文摘

骨关节炎(OA)是一种异质性疾病的相声中细胞来自不同组织之间共同影响疾病进展。细胞外囊泡(EVs)是已知信息交流的关键作用的货物转移。软骨下骨(某人)居民细胞及其微环境越来越认可在OA发病机制有重要作用。本研究的目的是探讨电动汽车生产从OA某人间充质基质细胞(msc)对OA软骨细胞及其可能的影响。小EVs OA-MSCs隔绝,特点和cocultured软骨细胞的生存能力和基因表达分析,健康的捐赠者和小型电动汽车相比,msc (H-EVs)。OA-EVs增强生存能力的软骨细胞和chondrogenesis-related基因的表达,虽然效果与H-EVs相比略低。microRNA的分析之后,无人监督的层次聚类分析显示不同微集OA-EVs比他们的父母msc或H-EVs。通路分析OA-EV microrna显示microrna与软骨形成的浓缩,干细胞或其他途径与软骨和OA有关。总之,OA某人msc能够生产电动汽车能够支持软骨细胞生存能力和chondrogenic基因表达和含有小分子核糖核酸与软骨形成支持。这些电动汽车可能因此调解之间的相声某人和OA软骨可能调节软骨细胞生存能力和内生软骨再生。

1。介绍

骨关节炎(OA)是一种异质性疾病,影响滑膜关节,开始从伤害或分子改变和导致结构性变化,如软骨、骨硬化或骨赘形成,疼痛等临床症状(1]。OA是一种最常见的关节疾病,经常导致残疾,随着全球高发病率由于人口老龄化2- - - - - -4]。

早期OA关节软骨的变化包括区域蛋白多糖损失,软骨细胞集群、胶原蛋白的混乱,组织纤维性颤动(5]。而分解/合成代谢失衡在重载microdamages骨头相关联,在软骨,它似乎与持久,轻度炎症(6]。它开始于滑膜组织的特征是细胞因子释放和免疫细胞浸润,通常与疼痛相关办公自动化(7,8]。与OA进展,软骨下骨(某人)获得更多影响OA软骨细胞骨软骨交界处变得更加多孔(5,6,9- - - - - -13]。Bone-targeting治疗OA软骨细胞(产生积极影响6]虽然cocultures OA软骨下骨成骨细胞(10)或破骨细胞(14)与OA软骨细胞产生负面影响软骨细胞的生存能力或合成代谢活动。软骨相声是OA(因此成为一种新型的治疗目标13,15]。

在办公自动化中,不同类型的某人细胞进入通常nonvascular钙化软骨通过裂缝和裂缝或新成立的船只,都导致软骨破坏“从下面”12,16- - - - - -18]。这些某人细胞包括骨的/破软骨细胞,溶解钙化软骨矩阵(18,19),神经元,加重关节疼痛13,20.,21],multipotential基质细胞(msc)可能参与,软骨形成和软骨退化(12,18]。除了细胞自身,OA SB-cartilage沟通可能通过介导的可溶性蛋白(22),例如,VEGF或白细胞介素6,增加在OA的某人受损地区(23),或通过细胞外囊泡(EVs);在OA软骨细胞内稳态的影响仍然了解甚少的(24]。

电动汽车是nonreplicative bilipid-layered粒子从大多数的细胞,释放自然肽,microrna,脂质,在他们的货物和其他分子,可以传送到其他细胞。他们可以大致subcategorised基于生物起源,大小,和标记成液,微泡,凋亡的身体(25- - - - - -27]。电动汽车有至关重要的作用在细胞间通信,允许货物转移通过内吞作用的内化或直接融合,就会引发生理反应(28- - - - - -31日]。最近,对电动汽车的研究在关节疾病及其治疗用途开始上升(24,32- - - - - -35),但这些研究主要集中在EVs来源于骨关节炎的滑液,而不是某人(36,37]。

本研究的目的是研究电动汽车生产从某人msc、细胞之前在OA(显示为疾病发病机理18,38,39]。我们假定某人MSC-EVs可能影响OA软骨细胞的生存能力和合成代谢基因表达和它们包含特定组的microrna不同于他们的父母msc。

