视网膜家族治疗特定人类轨道和腹部脂肪间充质干细胞的影响

文摘

视网膜退行性疾病之一,在老年群体中完全失明的主要原因。在这项研究中,我们比较了人类间充质干细胞治疗视网膜变性潜力来自腹部皮下脂肪(ABASCs)或从轨道(OASCs)由于其可访问性和相互胚胎起源与视网膜组织,分别。OASCs发现保护RPE细胞免受细胞死亡和被证明增加早期RPE前体标记,而ABASCs显示,视网膜加薪前体标记表达式。OASCs的视网膜下移植小鼠模型的视网膜变性导致恢复RPE层虽然移植ABASCs导致显著的感光层的恢复。综上所述,我们展示了一个lineage-specific疗效OASCs或ABASCs视网膜再生。

1。介绍

失明和视力障碍影响全世界超过20亿人,由于人口年龄将不可避免地继续增长。氧化应激、炎症、变性的视网膜细胞尤其是涉及几眼疾病的发展,特别是在年龄相关性黄斑变性(AMD)1,2]。

视网膜色素上皮(RPE)视网膜功能是至关重要的,因为它参与营养,防止照片/光氧化,所需的蛋白质分泌视网膜内稳态(3),免疫特权的眼睛4],磁盘和吞噬作用的感光膜[5]。RPE细胞和感光细胞都是特别敏感的氧化损伤,导致细胞凋亡(2]。变性的RPE是AMD的主要病理因素之一6]。RPE并不直接参与视觉过程;虽然,它允许感光细胞的生存7)主要涉及的视觉phototransduction机制被乔治·瓦尔德(1967年诺贝尔奖)。其中最广泛研究RPE变性的治疗选择是RPE移植可能防止感光细胞死亡。最近,干细胞疗法已被建议作为一个可能的选项在AMD细胞替代疗法。

间充质干细胞(msc)尤其有吸引力的人口细胞疗法的目的,除了可以作为自体的细胞来源,甚至同种异体的细胞来源(8),他们也有多种能力的,他们的旁分泌活动促进细胞存活和抗氧化性能9,10]。msc能分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,和一个完全不同的谱系的细胞,包括neuron-like细胞(10,11]。msc的旁分泌激活特性已知的微环境调节病变组织细胞因子的分泌,保护受伤的细胞,促进生存,激活内源性修复机制(10,12包括抗氧化剂作用[13]。msc可以从不同组织分离骨髓和脂肪组织。一个特殊的优势是给脂肪msc(对asc)收割后脂肪组织可以进行微创手术为我们最近显示(14从许多网站),可能是孤立的15,16]。我们最近演示了从皮下脂肪msc收获的有益作用,氧化应激的保护RPE细胞死亡在体外,以及他们的治疗效果与RPE的救助和感光层的体内模型视网膜变性治疗一周后(10]。大多数脂肪组织,包括皮下,来自中胚层。有趣的是,轨道脂肪来源于神经嵴来源(17),像大多数眼部和轨道组织起源(18),特别是与RPE[共享一个共同胚胎起源19]。msc已知能够响应他们居住的利基(20.],显示例如ASC源自心包脂肪更有效治疗缺血性心肌细胞对ASC比收获从腹部或皮下脂肪组织(20.]。因此,轨道脂肪msc是一个独特的人口以极大的兴趣在考虑视网膜修复的潜力。因此,在这项研究中,我们检验人类轨道脂肪间充质干细胞在视网膜再生治疗的优势,相比人类的腹部从皮下脂肪间充质干细胞收获(ABASCs)。

为此,我们研究OASCs的表型特征,评估他们的保护作用对RPE细胞生存当暴露于氧化应激和细胞因子分泌概要ABASCs相比。接下来,我们研究的能力对RPE ABASCs相比OASCs区分。最后,我们调查的长期影响视网膜下移植ABASCs和OASCs视网膜变性的小鼠模型。

