineage HucMSCs的潜力, HucMSCs被播种在6-well板和成骨分化培养基(Cyagen huxuc——90021年,中国)取代后细胞汇合的70%,每3天刷新中。经过21天的感应,细胞在显微镜下观察染色茜素红染色方案。根据指令的脂肪形成的工具包(Cyagen huxuc——90031年,中国),HucMSCs在6-well培养板的confluency 100%,然后,媒介的解决方案是添加为孵化3天,紧随其后的是替代解决方案B 1天。四个周期后,B的解决方案是更换,其次是孵化为5天。这些细胞被沾油红O染色溶液和在显微镜下观察到。按照指示chondrogenic分化工具包(Cyagen huxuc——90041年,中国),HucMSCs chondrogenic分化中孵化,媒介是每3天刷新。21天培养后,阿尔新中细胞在显微镜下观察。未分化HucMSCs与茜素红染色,油红O,控制和阿尔新蓝染色,分别;在显微镜下观察到的细胞(日本奥林巴斯BX53F)。

2.3。制备ucPRP

伦理委员会的许可和病人的知情同意,25 - 30岁健康女性的脐带血采集与柠檬酸钠试管(ShoeBio L14068,中国)。根据两部分离心方法,样本第一次离心机 。10分钟后,上层清液被再次离心 10分钟去除上层。剩余的0.4 mL被视为ucPRP,和血小板resuspended浓度 。然后,20% CaCl₂(美国Sigma-Aldrich)和1000 U /毫升凝血酶(中国Solarbio T8021)被添加到血小板混合物,这是孵化在37°C 1 h,然后离心机 30分钟完全沉淀包含细胞碎片的果冻和纤维蛋白凝块。收集的上清液过滤0.22 nm网和储存在-80°C,以避免反复冻融23]。

2.4。EdU检测

执行一个EdU试验表明HucMSCs proliferation-promoting ucPRP的效果。EdU胸苷的模拟,可以穿透复制DNA分子在细胞增殖。我们建立了一个10%的边后卫对照组( )和一个包含10% ucPRP干预组( )。HucMSCs ( )被接种到96孔板,直到孵化confluency细胞达到70%,然后用无血清培养基培养24小时,这是EdU-containing取代10%的边后卫和10% ucPRP和孵化24小时。然后,EdU工具包(中国RiboBio C10310)遵循指示进行实验。immunofluorescent信号被评估使用一个表达载体™evo™FL汽车(日本尼康公司),和积极性率进行了分析通过使用ImageJ(美国国立卫生研究院)。

2.5。流式细胞术分析

细胞凋亡分析, HucMSCs接种在6-well盘子。confluency当细胞达到70%,无血清培养基的更换,以及细胞培养24小时,其次是孵化24小时中含有10%的边后卫ucPRP 10%。根据指令的膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(KGA107,灵活运用生物技术,中国), 细胞被收集,5μL膜联蛋白V-FITC和5μLπ被添加,这些细胞被孵化15分钟,在一个黑暗的环境之后,立即评估通过流式细胞仪(美国BD生物科学);每一组独立重复了4次。

2.6。基因分析

观察HucMSCs ucPRP在具备干细胞的影响, HucMSCs P5代不同捐赠者的接种6-well板,分别。无血清培养基取代后24小时在对数生长阶段,媒介与10%的边后卫和10% ucPRP刷新和培养24小时。收集到的细胞在寒冷的PBS洗3次。核糖核酸纯化根据指令HiPure总RNA的迷你包(Magen R4111-03,中国),和下一个实验。互补脱氧核糖核酸通过反向转录随后用于20μL rt - pcr系统。PCR进行根据以下参数:94°C变性2分钟,其次是40周期为30秒56°C, 35秒72°C, 76°C 2秒。GAPDH是用作内部控制,所有样本重复3次。见表1基因序列。