2。材料和方法

2.1。病人和细胞

伦理批准软骨和MSC骨关节炎的样本收集得到的nr委员会约克郡& Humber-South约克郡(14 /怎么/ 0087)和nr委员会北East-Newcastle &北泰恩赛德1(14 /不/ 1212)。从这个集合,11软骨样品(6与平均年龄74岁,女性和5男性范围55 - 83)和5软骨下骨样本(3女性和2男性平均年龄73岁,范围64 - 83)是全膝关节置换术收集的。

健康MSC收集了从剩余材料剩余10骨marrow-processing袋用于造血干细胞移植(nr委员会北East-Newcastle &北泰恩赛德2 14 /不/ 1136)。患者7男性和3女性的平均年龄14年(范围4-44)。

2.2。隔离和OA软骨细胞的文化

从股胫关节软骨表面,软骨细胞分离(如前所述)(18]。短暂,软骨是收获和切碎的使用手术刀在一夜之间和胶原酶消化。软骨细胞在high-glucose扩大杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;美国MilliporeSigma)补充谷氨酰胺,10%胎牛血清(的边后卫;ThermoFisher科学、美国),和1%的青霉素和链霉素(P / S;美国MilliporeSigma)。媒体改变了每周两次,亚文化软骨细胞达到80%时进行融合,并通过通道2 (p2)。

2.3。隔离和msc的文化

得到了骨关节炎的msc的软骨下骨内侧股骨髁部的软骨切除后,如前所述[18]。内侧髁部被选为他们通常显示一个更突出的OA表型与横向侧(18,40]。骨骼是加权和机械咬骨钳碎成小碎片,用胶原酶消化,如前所述[18]。MSC文化建立在StemMACs™MSC扩张媒体(Miltenyi研究,德国)然后转移到DMEM补充5%人类血小板溶解产物(PL;PLTMax MilliporeSigma), 100国际单位/毫升青霉素、链霉素100 ug /毫升、2500国际单位/毫升肝素和2毫米谷酰胺(所有从MilliporeSigma) pl / DMEM (5%)。

健康控制msc从剩余细胞培养(冲洗)造血干细胞移植包,如前所述[41]。简而言之,骨髓单核细胞(跨国公司)是由密度梯度离心法分离和pl / DMEM培养在5%。

这两种类型的msc以前特征(18,41(补充数据1和2)根据标准设定的国际社会的细胞治疗(ISCT) [42)和扩展5%之前通过3 pl / DMEM改变媒体pl / DMEM EV-depleted 5%, EV隔离。EV-depleted MSC媒体由18 10% pl / DMEM超速离心法 其次是1:1在DMEM稀释。

2.4。电动汽车与OA和控制msc

EVs孤立骨关节炎(OA-EVs)和控制健康(H-EVs) p3 msc、如前所述[41]。简而言之,当细胞达到50%融合,他们洗两次磷酸缓冲盐(PBS MilliporeSigma)和5%的pl / DMEM-EV-depleted培养基培养,进一步持续48小时之前收获的媒体和MSC-EV隔离。除了收集条件培养基,msc在瓶的数量统计和一个整除的细胞被冻结作为QIAzol颗粒溶解试剂(试剂盒、德国)RNA隔离。获得MSC-EVs,条件培养液离心机 5分钟, 在4°C为20分钟,然后转移到离心器管(美国贝克曼库尔特)和顺序再次离心 45分钟, 在4°C为90分钟,使用45 ti转子(贝克曼库尔特)最适条件xe - 90超离心机(贝克曼库尔特)。MSC-EVs颗粒在PBS洗然后resuspended在大约200 - 300μl无菌PBS和储存在−80°C。

2.5。MSC-EV表征

MSC-EV特性是由电子显微镜(TEM)、流式细胞术和纳米粒子跟踪分析(NTA) [41]。

TEM, 5μl (MSC-EVs 30年代被吸附到碳涂层,仪网格。多余的液体被和样本沾1%醋酸双氧铀(琼脂科学、英国)。醋酸双氧铀过剩的解决方案是移除,然后干MSC-EV-loaded网格使用日立HT7800透射电子显微镜检查。数字图像采集使用Emsis Xarosa相机与半径软件。