2。结果

2.1。描述和OASCs Multipotency

OASCs积极表达经典MSC标记(CD29: ;CD73: ;CD105: )和消极的内皮和造血标记(CD31: ;CD45: ),,以及不同程度的CD34表达OASCs ABASCs相反(平均8.3%到0.7%的表达式在ABASCs)(数据1(一)- - - - - -1 (c))。OASCs显示multipotency能力区分脂肪细胞的能力,就是明证高油红O染色和在一定程度上为骨细胞由茜素红染色(数据如图所示1 (d)和1 (e))。

2.2。OASCs-CM抑制RPE细胞死亡在氧化应激

我们评估了OASC-conditioned介质(CM)的保护作用对RPE细胞之前暴露于H₂O₂所述ABASCs-CM [10]。RPE细胞暴露于CM之前H₂O₂治疗表现出显著减少细胞死亡( 细胞死亡)而non-CM ( 通过流式细胞仪分析细胞死亡),明显对propidium碘染色(细胞死亡减少40.0%, )(数据2(一个)和2 (b))。这个结果强调了OASC-conditioned介质对oxidation-induced RPE细胞死亡。

2.3。细胞因子分泌的OASCs ABASCs

间充质干细胞对他们的影响微环境通过旁分泌释放(9,10]。为了研究细胞因子分泌的OASCs ABASCs的比较,我们使用了RayBio®人类细胞因子抗体阵列G10。在所有样品中最丰富的蛋白质分泌OASCs和ABASCs血管生成素,HGF, osteoprotegerin,先前描述的抑制性影响氧化应激(21和细胞凋亡22,23)(图2 (c))。发布的一些细胞因子显著减少OASCs (Ck -β8 - 1、ICAM-1 eotaxin-3)比ABASCs而神经生长因子分泌BDNF是更成OASCs-CM(图2 (d))。执行中存在进一步验证这些结果在mRNA水平选择的细胞因子。总而言之,OASCs表现出较低的proangiogenic和促炎细胞因子的表达ck -β8 - 1、ICAM-1 eotaxin-3比ABASCs(分别由1.29,,1.45,1.38倍)。此外,神经保护因子的高表达BDNF在OASCs检测到1.57倍比ABASCs(图2 (e))。

2.4。分化OASCs RPE

2.4.1。Prestaining谱系标记的OASCs / ABASCs和pRPE

OASCs / ABASCs和pRPE prelabeled CFSE和CellTrace紫,分别为(数字3(一个)和4(一)),细胞在coculture一周后按流式细胞仪分选机。发现了三个明确的同质人口:CFSE +细胞(OASCs / ABASCs),紫细胞跟踪+ (pRPE细胞),一种罕见的人口double-positive CFSE + /紫色CellTrace + (OASCs / ABASC-pRPE-fused细胞)(数据3 (b)和4 (b))。种族隔离为RPE细胞被收集和分析标记中存在和疣状。

2.4.2。增加OASCs早期RPE的标记和ABASCs分化研究

相对的mRNA表达cocultured OASCs相比非cocultured OASCs控制呈现在图3 (c)。OASCs调节早期神经标记OTX2 ( , );所有三个早期眼differentitaion领域的标志。OASCs也调节RPE65 ( , ),晚期differentitaion RPE的标志(24)PAX6 ( , ),和SIX3 ( , ),和所有三个标记早期眼领域分化和晚期RPE标记RPE65 [24)( , )。多能性的差别我们注意到对这些标记KLF4这可能表明具备干细胞和承诺的减少一定的血统(24)( , )(图3 (c))。这些结果可能意味着增加OASCs早期RPE的标记,与主coculture后RPE细胞。进一步验证qPCR结果在蛋白质水平,我们通过免疫细胞化学研究的表型coculture cell-sorted OASCs(图3 (d))。疣状分析倾向于确认OASCs的分化能力,如图所示的核表达PAX6和OTX2 OASCs(图3 (d)(一)- (D))相比,noncocultured OASC控制(图3 (d)(E, F))。