2.7。干细胞移植

实验动物是动物保健福利和伦理委员会批准广西医科大学。雌性SD大鼠(6 - 8周)从广西医科大学动物实验中心的购买和住在一个温暖的环境24°C。足够的水和食物,和动物们经历了12 h / 12 h每天交替光明与黑暗。二十个成年雌性老鼠被证实有一个正常的发情周期和被随机分配到4个不同组( ):对照组,虚假的集团,HucMSC集团和HucMSC + ucPRP组。POF模型建立了前一篇文章中描述的那样。总之,脉冲政府使用,50毫克/公斤的第一剂量CTX,紧随其后的是8毫克/公斤CTX治疗连续15天(24]。无血清培养基的HucMSCs最先孵化24小时和resuspended PBS移植前的两倍。化疗后,每组1只老鼠被牺牲,收集血清和卵巢,剩下的老鼠接受了前面描述的原位卵巢移植治疗计划。对照组未接受移植。的两个卵巢HucMSC组35μL生理血清治疗 细胞,HucMSC + ucPRP组治疗35μL ucPRP和2×10⁶HucMSCs,假针灸组相同的操作,但是35只接受治疗μL生理血清。移植后2在每组大鼠D15和D30被牺牲了。每个大鼠的血清收集和储存在-80°C为后续实验。卵巢被分为两个部分。左派组织被用来追踪HucMSCs。右边的面板是他用于石蜡包埋,包含IHC, TUNEL评估(25]。

2.8。HucMSC跟踪

追踪干细胞在体内的分布,PKH26红色荧光细胞链接器迷你包(美国Sigma-Aldrich)是用于生产PKH26-labeled干细胞,用于移植。卵巢、心、肝、脾、肺、肾组织D0, D15,和D30收集、固定OCT包埋剂,切成新的片(6μ米),在丙酮固定15分钟,与DAPI染色(Solarbio, 28718年,中国)15分钟,在PBS和洗两次。整个过程是在4°C黑暗环境中执行,并立即记录每个薄片荧光显微镜(日本尼康公司)在每个片以4种不同的200 x的视野。积极率定性决定利用ImageJ(美国国立卫生研究院)26]。

2.9。发情周期和重量检测

老鼠的重量决定每天8点,和一个阴道涂片进行检测老鼠的发情周期。简单地说,一个包含生理盐水棉球在大鼠阴道轻轻旋转,然后收集到的内容在玻片上涂抹。下滑是干燥后,瑞士染料(中国Solarbio G1020)被用来染色的幻灯片1分钟。PBS是用来去除多余染料的幻灯片,幻灯片是在显微镜下观察(日本奥林巴斯BX53F)。老鼠的发情周期(proestrous,发情,metestrous diestrous)决心根据之前报道的方法(27]。

2.10。激素测定

每个移植组的血清D-15, D0, D15, D30收集,血清激素决定的内容。简单地说,收集的血液是离心机 10分钟分离血清,立即被储存在-80°C。激素E2、FSH、抗苗勒氏管激素(CEA461Ge, CEA830Ra, CEA228Ra Cloud-Clone应对,中国)被ELISA检测。

2.11。卵巢形态学评估和卵泡计数

收集到的卵巢组织是固定的4% polymethanol一夜之间,和标本制成4μ部分由石蜡包埋。每一个组织的四个序列切片是收集并用于他染色。他部分使用了民主党的染色。查看图像采集系统。2.6.17软件(日本滨松光子学)是用于观察。原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦的毛囊数使用先前描述的方法(28]。

2.12。卵巢免疫组织化学染色

CD34免疫组织化学染色(ab81289 Abcam,英国),FSHR (orb213952, Biorbyt,英国),抗苗勒氏管激素(orb523061, Biorbyt,英国),PCNA (ab29, Abcam,英国),caspase-3(英国Abcam ab184787)在D15卵巢组织执行。固定后,卵巢组织嵌入4纳米厚的部分,其次是脱蜡、补液、抗原检索,阻塞,增加主CD34抗体,FSHR,抗苗勒氏管激素,PCNA, caspase-3,与二次抗体和苏木精复染色。最后,显微镜下的图像采集系统(滨松光子学、日本)。CD34染色位于黄体和卵巢间质。增殖细胞核抗原,抗苗勒氏管激素,FSHR和caspase-3主要位于卵巢颗粒细胞。4个字段的视图被随机选择观察400 x。CD34使用MVD得分(29日]。增殖细胞核抗原,抗苗勒氏管激素,FSHR和caspase-3得到使用得分。根据分方程, ,在哪里染色强度(0 = - 1 =弱,2 =媒介,和3 =强烈)。π是在每个强度(0 - 100%)染色细胞的百分比。的分数用颗粒细胞。由两个病理学家独立部分的得分。如果有不同的分数,重新评估幻灯片和两个观察员达成共识30.]。

