骨髓间充质干细胞的特点是独立的储存温度

文摘

间充质干细胞再生医学中扮演重要角色,由于他们的自我更新能力和多功能分化。研究或临床应用,期间收获骨髓吸入物选择性手术分离msc。如果立即净化msc是不可能的,必须存储骨髓。因此,本研究的目的是调查可能不同的干细胞特性对于自我更新能力,脂肪形成的,chondrogenic,和成骨分化,表面抗原的表达在不同储存条件的骨髓吸入等。三组进行分析:第一组是纯化后立即收获,其他两组处理后储存的18到24小时22°C(室温)或在4°C。比较两组之间进行非参数数据的利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验。最后的结果显示不同的储存条件之间没有显著差异。因此,存储的骨髓送气18到24小时在室温或4°C是不可能失去干细胞特性。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是多功能self-renewable细胞能够分化成各种细胞类型像脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞(1]。他们主要从骨髓中分离,但类似的人群中也发现了其他人体组织如真皮,脂肪组织,脐带血,胎盘(2- - - - - -4]。

此外,msc假定有免疫调节功能在骨关节炎(5)通过影响适应性和先天免疫系统(6,7]。这几个特征注定msc取代受损的细胞或刺激内源性修复机制(8]。间充质干细胞的能力遵守和增殖细胞培养表面允许他们扩大在体外(9]。因此,msc在再生医学中发挥着重要的作用10,11]。在创伤骨科手术,MSC-based概念的例子,播种msc在支架(12)——作为替代当前黄金标准的方法,以避免可能出现的并发症与自体骨缺损治疗或allogeneous骨移植13,14]。然而,msc还用于许多其他临床学科例如通过免疫调节效应治疗移植物抗宿主病(15]。

为了进一步发展应用干细胞的临床实践中,研究msc是必不可少的。在我们部门,隔离msc通常发生后立即骨髓送气的收获。在晚上或周末,直接处理骨髓由于人员短缺是不可能的。在这种情况下,骨髓抽出物必须存储在一夜之间。因此,我们的研究的目的是调查的影响更长的存储(18到24小时)在不同的温度下对人类骨骨髓来源干细胞的特点(hBMSCs)关于自我更新能力,脂肪形成的,chondrogenic,和成骨分化潜能,表面蛋白的表达。

2。材料和方法

2.1。伦理批准和hBMSCs净化

研究涉及人体组织、研究伦理批准协议和净化的过程,分析hBMSCs汉诺威医学院伦理委员会获得的2562号(伦理)。此外,自愿从每个捐赠者获得了书面知情同意,和所有个人数据是匿名的。总共有六个捐助者。

人类骨髓收获了髂嵴愿望在选择性标准骨科或创伤外科创伤汉诺威医学院。在骨髓抽出物的直接转移到实验室,骨髓被分为三组。第一组是纯化立即(0 h组),另两组处理后存储18到24小时在室温下(RT;22°C)或在4°C。的注射器骨髓收获是用于存储。

后来,hBMSCs被密度梯度离心法分离30分钟 没有刹车使用合成polysaccharide-epichlorohydrin-copolymer (Biocoll®, Biochrom,柏林,德国)[之前所述16]。不久,单核细胞的间期包含提取,洗,播种在MSC生长培养基(DMEM FG 0415 (Biochrom))和10% ( )胎牛血清(HyClone®的边后卫,费舍尔科学、Schwerte,德国),20毫米4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰,Biochrom), 1% (100 U /毫升/ 100μg / ml)青霉素和链霉素(Biochrom),和2 ng / ml重组人成纤维细胞生长因子2 (FGF2 PeproTech,德国汉堡)。现在细胞通道0 (P0)。细胞培养在37°C和5%的公司₂直到70 - 80%的密度达到[16]。使执行0.025% Trypsin-EDTA解决方案(Biochrom)和细胞被播种密度 细胞每厘米²在接下来的段落。所有实验都是在通道4 (P4)或另有规定。

2.2。细胞数量和集落形成Unit-Fibroblast化验(CFU-F试验)

细胞的总数1毫升的骨髓决心P0通过计算使用纽鲍尔计数室的细胞。分析的自我更新潜能hBMSCs,两个CFU-assays P1和P4的进行。双细胞进行测定six-well板块(Frickenhausen,他一一Bio-One GmbH德国)在500年降低浓度,250和125细胞/。菌落培养10天在37°C和5%的公司₂。之后,细胞被固定与甲醇(默克公司,达姆施塔特,德国)和1%结晶紫染色30分钟(默克公司)的解决方案。种群数量的比例计算确定每100个种子细胞克隆。

2.3。流式细胞术(FC)