为了更好地理解OASCs是否有优势在RPE分化,我们比较的分化能力ABASCs OASCs在相同的分化协议。为此,ABASCs cocultured p-RPE细胞方法如前所述。后coculture p-RPE细胞,ABASCs能够表达艺术视野和神经标记PAX6 OTX2表现出潜在的早期视网膜前体细胞的分化。观察到PAX6是表达排序ABASCs核地区(图4 (d)(B))排序OASCs(图中观察到3 (d)(B));然而,在ABASCs OTX2是细胞质的表达(图4 (d)(一))与RPE细胞(核表达不同25)(图3 (d)(C, D)),在分化OASCs(图3 (d)(C)),这可能意味着不同的分化能力的细胞(25]。我们也注意到存在RPE-ABASC融合细胞(图4 (c))。

2.5。视网膜血统ABASCs和OASCs的具体治疗效果

确定潜在ABASCs和OASCs修复视网膜由氧化应激造成的损害,我们这些细胞注射到视网膜下空间在碘酸钠的小鼠模型中,已知描述一个视网膜变性(26]。

2.5.1。ASC移植后细胞的位置

对asc移植视网膜下检测空间第0天通过苏木精和伊红染色()),从而确认的准确性(补充图移植到所需的位置1)。

2.5.2。ABASC移植对感光细胞的影响

辊筒厚度和视紫红质强度之前被证明是减少一个星期后50毫克/公斤碘酸钠(10]虽然INL厚度减少3周后NaIO3(碘酸钠)孵化27在未经处理的NaIO3模型。

辊筒厚度以及视紫红质强度明显高于ABASC-treated老鼠相比,接受pbs组。同时,辊筒厚度高ABASC-treated老鼠,相比OASC-treated组。没有发现显著差异与辊筒厚度或视紫红质强度OASC-treated老鼠(数字5(一),5(d)5(e))。ABASC和OASC移植并不影响内部核层(INL)(图5(f))。

2.5.3。OASC移植对RPE层

RPE65通常是用作标记RPE的功能(10,27]。RPE65一周后被证明是减少50毫克/公斤NaIO3 [10,28]。眼睛治疗OASCs表现出更高水平的RPE65染色相比,接受pbs的眼睛,表现出一个从NaIO3-induced OASCs损伤的保护作用。之间无显著差异观察ABASC-treated老鼠OASCs和接受pbs老鼠(数字5(b)和5(c))。

2.5.4。ABASC Iba1 +细胞移植诱导渗透

我们演示了基底CD45 +细胞浸润NaIO3小鼠移植之前OASCs和ABASCs(图6(一)),如以前所示(29日]。移植后21天的ABASCs视网膜下空间,我们观察到增加CD45 +细胞浸润(数字6 (b)和6 (c))结合增加Iba1 + ABASC-treated老鼠的视网膜细胞(数字6 (b)和6 (d))。Iba1 +细胞浸润细胞的组成大部分ABASC和OASC-treated老鼠相比,控制(数字6 (b)和6 (e))。没有显著差异渗透OASC-treated CD45 +细胞和Iba1 +细胞的小鼠相比,接受pbs老鼠。

3所示。讨论

在这项研究中,我们OASCs的表型特征,我们证明了OASCs RPE细胞死亡的保护作用在氧化应激的设置,并定义它们的细胞因子分泌比ABASCs。接下来,我们表明,OASCs能够表达早期RPE标记,而视网膜ABASCs表示不太特定的标记,与主coculture后RPE细胞。最后,我们展示了一种血统的特定疗效OASC和ABASC移植视网膜变性的小鼠模型。

3.1。OASCs和ABASCs旁分泌活动

治疗RPE的条件培养基OASCs导致救助的RPE细胞死亡引起的氧化应激。这些数据符合我们的团队进行的一项研究,展示了一种保护作用ABASCs RPE细胞死亡(10]。此外,细胞融合的贡献可能提供这种保护作用。在分化的研究中,我们发现一小部分OASCs和ABASCs经历与成熟的RPE细胞融合。这些混合细胞可能有优势在激活凋亡通路30.]。OASC和ABASC保护作用可能被允许通过高分泌的一些细胞因子,在这项研究中得到证实。我们发现在OASCs和ABASCs条件培养液osteoprotegerin水平高,细胞因子在氧化应激的保护(21]。此外,我们表明,OASCs和ABASCs分泌高水平的血管生成素和HGF其凋亡角色已被阐明22,23]。此外,HGF参与组织再生(而闻名28)这可以解释的有益影响体内。