2.13。TUNEL染色

检测颗粒细胞的凋亡,细胞凋亡工具包(11684795910,原位细胞死亡检测装备,罗氏,美国)被用来评估D15颗粒细胞凋亡。4毫米部分deparaffinized水化,TUNEL反应形成的解决方案在37°C为60分钟,和用DAPI标记(28718年,Solarbio中国)10分钟。在显微镜下的200 x荧光显微镜(日本尼康公司),4个字段被随机选中确定颗粒细胞的凋亡率(31日]。

2.14。统计分析

所有数据使用SPSS 22.0分析,定量的数据表示为 。数据比较和分析了单向方差分析和学生的 - - - - - -测试在不同的群体中,并使用棱镜生成统计图8所示。学生的 - - - - - -测试是由⁺ ,^{+ +} ,^{+ + +} ,和^∆ 。由单向方差分析结果 , , ,和^# 。当小于0.05,它被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。识别和多功能干细胞

我们通过组织块孤立HucMSCs依从性方法。文化的第三天,HucMSCs显示薄梭状回和纤维增长在显微镜下(图1 (b))。的表面标记HucMSCs被流式细胞仪检测。CD44的表达水平,CD73 CD90、CD105是积极的,和CD34的表达水平、CD45、CD11b, CD14、CD19 CD79α,HLA-DR负(图1(一))。未分化HucMSCs没有显示特定的染色(数字1 (c)- - - - - -1 (e))。Osteogenesis-induced HucMSCs观察到红色钙结节茜素红染色(图1 (f))。红脂肪水滴沾油红O HucMSCs是由脂肪形成(图中观察到1 (g))。阿尔新蓝酸性粘多糖中观察到HucMSCs被诱导软骨形成(图1 (h))。上述结果表明,我们成功地孤立HucMSCs,多功能。

3.2。ucPRP促进HucMSCs的扩散,减少细胞凋亡

验证HucMSCs ucPRP的增殖效果,一个EdU化验使用。如数据所示2(一个)和2 (b)的积极信号ucPRP组明显高于的边后卫组( vs。 , )。结果表明,ucPRP加速HucMSCs的DNA复制过程的扩散和推广HucMSCs在24 h。随后,膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包用于进一步检查ucPRP在HucMSC细胞凋亡的保护作用通过流式细胞术。如数据所示2 (c)- - - - - -2 (f)24小时,而生理血清治疗,早期的生理血清组细胞凋亡率ucPRP组的1.57倍( vs。 , ),晚期凋亡率ucPRP组的1.45倍( vs。 , ),和总ucPRP组的凋亡率为1.5倍( vs。 , )。结果表明,添加ucPRP HucMSCs减少细胞凋亡水平。

3.3。UcPRP上调HucMSCs具备干细胞的基因

具备干细胞基因变化HucMSCs ucPRP之外的被rt - pcr检测。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (c)孵化后,我们的结果表明,24小时ucPRP和生理血清,ucPRP集团具备干细胞基因Oct-4 ( vs。 , ),Sox2 ( vs。 , ),和Nanog ( vs。 , )在HucMSCs与生理血清组相比显著增加。这表明添加ucPRP不仅不损害HucMSCs的具备干细胞,但也有助于HucMSCs具备干细胞移植基因。

3.4。HucMSCs和ucPRP加速复苏的发情周期

我们确定了实验大鼠的发情周期( )的四个阶段proestrous发情,metestrous, diestrous阴道涂片方法(图4(一))和评估发情周期变化(图31天4 (b))。正常大鼠的发情周期3 - 5天,和POF老鼠无序周期意味着留在metestrous和diestrous leukocitary阶段。一旦老鼠达到常规proestrous和发情,这意味着POF老鼠恢复正常循环(27]。在我们的研究中,老鼠在对照组平均完成 周期。建模后,所有的周期CTX-treated老鼠被毁,也没有改善大鼠血清处理生理周期。然而,50%的老鼠HucMSC治疗后恢复正常发情周期平均的 周期,HucMSCs结合ucPRP治疗组,平均75%的老鼠 周期。老鼠的发情周期的复苏处理HucMSCs + ucPRP发生早于大鼠治疗的HucMSCs孤单。