电动汽车表面标记CD63、CD9和研究分析流式细胞术涂层后4μm硫酸醛/乳胶珠子(ThermoFisher科学)10μl MSC-EVs悬挂。反应停在孵化了1米甘氨酸(MilliporeSigma),然后MSC-EV-bead复杂与PBS洗两次孵化用鼠标反PE CD63(克隆H5C6) PerCPCy5.5 CD9(克隆M-L13)和APC的研究(克隆js - 81)相应抗体或同形像控制(都来自BD生物科学,美国)。进一步洗后,细胞在particle-free resuspended PBS (ThermoFisher科学)和数据使用BD流式细胞仪收购第二章血细胞计数器(BD生物科学)和分析FlowJo 10.0软件(树明星Inc .)、美国)。

NTA, MSC-EV丸与无菌稀释particle-free PBS和分析使用Nanosight LM10(莫尔文Panalytical有限公司、英国),所述的制造商的协议。三个60年代测量每个样品的粒度和浓度测量。获得使用NTA 2.3数据处理软件(莫尔文Panalytical有限公司)。

2.6。ATP-Based可行性评估与MSC-EVs Coculture后软骨细胞

CellTiter-Glo 2.0 Luminiscent细胞生存能力分析(英国Promega)措施总ATP水平由新陈代谢活跃的细胞。化验,EV-depleted软骨细胞媒体首次由18小时超速离心法DMEM /营养混合物F-12 (DMEM: F12, ThermoFisher科学)包含10%的边后卫(DMEM F12/10%FBS): 100000 x g和最优条件( 软骨细胞/ 24小时的治疗持续时间)建立了播种不同的细胞浓度和确定ATP水平。

决定的影响MSC-EVs (OA和H-EVs)对软骨细胞ATP水平,电动汽车 msc被添加到300年μl (EV-depleted DMEM: F12/10%FBS包含 软骨细胞(MSC软骨细胞比4:143),100μ(包含混合的l 软骨细胞)播种一式三份井相同的96孔Nunclon三角洲盘子。作为一个控制, 软骨细胞没有MSC-EVs镀是一式三份包含100井μl相同的EV-depleted DMEM: F12/10%FBS媒体。第二个剂量的电动汽车 msc添加了3天,和发光测量进行了5天。为此,100年μ2.0 l的平衡CellTiter-Glo试剂添加到井和发光测量10分钟之后,用火花多模标(瑞士Tecan)和Sparkcontrol方法编辑软件(Tecan)。在这些实验中,OA-EVs H-EVs来自3和6 MSC捐赠者,分别。

2.7。三维(3 d)颗粒Coculture MSC-EVs和OA软骨细胞

描述是否MSC-EVs (OA和H-EVs)影响软骨细胞的基因表达与细胞外基质(ECM)的新陈代谢,电动汽车 办公自动化或控制msc被添加 软骨细胞在EV-depleted resuspended DMEM: F12/10%FBS媒体(MSC-EVs软骨细胞比10:1)。之后,软骨细胞被分为3种不同的管子和离心机 10分钟创建3 d小球,每个治疗。此外, 软骨细胞是颗粒状EV-depleted DMEM: F12/10%FBS媒体没有MSC EVs和用作-控制(没有电动汽车)。2和7天后,EV-depleted媒体half-changed和细胞颗粒为RNA被孤立。在这些实验中,OA-EVs和H-EVs来自两个不同的捐赠者,和软骨细胞培养( )没有donor-matched OA-MSCs。

长期OA和健康MSC-EVs对软骨细胞基因表达的影响颗粒文化测试使用一个捐赠者软骨细胞文化和MSC软骨细胞的比例4:1,half-change中每3 - 4天。

2.8。RNA与OA和健康MSC-EVs,父母的msc、和MSC-EV-Treated软骨细胞

从电动车(60隔离的RNAμl PBS的电动汽车悬架),总外来体RNA和蛋白质隔离设备(ThermoFisher科学)使用后,制造商的指示。EVs的RNA浓度是评估使用生物分析仪2100年和6000年RNA pico工具包(美国安捷伦科技)。

RNA从父母的msc (EVs)生产和软骨细胞颗粒得到使用miRNeasy迷你包(试剂盒)后,制造商的指示。RNA是量化使用Nanodrop分光光度计(ThermoFisher科学)。