3.2。变化在视网膜标记表达式OASCs和ABASCs之间分化研究

我们将演示增加早期的RPE标记表达式OASCs和加薪不太特定的视网膜在ABASCs谱系标记表达式。免疫细胞化学研究显示特定核染色PAX6 OTX2 OASCs,暗示明显的血统对RPE OASCs方向(31日]。有趣的是,我们发现ABASCs OTX2的细胞质表达相反的核表达OTX2 RPE细胞(25]在OASCs排序。的细胞质表达OTX2以前与不成熟的棒光感受器(25),以及SIX3的表达和PAX6 [32),这可能意味着一个潜在的ABASCs跟随路径对感光细胞谱系的前兆。

此外,它曾表明,干细胞可以从他们的起源记住表观遗传标记33),它可以提高RPE的分化趋势OASCs [34]。OASCs的胚胎外胚层的共同起源和RPE相比,中胚层起源ABASCs [35)可以解释OASCs RPE的增加标记,展出的核表达OTX2相比的细胞质表达OTX2 ABASCs。

要注意,我们发现人口的RPE细胞融合ABASCs OASCs。虽然细胞融合是一个罕见的现象的不到0.7%的情况下,它可能会有一些影响。首先,这或许可以解释为什么我们发现增加RPE65成绩单中存在的研究仅仅一周后分化的研究中,由于RPE65是通常被称为一个成熟的RPE标记和调节后分化过程中(24]。其次,细胞融合的现象也可能是一个机会增强再生效果,与之前的研究表明,干细胞融合成熟分化细胞促进间充质干细胞的可塑性主要的增加和促进他们的分化36]。此外,它有助于通过表观遗传重编程体细胞核的变化问题,形成一个多功能混合细胞(37),从而提供另一个重组再生潜力的成熟细胞激活选择性生存途径(31日]。

3.3。长期的视网膜下移植OASCs和ABASCs导致视网膜修复的不同层

而不是由Kuriyan和他的同事们最近的一份报告,移植的nonselected整个脂肪组织细胞的混合物注入AMD患者的玻璃,造成毁灭性的结果,本研究干细胞移植的人口是仔细分开整个脂肪组织通过一个两步过程。首先,间充质干细胞分离从脂肪组织中胶原酶消化。第二,细胞被播种在细胞培养板和进一步的纯化与特定的媒介使纯化msc的选择。MSC表型验证通过流式细胞仪分析,如上所述的方法。此外,纯化msc被注入视网膜下空间而不是玻璃腔降低视网膜脱离的风险所观察到的Kuriyan和他的同事们(38]。

众所周知,NaIO3注射引起变性的辊筒和INL27]。我们之前报道,视网膜下移植ABASCs NaIO3小鼠显著增加辊筒厚度,视紫红质强度,和打捞RPE层严重,一个星期后10]。在这项研究中,我们将演示ABASC移植的长期效应,这表明增加辊筒的厚度和视紫红质强度从NaIO3三周后管理。然而,ABASC移植并没有导致显著增加3周后RPE层。这可能是解释的破坏性影响的RPE NaIO3是随着时间增加(39),再加上这一事实ABASCs这里显示有更多比OASCs增加特定的RPE标记的能力有限。OASC移植也并不影响辊筒厚度既不视紫红质强度NaIO3老鼠,可能被注意到的差异解释了在免疫细胞在视网膜层渗透ABASC和OASC治疗。ABASC OASC注射并没有导致恢复INL层,其破坏可能是不可逆转的经过长时间的培养与高碘酸钠浓度如图所示由守et al。39]。我们发现注入ASC 0时刻)染色后移植视网膜下空间。然而,并不局限于移植后21天也不藉)染色或染色与人类特定的标记Ku80和STEM121 [40]。然而,每个人口的移植细胞的疗效是明显的在这个研究。这一现象的解释可能驻留在强烈的对asc旁分泌的影响,可能导致一连串的事件导致RPE层和感光细胞层的保护。移植细胞的生存能力、保留和移植的组织已经被描述为在干细胞疗法的一个主要问题(41),特别是在视网膜移植干细胞(42]。以前类似的旁分泌作用观察移植后关节内注射后的msc描述(43检查参与组成分泌腺,许多研究都在关注MSC改善MSC治疗效果在受伤的组织(44,45]。完成研究的当前调查将移植对asc嵌入bioscaffold更好地改善细胞的生存和保留更长一段孵化视网膜下空间。