3.5。分布和HucMSCs体内的命运

我们使用PKH26 HucMSCs标签和跟踪的分布和命运HucMSCs D0(图5(一个)),D15(图5 (b)),和D30(图5 (c)移植后)。在心脏,肝脏,脾脏,肺,肾,没有观察到(图HucMSCs迁移S1)。在卵巢HucMSCs幸存下来至少30天。周围的HucMSCs主要是位于卵巢间质和卵泡膜。如数据所示5 (d)和5 (e)在D0,没有荧光观察。的荧光区域D15 HucMSC + ucPRP组移植后明显高于单独HucMSCs集团( vs。 , )。区别在D30降低了1.7倍( vs。 , )。我们的研究结果表明,添加ucPRP允许更多的HucMSCs留存在体内。

3.6。重量和激素的变化

我们证实,16天后CTX治疗,POF老鼠的卵巢大小减少(数字6(一)和6 (b)),我们监测的变化POF移植后大鼠的体重和激素HucMSCs和ucPRP(数字6 (c)- - - - - -6 (g))。在30天随访期间,所有老鼠的体重增加,但CTX治疗导致较慢的老鼠体重增加。与虚假的组相比,HucMSCs HucMSC + ucPRP移植组和促进大鼠体重增加,但没有统计学意义( )。性荷尔蒙的浓度监测45天。在所有经历了CTX治疗,治疗组E2,抗苗勒氏管激素,FSH是负面影响。D15 ( vs。 , )和D30 ( vs。 , ),E2 HucMSC + ucPRP组显著增加随着时间的增加移植,和HucMSC组显示相同的趋势( vs。 ( )和 vs。 ( ),分别),但与虚假的组相比没有区别。D15和D30的抗苗勒氏管激素和FSH HucMSC组和HucMSC + ucPRP组显示相同的复苏趋势。特别是D15虚假的操作组,与HucMSC组相比有显著差异( vs。 ( )和 vs。 ( ),分别)和HucMSC + ucPRP集团( vs。 ( )和 vs。 ( ),分别)。单独的移植HucMSCs恢复卵巢的内分泌功能,和联合应用HucMSCs ucPRP增强这种效果。

3.7。联合移植HucMSCs和ucPRP改善毛囊的发展

我们收集了卵巢组织D0, D15 D30观察卵泡开发(数据6 (h)- - - - - -6(左)),他组织部分显示,各级卵泡的数量CTX治疗组接受16天的减少。在移植后D15,原始卵泡( vs。 , )和初级卵泡( vs。 , )HucMSC组开始发展相比,那些虚假的组。更多的原始卵泡和初级毛囊发达HucMSC + ucPRP集团( vs。 ( )和 vs。 ( ),分别)相比HucMSC组。特别是,原始卵泡数量HucMSC + uPRP组HucMSC组的1.48倍。移植HucMSCs和HucMSCs + ucPRP也增加了二次卵泡和窦的毛囊的数量,但从虚假的组没有区别。HucMSC组的形态学和HucMSC + ucPRP小组D30 D15显示相同的趋势,而毛囊骗局组仍不发达。我们的结果表明,HucMSC移植可以改善卵巢中卵泡的生长和联合移植HucMSCs ucPRP更好的福利。

3.8。联合移植HucMSCs ucPRP促进血管生成和表达的卵泡发展的标记

验证卵巢血管生成标记的表达CD34标记抗苗勒氏管激素卵泡发展和FSHR(图7(一)),移植后D15部分染色。CD34表达主要是卵巢间质。与假组相比,血管生成HucMSC ( vs。 , )和HucMSC + ucPRP ( vs。 , )组织增加。相比HucMSC HucMSC集团+ ucPRP集团和MVD值增加了1.1倍,但仍有一定的差异与对照组相比(图7 (b))。抗苗勒氏管激素主要是表现在初级卵泡和窦的毛囊;表达HucMSC + ucPRP组是仅次于对照组和高于假组( vs。 , ),和表达HucMSC组也高于假集团( vs。 , )(图7 (c))。FSHR表达主要是在排卵期前的窦的毛囊,毛囊。控制、HucMSC HucMSC + ucPRP组均高于虚假的组,但是只有控制( vs。 , )组和HucMSC + ucPRP集团( vs。 , )与虚假的组相比均有显著不同(图7 (d))。抗苗勒氏管激素,CD34, FSHR表达强度HucMSC + ucPRP组略高于HucMSCs组和对照组接近。我们的结果表明,该联合移植HucMSCs和ucPRP卵巢血管生成和卵泡发展优势。