2.9。从办公自动化和健康MSC-EVs microrna的剖析

microrna测定进行了使用nCounter®人类v3.0 microrna的表达分析工具包(NanoString技术),基于miRBase v21,从获得的总RNA OA-EVs H-EVs以及父母的msc (EVs分别获得的msc)。799代码集包含成熟的小分子核糖核酸和包括6积极控制,8 -控制,6结扎控制,5 mRNA管家控件(ACTB、B2M GAPDH RPL19和RPLP0)和5激增的控制。miRtag结扎,microrna的代码集杂交和post-hybridization制造商的指令后进行。由此产生的microrna的表达谱进行了分析使用nSolver软件V4 (NanoString技术)。样本归一化的几何平均数巨鲸音乐网microrna考虑背景阈值和积极控制规范化(几何平均数)。褶皱变化(FC)组织表达差异计算使用nSolver v2.5 (NanoString技术)比例数据,基于归一化计算数据。进一步分析了使用管道设计的纽卡斯尔大学血液学的科学部门。这个集成的R (R项目)统计包R编程语言;使用双尾值两组之间产生 - - - - - -测试。microrna的目标进行了分析使用mirWalk [44从戴安娜工具],mirPath45],Reactome [46]和miRDIP [47),对人类或使用缺省参数智人。

2.10。实时定量聚合酶链反应

基因表达是评估2 7和21 day-cultured OA和健康MSC-EV-treated球和控制软骨细胞球。总RNA分离和反向转录与高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。执行中存在使用Taqman化验(ThermoFisher科学;表1)和快速掌握先进混合(应用生物系统公司,ThermoFisher科学)QuantStudio 3实时PCR系统(应用生物系统公司)。基因分析是根据文献选择的证据分解代谢和合成代谢活动参与软骨形成和软骨细胞(12,48),如表所示1。

3所示。结果

3.1。电动汽车特性

EVs隔绝OA-MSCs ( )显示出类似的基本特征(图1比之前的显示控制健康msc ()41]。表达不同的小型电动汽车的标志25在OA-EV准备第一次测试使用流式细胞仪(图1(一))。CD63 ( )和的研究( )其次是CD9(是最高的表示标记 )表明小型电动汽车(图的存在1(一))。OA-EVs的形态学观察使用TEM是一个典型的杯状(图1 (b))。粒子的浓度和电动汽车的大小是衡量使用NTA(图1 (c)、表2)。的模式OA-EV大小介于107.9 - -169.8 nm之间(表2)不明显不同H-EVs(81.3 - -132.9),和一致的与先前报道的模态尺寸控制H-EVs [41]。粒子的平均浓度每毫升OA-EV准备 和类似于H-EVs ( )(表2)。细胞数量是算OA和健康MSC-EV媒体收集后,没有差异( )被发现在每个细胞获得的平均粒子数从办公自动化或控制msc: 和 ,分别。无论是健康之间差异的大小是观察当比较意味着EV和OA-MSC-EVs ( ): 纳米和 海里,分别,但OA-EVs似乎不如H-EVs变量(图1 (c))。这些数据表明,OA-MSCs有着相似的生产能力EVs可比模态尺寸和粒子浓度作为控制健康的msc。

3.2。OA的影响和健康MSC-EVs软骨细胞生存能力

ATP-based可行性评估后进行coculture与办公自动化OA软骨细胞——或H-EVs。当比较治疗与处理控制H-EVs软骨细胞,软骨细胞生存能力平均提高6.27%被发现(值= 0.020)(图2(一个))。OA-EV治疗软骨细胞也显示增加生存能力比未经处理的软骨细胞(平均为5.92%,值= 0.042)(图2 (b))。然而,增加比例的差异之间的可行性OA和H-EVs未能达到统计学意义(值= 0.768)(图2 (c))。

3.3。OA的影响和健康MSC-EVs软骨细胞基因表达

在这些实验中,颗粒软骨细胞和电动汽车的文化被用来促进电动汽车由软骨细胞吸收,先前报道(49]。这些实验中使用的媒体并没有包含任何chondrogenic诱导物,因为后者可以通过电动汽车“面具”可能更小的影响。确认球文化环境足以导致软骨细胞chondrogenic基因上调,并调查如何影响表达式分解代谢和合成代谢基因,所选的时间进程实验在未经处理的颗粒状软骨细胞从4捐助者(图执行3(一个))。