3.4。ABASC移植触发免疫细胞浸润在SI老鼠

我们观察到更高CD45 + / Iba1 +细胞浸润在视网膜层ABASC治疗相比PBS组和OASC组。小胶质细胞的含义是与神经炎症触发CD45表达的增加(46]。小胶质细胞Iba1 +产生重大影响神经元生存能力和功能有益或有害的作用,取决于环境(47,48]。有趣的是,小胶质细胞的渗透是参与感光细胞死亡保护(48,49]。因此,Iba1 +细胞浸润在感光层ABASC-treated老鼠可能负责再生感光细胞层中演示了这项研究。有趣的是,我们表明,ABASCs高度分泌ICAM1 eotaxin 3, Ckβ8之前描述激活小胶质渗透进入大脑(50- - - - - -53]。这种分泌物可能直接与高渗透ABASC-treated Iba1 +细胞的老鼠。缺乏Iba1 +细胞浸润增加小鼠接受OASCs可能会与光感受器保护这一群体的缺失。因此,它可能是有趣的学习效果ABASCs Iba1 +细胞耗竭后碘酸钠的小鼠模型。

我们演示了RPE层的保护小鼠接受治疗的小鼠相比OASCs PBS ABASCs或控件。RPE的贡献者外血视网膜屏障的完整性(oBRB)。RPE也展品免疫抑制细胞通过旁分泌防止交通属性和蛋白质从血液到视网膜区域(54]。因此,老鼠RPE层的保存处理OASCs或许可以解释下Iba1 +细胞浸润在这组展出。总之,OASCs表现出特定的能力增加RPE早期标志物的表达和RPE的保护作用在体外和体内。当比较的治疗潜力OASCs与ABASCs,丰富和易于操作的标准14)看到ABASCs视为必要的未来临床应用的发展。再加上一个强大的体内神经保护效应,和增加视网膜谱系标记ABASCs演示了在这项研究中,意味着更广泛的治疗效果和可能的优势与ABASCs作为治疗工具。所有这些数据暗示空间效应的干细胞谱系,OASCs,或ABASCs视网膜再生,区分每个人口未来发展的潜在的细胞治疗视网膜疾病。

4所示。材料和方法

这项研究的目的和程序使用了所有的主题,和一个从每个签署知情同意了。本研究为临床试验伦理委员会批准特拉维夫Sourasky医疗中心,进行根据《赫尔辛基宣言》。

4.1。对asc隔离、表征和文化

腹部皮下人类脂肪组织收获从4健康病人的平均年龄 腹壁整形术。中央和内侧眶脂肪是从7个病人的平均年龄 ,接受例行的追求。没有严重的眼病,代谢性疾病,系统性并发症,或最近接触化疗或免疫抑制药物对这些患者被报道。OASCs和ABASCs孤立根据协议之前描述(14]。短暂,腹部脂肪组织提取轨道时被抽脂脂肪在blepheroplasty提取。脂肪组织是然后洗磷酸盐(PBS)和胶原酶消化我(0.075%胶原酶I型、Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国)的16个小时消化在37°C和中和与杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清的边后卫。消化脂肪离心机在400 g (RCF) 15分钟,在ADSC resuspended介质的颗粒细胞后通过一个100μ筛网过滤器(猫。不。542000年EASYstrainer,他一一Bio-One)来删除所有垃圾。细胞被播种在组织文化板块。细胞培养基代替每周两次。所有实验都通过三个执行。