对流式细胞术 细胞被使用。在P4,细胞分离使用0.025% trypsin-EDTA解决方案并与FC缓冲区(2%(洗两次 )在PBS的边后卫)。离心分离的步骤进行 和4°C两分钟。之后,这些细胞被孵化与适当的fluorochrome-conjugated抗体(Biolegend,科布伦茨,德国;表1在4°C) 60分钟在黑暗中。这一过程伴随着两个清洗步骤与FC缓冲区。流式细胞仪的细胞进行分析(BD生物科学、海德堡、德国)章记录 像之前描述的那样细胞(17]。死细胞已排除了使用散射参数使用BD流式细胞仪天后2.5.0软件和流动的软件版本。

2.4。在体外分化和组织学染色

chondrogenic脂肪形成的,和成骨分化潜能的干细胞诱导过程方便分化了媒体。每个诱导细胞组相应对照组。干细胞都存储在一个细胞培养孵化器在37°C和5%的公司₂。

2.4.1。脂肪形成的在体外分化

脂肪形成的差异化,hBMSCs被播种在six-well板块包含150000个细胞/。24小时后,分化过程是由脂肪形成的介质组成的DMEM FG0435(500毫升( ),Biochrom)、地塞米松(1μ米( ),西格玛奥德里奇)、吲哚美辛(60μ米( ),西格玛奥德里奇),3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, 500年μ米( ),西格玛奥德里奇)、胰岛素(10μ克/毫升( ),(西格玛奥德里奇),4)- 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰,20毫米( ),Biochrom)、青霉素、链霉素(1% ( ),Biochrom)和胎牛血清(的边后卫,20% ( ),Hyclone®)。控制介质由DMEM FG0415(500毫升( ))(4)- 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰,20毫米( ))胎牛血清(的边后卫,10% ( ),Hyclone®)和青霉素和链霉素(1% ( )),也用于成骨分化的对照组。媒体每7天更换一次。细胞组织学分析在4%福尔马林溶液固定在天0,7、14、21日和28日和沾油红O (5 g / l在60%异丙醇,罗斯)25分钟。每一个与100 x放大的照片拍摄在显微镜CKX41(奥林巴斯、东京、日本)。对定量分析,脂肪形成的差异化的程度是评价平均分配的染色面积与面积有关。因此,自己编写图像处理工具,它指的是使用OpenCV库(4.1.0版)。三个代表图像进行评估,以确保有效的结果。基于不同的色相和饱和度值,脏的地方一直除了背景。阈值水平设置手动通过评估特定参数使用代表形象。这些数据被用于整个考试促进一致的评估。

2.4.2。成骨的在体外分化

除了分化培养基和固定的天,成骨分化过程与上面描述的脂肪形成的分化。骨生成的分化培养基的DMEM FG0415(500毫升( ))(4)- 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰,20毫米( ))胎牛血清(的边后卫,10% ( ),Hyclone®)、青霉素、链霉素(1% ( ))地塞米松(100海里( ))ascorbate-2-phosphate (500 ng / ml ( ))和钠₂HPO₄/不₂阿宝₄(3毫米( ),4 pH值7日,默克公司)作为磷源。组织学在4%福尔马林溶液固定发生在28天,42。样本染色10分钟在黑暗中有0.5%茜素红S(丙烯酰胺、德国)pH值4.5。定量分析了脂肪生成描述的一样(部分2.4.1)。

2.4.3。Chondrogenic在体外分化

chondrogenic分化,250000 hBMSCs resuspended控制介质(DMEM FG0435(500毫升( ),(4)- 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰,20毫米( ))青霉素、链霉素(1% ( ))地塞米松(0,1μ米( ))Insulin-Transferrin-Selenium(其10μl /毫升( ),西格玛奥德里奇),ascorbate-2-phosphate (170μ米( ),西格玛奥德里奇),sodium-pyruvate(1毫米( ),Biochrom),和脯氨酸(350μ米( ),罗斯)和离心机来生成所需的颗粒形式。后来,小球在分化培养基培养(控制介质与额外的转化生长因子-β3 (TGF -β3、10 ng / ml / 1.1μl ( ),Peprotech))。媒体每7天更换一次。组织学分析,差异化是停在7天,14日,21日和28日,小球在4%福尔马林溶液固定,嵌入在组织Tek(场外蓝色,樱花Finetek Staufen,德国),并在液态氮冷冻。组织学切片5μm是生成cryomicrotome (Microm HM 500 OM, Microm,老总孔翰宁德国)和转移到显微镜载玻片(SuperFrost +热科学、达姆施塔特,德国)。干燥后,样本染色safranin-O 0.1%解决方案(默克公司)15分钟。数字化后,定量分析了使用两个不同的组来确定软骨形成的成功发展。软骨形成分级是积极的还是消极的分化。评价,不同的区域在样本明显。之后,一个网格是图片,和箱子的面积与手动两种不同组数细胞计数器。因此,每个组的百分比/生成软骨形成颗粒。