正如所料,逐步增加软骨形成标记SOX9,COL2和能,以及COL1从第二天开始,被证实颗粒文化缺乏chondrogenic诱发足以监视EVs chondrogenic基因上调的影响。老年病的成绩单(MMP13,ADAMTS4和ADAMTS5)没有同样继续超出7天(图3(一个))。

平均上调18%SOX9记录相比,治疗观察软骨细胞与H-EVs coculture影响小(平均增加4%)与OA-EVs coculture然而差异没有达到统计学意义(图3 (b))。低级upregulation的趋势SOX9由OA-EVs H-EVs相比,以及成熟的软骨基质蛋白的成绩单COL2和能很明显在长期文化(图3 (c))。更高的COL2/COL1比率表明chondrogenic家族承诺显示相同的趋势,与软骨分解代谢的分子的表达,没有具体的趋势被发现(短期和长期)(图3 (c))。

3.4。microrna测定

虽然不显著,平均1.5倍软骨细胞的软骨形成的差异基因表达(SOX9,COL2和能表达在21天),表明潜在的microRNA货物H-EVs和OA-EVs之间的差异。微表情分析是下一个执行H-EVs和OA-EVs ( 使用NanoString技术(文化) 微rna)。表达590年成熟的小分子核糖核酸检测所有样品在修正了背景(补充数据1)。健康和OA-EVs显示不同的microRNA表达谱,演示了使用无监督层次聚类分析(图4)。有75个microrna H-EVs和OA-EVs之间的显著差异表达,其中48罗斯福校正后保留的意义。总共有47个调节健康EVs和1 OA-EVs(褶皱变化(FC) , 值范围= 0.002 - -0.037)(图4)。

48 DE-expressed microrna预测目标KEGG通路(50使用mirPath []45),与软骨形成的重要影响或干细胞,包括细胞外基质的相互作用(56个基因,36小分子核糖核酸, ),N-glycan生物合成(30基因,29微, ),粘着斑(133个基因,43个小分子核糖核酸 )和信号通路调节干细胞的多能性(94个基因,45小分子核糖核酸, )。预测基因与很高的分数类目标识别(前1%)通过微数据集成门户(mirDIP)过滤重复,导致10755年独特基因的目标。Reactome途径与目标基因包括信息交流(95/133)基因,转录调节多能干细胞(38/45)基因,细胞外基质组织基因(207/329),小分子基因(483/967),运输和vesicle-mediated运输(510/824)的基因。miRWalk还预测目标映射到信号通路途径调节干细胞的多能性。

除了小分子核糖核酸之间的明显差异表达OA-EVs H-EVs,我们也评估了前20名最高表达的小分子核糖核酸在每个人口,以及那些在OA和H-EVs通常高度表达。17个microRNA表达在高水平在两个种群,而mir - 6721 - 5 - p, mir - 579 - 3 - p和mir - 199 a - 5 - p独特OA-MSC-EVs中高度表达,和mir - 145 - 5 - p, mir - 126 - 3 - p和miR-15b-5p独特控制健康MSC-EVs(表中高度表达3)。

5最高度表达的小分子核糖核酸在每个人口占50%以上的microRNA读( , )(图5),mir - 4454 / -7975, mir - 125 b - 5 - p,和miR-21-5p一般高度表达。

当我们与他们的父母而OA-EVs microrna msc(补充数据2),我们发现他们分别聚集(图6)。有130个microrna OA-EVs之间的显著差异表达和父母OA-MSCs,其中124罗斯福校正(图后保留的意义6)。120在OA-EVs调节健康EVs和4(褶皱变化(FC) , 值范围≤0.001(图-0.049)4)。