3.9。联合移植HucMSCs ucPRP促进卵巢颗粒细胞的增殖和抑制细胞凋亡

观察的影响HucMSCs + ucPRP卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡D15,我们评估的表达的蛋白质PCNA增殖凋亡蛋白caspase-3。颗粒细胞的凋亡是被TUNEL染色(图8(一个))。HucMSC ( vs。 , )和HucMSC + ucPRP ( vs。 , )移植组与虚假的集团相比,卵巢颗粒细胞凋亡蛋白的表达caspase-3表达下调(图8 (b)),caspase-3 HucMSC组的1.21倍HucMSC + ucPRP集团( vs。 , )。与虚假的集团相比,在HucMSCs ( vs。 , )和HucMSC + ucPRP ( vs。 , )组,扩散增殖细胞核抗原表达蛋白调节,HucMSC + ucPRP组展示一个更好的扩散趋势比HucMSC集团( vs。 , )(图8 (c))。TUNEL染色显示CTX治疗后,开始大量的颗粒细胞凋亡,但当地HucMSCs移植( vs。 , )和HucMSC + ucPRP ( vs。 , )保护的颗粒细胞凋亡,HucMSC + ucPRP组表现出更强的保护作用比单独HucMSCs的移植( vs。 , )(图8 (d))。我们的结果表明,HucMSCs和ucPRP协同增强颗粒细胞的增殖和凋亡的能力。

4所示。讨论

大约有1%的40岁女性患有POF。POF可能导致骨质疏松症,心血管疾病,甚至不孕,严重影响女性的身心健康32,33]。目前,荷尔蒙替代疗法主要用于治疗雌激素缺乏,但不能触发排卵。与此同时,长期激素替代疗法治疗会增加乳腺癌和子宫内膜癌的风险(34]。潜在的msc治疗POF近年来报道的26,35]。然而,自体移植的骨髓间充质干细胞(bmsc)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)问题,如额外的外科手术和贫穷衰老组织的函数(36,37]。人类胚胎干细胞(ESCs)仍有道德约束38]。HucMSCs缺乏这些限制,被认为是最好的治疗POF的种子细胞。然而,HucMSCs单独治疗POF的有效性仍然是有争议的。ucPRP来源于幼稚脐带组织,有一个广泛的来源和比外周血更丰富的生长因子,和禁忌症患者是一种安全有效的替代自体PRP (20.,39]。最近的一项临床研究表明,ucPRP有更好的效果比外周血PRP治疗子宫内膜损伤不孕(40]。然而,联合移植的有利影响HucMSCs和ucPRP POF老鼠没有讨论。

第一次,我们观察到激活的生物活性变化ucPRP HucMSCs体外。我们进一步证实ucPRP能促进增殖和凋亡的能力HucMSCs [23]。凋亡的能力可能是通过改善能量代谢。PRP可能上调线粒体ATP酶病原5-ATP合成酶在msc。生产ATP帮助细胞抵抗代谢压力在极端环境中(41]。Oct-4, Nanog SOX2很重要的基因干细胞有多种能力的维护(42]。在我们的研究中,添加ucPRP没有伤害HucMSCs多功能基因的表达。总的来说,ucPRP HucMSCs有益移植添加剂。

移植成活率较低的HucMSCs卵巢可能导致对POF的影响不大。改善卵巢移植环境中起决定性作用的命运移植HucMSCs [43]。我们观察到的命运和分布与PKH26 HucMSCs标记。HucMSCs留在卵巢至少30天。但是,没有迁移HucMSCs被发现在其他器官:心脏、肝、脾、肺、肾,可能是由于卵巢干细胞原位移植。HucMSCs + ucPRP卵巢的数量显著增加比HucMSCs单独移植。这些发现强调了假设ucPRP可能保护HucMSCs移植体内细胞凋亡在充满敌意的环境中,导致更多HucMSCs的生存。在我们的研究中,HucMSCs主要是位于卵巢间质和卵泡膜,并有可能是卵巢颗粒细胞没有直接受益(26]。然而,它也被报道,bmsc可以回家卵巢颗粒细胞(35]。这可能是由于不同的归巢能力和分化能力不同来源的间充质干细胞(44]。的具体机制仍需进一步研究。