4.2。表征OASCs为MSC标记流式细胞仪分析

描述培养OASCs在段落进行3 - 4如下:达到100%融合后,细胞使胰蛋白酶化和收集在整除(流式细胞仪管 细胞/管)。细胞被染色和异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白——(PE)共轭人类CD34单克隆抗体(Dako)、CD45 (Dako), CD90 (Dako)、CD105 (eBioscience)和CD73 (BDPharmingen)。排除死细胞,样本沾生动(紫染料可行性、分子探针,表达载体,尤金,或者,美国),根据制造商的协议。第二章细胞的流式细胞仪进行分析流式细胞分析仪(BD生物科学)。fluorochrome-conjugated抗体都是用作控制同形像。

4.3。Multipotency OASCs的骨细胞和脂肪细胞分化

OASCs通道3进行了研究,以确定其分化为骨细胞和脂肪细胞的能力。 细胞在24-well镀板和孵化后与各自的差异化媒体confluency的100%(脂肪细胞:10%的边后卫,1μ地塞米松,0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine 10μg / mL胰岛素,和100年μ(M吲哚美辛在高葡萄糖)- HG - DMEM,骨细胞:茎pro®骨细胞分化基础培养基(Gibco))。媒体改变了每周两次到骨细胞和脂肪细胞分化,2到3周后,分别。脂肪细胞分化是评估使用油红O染色,细胞内脂质积累的一项指标。这些细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下20分钟。细胞培养在0.5% (wt /卷)油红O试剂100%异丙醇(σ)在室温下10分钟。骨分化之后,茜素红染色(σ)与4%多聚甲醛固定后。的图像与油红O和茜素红染色细胞是由光学显微镜。

4.4。主RPE (pRPE)的文化和制备ASC-Conditioned媒介

细胞的人类pRPE镀(Lonza)在100毫米文化菜(Falcon)视网膜上皮细胞生长培养基(RtEGM) Bulletkit (Lonza)和孵化37°C湿润5%股份有限公司₂的气氛。媒介是每周更换两次,细胞通过与0.25%胰蛋白酶/ 0.05% EDTA(生物产业、以色列)到达90%的融合。实验通过三个执行。OASCs和ABASCs ( 细胞)在通道3镀在100毫米的菜(Falcon)和培养对asc BulletKit™介质(Lonza)。对ASC融合100%,洗了PBS和ASC无血清培养基培养(Lonza) 48小时前隔离各自的媒介,包含许多生长因子和细胞因子的释放。两OASC-conditioned介质(OASC-CM)和ABASC-conditioned介质(ABASC-CM)维持在-80°C使用蛋白质阵列(RayBiotec)进行进一步分析。

4.5。救援的研究

4.5.1。RPE细胞与OASC-CM Preincubated接着用过氧化氢

RPE细胞被播种在6-well板(Falcon), 1毫升RtEGM含有2%的边后卫(Lonza)。中改为free-FBS RtEGM重新每两天,直到治疗。达到大约90%融合后,RPE细胞preincubated 48小时与OASCs条件培养基或nonconditioned ADSC无血清培养基(non-CM)控制。RPE细胞然后用PBS暴露于1.5毫米H紧随其后₂O₂(猫。不。216763年,σ)或没有H₂O₂曝光控制。7小时后,RPE细胞死亡是由碘化propidium监控(π)使用流式细胞仪分析。

4.5.2。Propidium碘染色和流式细胞术分析

后救援研究如上所述,RPE细胞通过三个收获了0.25%胰蛋白酶/ 0.05% EDTA(生物产业)。细胞( )被收集在500 g离心5分钟,洗两次与PBS和400年resuspendedμ1 l (PBSμl propidium碘(1毫克/毫升,σ)流式细胞仪测量之前立即添加。至少10000事件收集和标记,荧光细胞被BD流式细胞仪检测CantoTM II血细胞计数器(美国BD Pharmingen)。分析细胞死亡分布是由FCS表达4软件(新创软件、加拿大)。