KEGG通路分析(50),100年较高的microrna的FC 124 DE microrna表达进行了分析使用mirPath [45]。相同的软骨形成的重要影响或干细胞被发现如上所述,除了通路调节干细胞的多能性:细胞外基质受体相互作用(71个基因,77小分子核糖核酸, ),N-glycan生物合成(44基因,58微, )和粘着斑(177个基因,82小分子核糖核酸, )。其他途径观察癌症中蛋白聚糖(180个基因,80小分子核糖核酸, ),脂肪酸代谢(42基因,66 mircroRNAs, )或细胞周期(111个基因,77小分子核糖核酸, )。预测基因目标非常高的分数类(前1%)通过微数据集成门户(mirDIP),导致100714个独特基因的目标。Reactome途径与目标基因包括MECP2调节神经元受体和通道(32/32),转录因子forkhead盒O (FOXO)介导的转录基因(85/110),TP53调控转录的基因G1细胞周期阻滞(20/20),转录调控RUNX家族转录因子3 (RUNX3)(87/118)基因,细胞外基质的组织(249/329)基因,细胞程序性死亡(170/238)基因,和vesicle-mediated运输(552/824)的基因。miRWalk预测目标映射到信号通路相关的软骨和骨关节炎“glycolysis_gluconeogenesis”,“脂肪酸代谢”、“粘多糖生物合成”、“autopaghy”、“FOXO信号通路”,“钙信号通路”,“破骨细胞分化”,和其他途径,如“内吞作用”或“细胞周期”。

评估前20位最高度表达的小分子核糖核酸,14个microrna表达高水平的父母OA-MSCs和电动汽车,而6 microrna独特OA-MSC-EVs和其他6中高度表达独特的父母msc(表中高度表达4)。

4所示。讨论

先前的研究在OA EVs已经几乎完全集中在滑液(SF)电动汽车,而调解之间的相声受损软骨及滑膜发炎(51,52)和显示他们的相当大的影响软骨细胞分解代谢、衰老和死亡(53- - - - - -57]。相比之下,软骨下骨之间的串音(某人)细胞和软骨细胞在OA是相对较少的探索,尽管某人病理学与OA进展的各个阶段(13,58,59]。此外,在先前的研究SF-resident电动汽车,其组织的起源,以及细胞的起源,仍然未知。相比之下,我们的学习是唯一专注于相声在OA软骨和某人之间和调查电动车生产从特定细胞类型的某人,某人msc,直接涉及某人OA病理学和软骨破坏“从下面”60- - - - - -62年]。虽然某人msc从健康截肢者将是一个更好的控制比从骨髓msc用于这项工作,这些样本难以访问而msc从糖尿病患者截肢的膝盖可以携带潜在的负面影响,如前面描述的(63年- - - - - -65年]。

在这项工作中,当比较电动汽车规模和产量(粒子/单元)从办公自动化和控制释放健康的msc,没有发现差异,类似于结果前所述健康OA-EVs从科幻小说55,57]。以前的工作SF-EVs提出了电动汽车大小略低(53- - - - - -55),可以用不同的方法用于解释EV隔离在这些研究中:使用超速离心法结合降水(54,55)或使用immunoaffinity (53]。EVs获得超速离心法独自一人,在我们的研究中,已知不纯化由于电动汽车之间的重叠在大小和微泡(25对于EVs[],然而超速离心法有害66年]。

本研究的主要目的之一是识别特定的组OA-EVs来自SB-MSCs microrna。根据细胞的起源、电动汽车(包括液)可以包含许多细胞成分包括DNA, RNA,脂质,代谢物,胞质和细胞表面蛋白(67年]。我们已经确定了几个microrna,在我们的实验条件被打包成他们的电动汽车,从这些细胞可能OA-EVs的特征。许多以前的研究而MSC-EVs microrna的表达及其父母的msc (68年- - - - - -72年),但这些研究都是关注健康的msc。我们的研究已经确定了14个microrna的高度表达OA-MSC-EVs和他们父母的某人msc。其中包括mir - 125 b,是为了调节基质降解酶的表达在人类软骨细胞(73年- - - - - -75年)以及调节MSC骨(76年],mir - 199 a参与镇压软骨形成的77年),调节软骨细胞老化和软骨的新陈代谢78年),和OA科幻小说中高度表达的电动汽车57]。我们先前的研究包括[18,61年,79年)描述基因表达谱的OA某人msc倾向于骨形成和软骨细胞外基质的监管。当前研究补充了这些发现表明高度microrna的表达在这些msc,包括那些打包在他们的电动汽车,可以调节在OA软骨内稳态。尽管进一步功能分析需要确认这些microrna EVs中包含可能产生这chondrogenic效应。