我们建立了POF CTX治疗大鼠模型。这种治疗后,体重下降,卵巢萎缩,负面改变性激素和无序发情周期出现了。有一个缺乏原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦的毛囊在卵巢病理25]。CTX致命毒性细胞DNA,这样原始卵泡的发展仍在减数分裂阶段我也能导致颗粒细胞凋亡和停止卵泡发展(45]。在我们的研究中,移植后HucMSCs + ucPRP HucMSCs,各级卵泡开始发展,特别是原始卵泡和初级毛囊。在移植后30天,HucMSC的重量+ ucPRP HucMSC组略有增加,仍然显示一个特定的与对照组的差异,这可能是由于系统由CTX,造成的损害和地方移植单独不能改善全身状况。在我们的研究结果,一些POF老鼠HucMSC + ucPRP组和HucMSC集团似乎有固定周期,E2和抗苗勒氏管激素表现出不同程度的恢复,FSH继续下降,和卵巢内分泌功能HucMSC + ucPRP组比HucMSC早些时候恢复组、类似于先前的研究[所观察到的24,46]。简而言之,联合移植HucMSCs和ucPRP有效改善卵巢的内分泌功能,和更多的毛囊已经停止发展中获救。

新血管形成的卵巢卵泡发展提供了必要的保证,如营养、激素、和氧。特别是,原始卵泡和初级卵泡,因为血管网络尚未建立,他们只能依靠卵巢间质血管供应氧气和营养物质(47,48]。HucMSCs + ucPRP CD34的表达增加,协同造血干细胞和血管祖细胞的特定标记(49),卵巢血管的再生,加速和提高卵泡生长的微环境。FSH,作为一种重要的激素,促进颗粒细胞的增殖,是其结合FSHR依赖。停止卵泡发展造成灵敏度降低FSHR POF的发生密切相关(50]。抗苗勒氏管激素卵泡招聘是一个重要的因素,抗苗勒氏管激素通常也表明卵巢的储备51]。抗苗勒氏管激素的丧失会导致overrecruitment毛囊,和抗苗勒氏管激素也能影响的敏感性,原始卵泡FSHR (52]。在我们的研究中,HucMSCs + ucPRP重建卵巢血管网络中实现更好的福利和恢复抗苗勒氏管激素的表达,FSHR卵泡发展的关键因素,而HucMSCs孤单。

卵泡的颗粒细胞的增长决定了命运(53]。PCNA作为细胞cycle-related蛋白在DNA复制和修复中扮演着重要角色54]。CTX诱导减少增殖细胞核抗原在大鼠卵巢颗粒细胞的表达,增加卵巢颗粒细胞的凋亡。有趣的是,合并后的移植HucMSCs ucPRP调节PCNA的表达,导致颗粒细胞增殖,诱导毛囊开始正常发育。Caspase-3是半胱天冬酶家族的一员。Caspase-3可以激活DNase核引起的DNA碎片,成为执行程序的过程中细胞凋亡(55,56]。正常发育的颗粒细胞抑制的表达caspase-3通过维持upregulation凋亡的抑制蛋白(XIAP) [57]。相比PCNA, HucMSCs的移植和HucMSCs + ucPRP表达下调的表达caspase-3并保存异常发展中卵泡的闭锁。这些结果进一步证实,联合移植HucMSCs ucPRP加速卵巢颗粒细胞的增殖,减少了颗粒细胞的凋亡诱导CTX。这些机制可能是由于旁分泌途径,还需要进一步的研究来证实这一假说。在未来,我们将调查的影响HucMSCs结合ucPRP卵巢CD34的内皮细胞和抗苗勒氏管激素,FSHR, PCNA, caspase-3颗粒细胞的旁分泌途径在细胞水平。

5。结论

综上所述,本研究发现,移植的HucMSCs结合ucPRP POF老鼠的卵巢功能,改善ucPRP HucMSC移植的存活率增加,并且植入HucMSCs改善卵巢内分泌功能和促进卵泡发育通过促进卵巢血管生成,减少颗粒细胞凋亡。第一次,我们确认相结合的有利影响HucMSCs ucPRP治疗POF和提供了一个新的临床POF患者细胞移植治疗计划。

数据可用性

作者声明,所有的数据支持本研究的发现可以从相应的作者通过电子邮件以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

加威王、赵Yunxiao贡献同样这项工作。

确认

作者要感谢国华Yan博士,创伤学、骨科、广西医科大学第一附属医院,他在实验的指导和帮助。本研究由国家自然科学基金支持的中国(81803077和81803077号)和广西壮族自治区自然科学基金(没有。2018 gxnsfda050017)。

补充材料

图S1: HucMSCs分布的大鼠心、肝、脾、肺、肾D0, D15,干细胞移植后D30。(补充材料)

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