4.5.3。人类细胞因子抗体阵列

细胞因子的分泌OASCs研究细胞因子抗体阵列收集培养基和ABASCs相比。条件培养基制备如上所述;短暂,对asc的介质改为无血清培养基,经过48小时的潜伏期,并在4500 rpm中收集和离心5分钟和上层清液储存在−80°C,直到他们化验。中释放的细胞因子和生长因子水平是衡量RayBio®人类细胞因子抗体阵列G10(热费希尔)根据制造商的协议。

4.5.4。分化OASCs RPE

我们评估的分化潜能OASCs RPE使用coculture系统(55]。首先,每个细胞株与不同的荧光染料标记为了lineage-trace coculture后分化细胞。OASCs和p-RPE分别标记,绿色荧光染料使用carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE) CellTrace™CFSE细胞增殖工具包(表达载体)和紫色荧光染料使用CellTrace™紫细胞增殖包(英杰公司)根据制造商的指示。然后,OASC ( )与主要人类RPE细胞cocultured ( )细胞一周混合介质由杜尔贝科50%的修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清(的边后卫)和50%的free-FBS RtEGM和孵化37°C湿润有限公司5%₂的气氛。一半的媒介改变了两次一个星期。所有的细胞都是收集和分析与BD FACSAria融合细胞分选仪仪器(BD生物科学)根据各自的标记。结果相比,负control-OASCs noncocultured RPE和积极control-mature主要RPE细胞贴上CellTrace™紫(也称为紫罗兰细胞跟踪)。

4.5.5。表征OASCs ABASCs细胞Coculture后排序

细胞分选后的细胞,我们确定OASC-derived RPE细胞,分化水平的特征,使用引物(表中存在S1分别)和免疫细胞化学利用单克隆或多克隆抗体anti-PAX6 / anti-OTX1/2 (1/100, Abcam,英国剑桥大学),和一只山羊anti-rabbit Alexa萤石594 -共轭crossadsorbed二级抗体(1/1000,英杰公司)。

4.5.6。基因表达量化

OTX2的基因表达谱,PAX6 SIX3, RPE65, KLF4 OASCs costaining后主要人类RPE量化使用中存在为了检测分化标记。结果相比,负control-OASCs非与RPE c-cultured。我们也量化的表达Ck -β8 ICAM1 eotaxin-3, BDNF OASCs和ABASCs证实细胞因子抗体阵列。总RNA提取OASC ABASC细胞培养使用高纯RNA隔离设备(罗氏)或三试剂(Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。总RNA浓度使用qScript cDNA反向转录合成装备(Quantabio)或反面cDNA合成装备(热电电子),和这些基因的信使RNA表达水平是衡量rt - pcr (StepOnePlus-Applied生物系统公司),使用SYBR®绿色qPCR Mastermix(试剂盒)。结果通过使用管家基因GUSB规范化。结果的计算ΔΔCT的相对定量方法。给出了所用引物表的列表S1。

4.5.7。免疫细胞化学

检测视网膜前体细胞标记蛋白质水平,细胞分类和控制镀在13毫米盖玻片在24孔板(Falcon)一夜之间,分别在一个混合介质(50%的边后卫DMEM 10% / 50%的free-FBS RtEGM)或在DMEM含有10%的边后卫和孵化37°C在湿润的气氛中(分别为5和8%的二氧化碳)。细胞与4%多聚甲醛固定20分钟,permeabilized 0.1% Triton™x - 100 5分钟,与PBS稀释2% BSA封锁在一夜之间,用兔子主要抗体标记anti-OTX1/2 (OTX1不是表达RPE和感光细胞(56])或PAX6 1小时在室温下。山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L) Cross-Adsorbed二级抗体,Alexa萤石594(- 11012),和Alexa萤石®488 Phalloidin(英杰公司)被稀释在磷酸盐含2% BSA 1小时在室温下,检测OTX1/2或PAX6。核与DAPI染色在热科学™Shandon™Immu-Mount™。