此外,目前的研究已经确定了四个microrna在OA-MSC-EVs higher-expressed相比,父母的msc和可能参与调节OA软骨细胞的活力和代谢状态。特别感兴趣的mir - 142 - 3 - p之前是有选择地打包成电动汽车(80年)和mir - 223 - 3 - p显示抑制细胞凋亡和炎症OA软骨细胞(81年,82年),以及早些时候mir - 630,记录规范chondrogenic血统的承诺(83年]。在我们以前的工作我们使用qPCR和验证的浓缩mir - 142 - 3 - p和mir - 223 - 3 - p H-EVs来自msc (41]。mir - 630和其他的角色microrna尚未探讨OA,等待进一步验证。

路径分析表明,OA-EVs和/或OA-MSCs microrna表达与软骨形成,干细胞或其他途径与软骨和办公自动化。有趣的是,“脂肪酸代谢”指出脂肪酸在OA的已知作用84年]。FOXO转录因子也被描述为chondroprotectors和调节自噬和炎症85年]。,这些数据表明,尽管他们改变了基因表达与倾向在OA骨生成,某人msc产生microrna并释放包含microrna的电动汽车参与积极调节软骨细胞生存和分化。

MSC-EVs从各种人体组织包括骨髓(BM)和脂肪组织也开始被用作治疗OA (52,86年]。在这种背景下,有意思的是比较OA-EVs的microrna的货物与BM H-EVs获得从健康人吸入等。在顶部高度microrna表达,17在两种类型的电动汽车(表共享3),13也OA-MSCs丰富(表4)。共同丰富microrna包括miR-16-5p以前作为内生参考基因正常化尿exosomal microrna的表达(87年),还有一些让家人先前描述的十大最丰富的microrna在人类的样本88年,89年]。常见的microrna OA-EVs和H-EVs之间并不存在于OA-MSCs包括前所述mir - 142 - 3 - p和mir - 630 (86年被描述为“cartilage-protective]。“还miR-29a-3p被形容为保护软骨(86年]。健康EVs higher-expressed mir - 145 - 5 - p(独特的高度表达H-EVs OA-EVs相比)描述为具有双重角色在OA (90年),而OA-EVs higher-expressed hsa - mir - 199 - 5 - p参与软骨形成监管和骨形成91年),以及办公自动化中高度表达的科幻EVs [57)和等离子体的早期OA患者(92年]。我们的在体外数据显示,H-EVs和OA-EVs轻微但显著提高OA软骨细胞的可行性,没有差异,这可能是由于多个microrna的合作活动。

最近在体外研究在OA MSC-EVs以前使用过炎性刺激软骨细胞与H-EVs coculturing [93年- - - - - -96年),他们获得减少软骨细胞炎症标志物的表达。这可能刺激了EV-effect软骨细胞比观察到在我们的研究中。在我们的研究中,我们旨在反映软骨细胞的体内条件根据我们先前的调查结果,OA软骨细胞种植在相同条件下已经存在炎症的迹象,明显的高层表达基质降解酶和促炎细胞因子(18]。

即使我们MSC-EV数据(OA和H-EVs)对软骨细胞基因表达的影响是有限的,他们指向一个更糟糕的是感应比H-EVs OA-EVs chondrogenic基因表达的。缺乏统计学意义可以解释为donor-to-donor变异在软骨细胞和电动车准备使用。减少捐赠效果和产生较大的电动车批次用于多个实验,未来的研究可以利用电动汽车(54)或软骨细胞(49汇集来自几个捐助者)。

小于预期EVs对软骨细胞基因表达的影响可能也解释了我们使用3 d测定条件。Mortati和他的同事们(49]添加MSC-EVs四周cultured-chondrocyte丸和显示,电动汽车可以扩散到矩阵。不同于他们的研究,我们混合电动汽车与软骨细胞在三维颗粒形成软骨形成的研究它们在不同时间点的影响。同样,没有chondrogenic TGF等诱发β1 (49)被添加到媒体在我们的研究中,因为这些强大的抗病诱导剂可以“面具”或与潜在的冲突从MSC-EVs较小的影响。在支持我们的试验设计中,先前的研究已经记录了TGF的存在β1在MSC-EVs [97年),这就可以解释长期、增强chondrogenic基因表达的H-EVs在我们的实验。虽然一些研究报告MSC-EV增强软骨细胞胶原蛋白II表达式2 d格式(94年),3 d球(48),细胞封装在cartilage-mimicking水凝胶(49)可能会提供电动汽车交通条件更具代表性在活的有机体内。特定于OA骨软骨病理学,这样的结构应该考虑到细胞间某人msc及软骨细胞之间的距离,可以建立从组织学研究6,18),以及一个已知的OA(中软骨细胞的异质性的细胞亚群98年,99年),这是很难re-capitulate在体外系统。

总之,OA-EVs能够提高OA软骨细胞的生存能力;同时,chondrogenic基因的表达增强在从OA-MSCs EVs的软骨细胞。然而,效果都明显低于那些H-EVs显示。这种差异可以部分解释为微分microrna的表达中发现货物H-EVs OA-EVs。

5。结论

本研究报告生产、表征和microrna的电动汽车在OA某人msc。第一次,这表明某人msc在OA有能力生产电动汽车,软骨细胞生存能力和chondrogenic基因表达的支持,尽管未来的研究需要使用功能化验证实它对软骨形成。这个支持某人的观点调制msc代表一个有效的策略在OA内生软骨再生。这可能是通过增强营养的活动和实现电动车生产除了引发chondrogenic分化,因此代表了一个新的潜在软骨再生的工具。

数据可用性

microrna的分析数据作为补充文件相连。

信息披露

在这篇文章中表达的观点不一定是作者和BRC, NIHR或卫生部和社会关怀。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

去年作家Xiao-nong小王和埃琳娜·琼斯是相等的。

确认

我们承认特蕾西戴维从纽卡斯尔大学新兴市场研究服务援助的生成图像使用日立TEM (BBSRC格兰特参考BB / R013942/1);阿纳斯塔西娅Resteu从人类树突细胞实验室(细胞医学研究所,纽卡斯尔)援助Nanostring协议;亚当·戴维森和利兹Straszynski研究支持服务在利兹风湿性和肌肉骨骼医学研究所(LIRMM);外科医生、病人和工作人员教堂Allerton骨科中心;系统和托马斯•Baboolal德拉戈和Payal Ganguly LIRMM实验室支持。企业社会责任是一个受益人Xunta德加利西亚的奖学金。RC和XW愿意承认与关节炎的支持通过组织工程和再生疗法中心与关节炎(21156年奖)。潘迪特教授是国家卫生研究所(NIHR)的高级研究员。

补充材料

补充1。补充图1:描述msc的软骨下骨(某人)OA患者(OA-MSCs)。(一)Trilineage分化OA-MSCs感应和油红O染色后(21天),碱性磷酸酶(14天)和甲苯胺蓝(21天),脂肪形成,骨和软骨形成。(B)表型的OA-MSCs显示%表达CD73, CD90、CD105, hematopoietic-lineage标记(CD45、CD34、CD19 CD14)和HLA-DR通过流式细胞仪测定。原始放大x200型adipo -和骨的起源和x40软骨形成。

补充2。补充图2:描述的msc健康对照组(H-MSCs)。(A) Trilineage分化后H-MSCs感应和油红O染色(21天),碱性磷酸酶/冯Kossa(14天)和阿尔新蓝(21天)脂肪形成,骨和软骨形成。(B)表型的H-MSCs显示%表达CD73, CD90、CD105, hematopoietic-lineage标记(CD45、CD34、CD19 CD14)和HLA-DR通过流式细胞仪测定。规模200酒吧μm adipo和骨的《创世纪》和500年μm软骨形成。

补充3。补充数据1:分析的microrna OA-EVs与H-EVs相比,显示了微分表达式,有或没有罗斯福修正,褶皱(FC)和变化价值。

补充4。补充数据2:分析microrna与他们的父母相比,OA-EVs msc、显示的微分表达式,有或没有罗斯福修正,褶皱(FC)和变化价值。