4.5.8。动物的过程

野生型C57BL小鼠腹腔内注射(IP)收到50毫克/公斤的碘酸钠(NaIO3) (Sigma-Aldrich) ( )。碘酸钠诱发氧化应激和急性损伤RPE触发进步的视网膜损害(26]。24小时注射后,小鼠麻醉,和一个小自动封口的巩膜切开术的提示执行30-gauge针。36-gauge针注射器连接到汉密尔顿(Hamilton公司,雷诺,内华达州,美国)是通过巩膜切开术插入视网膜下空间,和注射1.5μl (PBS包含 细胞进行。

老鼠接受了环孢霉素饮用水中移植了一个星期后,在一个集中的210 mg / l。动物后的处理和实验机构护理指导方针批准特拉维夫Sourasky医学中心的动物伦理委员会。

4.5.9。组织准备

零天小鼠安乐死和视网膜下移植后三周;眼睛是无核的,固定在4%甲醛(默克公司,达姆施塔特,德国)。眼睛在PBS洗然后孵化与30%蔗糖在PBS cryoprotection一夜之间在4°C。固定的组织是嵌入在10月组织冷冻剂(Scigen科学、嘉丁拿、钙、美国)和干冰冷冻。截面(10μ米)被放置在X-tra胶粘剂幻灯片(徕卡生物系统、彼得伯勒、英国)和存储在-20°C。

4.5.10。免疫组织化学

冰冻的幻灯片被苏木精和伊红染色())。免疫荧光染色,部分在PBS 20分钟洗和屏蔽5%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich), 1%正常山羊血清(上天)(表达载体,没有。特里同x - 100年31872)和0.5% (Sigma-Aldrich) PBS室温1小时。一夜之间,部分被孵化的anti-RPE65兔单克隆抗体主要(ab231782, 1: 200), anti-CD45克隆IBL-5/25鼠单克隆抗体(EMD微孔,默克,达姆施塔特,德国,1:50),鼠标anti-rhodopsin单克隆抗体(EMD微孔,默克,达姆施塔特,德国,1:200),Iba1,和兔抗体(Wako,大阪,日本,1:1000),在屏蔽解决方案在4°C。幻灯片是洗了三次pbs - 0.5% Triton x - 100 (PBST),孵化Alexa萤石488山羊anti-rabbit, Alexa萤石546 Goat-anti-rat, Alexa萤石546山羊anti-mouse(表达载体,1/200)PBST 1 h在室温下在屏蔽解决方案中,与PBST又洗了三次。核的部分被孵化DAPI染色(分子探针,热费希尔科学)10分钟,洗两次在PBS,安装在ImmunoMount(热科学,9990412)。

图片进行了蔡司LSM 700共焦显微镜蒙蔽的方式。分析是由ImageJ软件。RPE65视紫红质强度和量化积极CD45 Iba1细胞进行了通过测量荧光强度相对于图像的背景。同时,辊筒的厚度和INL评估通过测量辊筒的长度和INL层(与DAPI染色)层的至少6分。所示的部分选择在同一距离视网膜视神经盘和在同一象限。

4.6。统计分析

统计分析使用GraphPad棱镜软件(版本9.0,GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州)。Mann-Whitney测试被用于分析非参数数据。老鼠结果,克鲁斯卡尔-沃利斯非参数测试是用来识别三组之间的差异。统计学意义是接受值< 0.05。

数据可用性

将给定的要求。

伦理批准

本研究通过特拉维夫Sourasky医学中心机构审查委员会(赫尔辛基委员会批准号920120440)。所有实验过程涉及患者在本研究中被批准的特拉维夫Sourasky医学中心的机构审查委员会(赫尔辛基委员会批准号920120440)。

同意

书面或口头知情同意是获得所有的病人;这项研究符合赫尔辛基宣言中概述的原则。

信息披露

本研究提出了在视觉和眼科学研究协会(下午)年度会议文摘2021年6月。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

B.K.写论文;的手段,S.W. and I.N. conducted the experiments; A.B. and B.K designed the experiments. Bryan Krief and Shira Weisthal Algor contributed equally to this work.

确认

本研究是勇气基金会赠款支持从猎户座格兰特(260375)和(213310)。

补充材料

表S1:定量rt - pcr引物用于实验。补充图1:检测细胞在视网膜下空间NaIO3 ASC移植的小鼠模型。(补充材料)

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