3所示。统计分析

使用SPSS统计分析进行统计®,版本24 (IBM SPSS统计Corp .,纽约,纽约)。所有数据被非参数。这项研究的主要结果是检测三个不同的储存条件之间的显著差异。因此,对比使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验组进行。结果表示为中值和95%置信区间(例如,5% (-9.53% CI: 3.90))。图形结果显示箱线图或点阴谋。一个值≤0.05被认为是显著的。

4所示。结果

4.1。细胞数量和CFU-F化验

细胞的总数计算每毫升骨髓(BM)后立即和延迟处理的大英博物馆(图1)。两组之间未发现显著差异( )。

的自我更新能力hBMSCs评估CFU-F化验在P1和P4(图2),没有看到显著差异之间的三种不同的隔离组。后立即隔离的BMSC (0 h), 5% (-9.53% CI: 3.90)的种子细胞形成一个菌落。相比这是一个很大的不同之处P4的同一组只有2% (-3.30% CI: 1.90)的细胞能够形成一个殖民地( )。未发现显著差异在P1和P4组4°C (P1: 5% (-9.07% CI: 4.10)和P4: 2% (-5.67% CI: 1.77; ))和RT (P1: 3% (-12.40% CI: 2.90)和P4: 2% (-3.50% CI: 1.77; ))。

4.2。在体外分化hBMSCs

4.2.1。准备脂肪形成的分化

所有在脂肪形成的分化培养基培养的干细胞脂肪形成的分化(数字展出3(一个)- - - - - -3 (c))。对照组都是负面的。28天,三组的中位数显示几乎相同的值(CI: 31 - 66%)与46%组0 h;(41%置信区间CI: 27 - 56%)在4°C和40%组(CI: 32 - 73%)在RT组( ;图3 (d))。

4.2.2。成骨分化

所有干细胞培养的成骨分化中表现出成骨分化28天,42(数字4(一)-4(c))。对照组都是负面的。对于这两个时间点,之间没有显著差异的存储条件(28天: 和42天: )检测如图4(d)。

4.2.3。Chondrogenic分化

观察软骨形成的诱导组除了两个样品不同的捐助者(一个在室温和一个在4°C)。对照组都是负面的。考试的积极软骨形成显示三组之间无显著差异(0 h: 51.62% (CI: 33 - 75%);4°C: 42.55% (CI: 34 - 79%);RT: 36.32% (CI: 18 - 57%); ;图5)。

4.3。流式细胞术(FC)

13个不同的表面蛋白的表达被流式细胞术分析。有关的表达CD13、CD29、CD44, CD73, CD90、CD105,和CD166平均超过90%,比例和表面蛋白CD11b CD15表达CD31、CD34、CD45,不到10%在干细胞中值(表2)。

克鲁斯卡尔-沃利斯检验证明了积极的表达无显著差异(CD13: ;CD29: ;CD44: ;CD73: ;CD90: ;CD105: ;存在: )和消极的(CD11b: ;CD15: ;CD31: ;CD34: ;和CD45: )三个实验小组之间的表面蛋白。

5。讨论

msc的播种到支架治疗大骨头orthopeadics缺陷是一个重要的研究领域,但在临床环境中,不可能总是立即隔离干细胞的骨髓为研究目的。

因此,本研究的目的是探讨影响隔夜存储的骨髓hBMSCs的特点在不同的温度下。我们所知,目前没有出版物描述各种存储条件骨髓hBMSC送气前隔离。然而,我们发现了一些出版的影响各种hBMSCs隔离后的储存条件。

孙等人研究的持续时间的影响在体外存储从msc生存能力、自我更新和分化能力在4°C和室温。更长时间,分化潜力降低。存储温度有关细胞质量没有显著影响(18]。这一事实是我们的研究结果一致,没有发现显著差异比较存储在4°C和室温。

其他参数,另一项研究比较了不同温度的影响(4°C, 37°C,和室温)可行性,分化能力,和表达的表面抗原的新鲜和frozen-thawed msc。存储msc在室温或37°C显示生存能力低于4°C。表面抗原的分析显示一个类似的表达式模式对新鲜msc独立的储存条件(4°C或室温)(19]。

根据最小标准定义从ISCT msc,定义的标记(CD73 CD90、和CD105)也表达了在我们的尝试(msc在所有组20.]。除了这些积极的标记,我们对表面蛋白应负的msc。其他出版物的负面结果表达式是相等的(17,20.,21]。HLA-DR的表达不是因为添加FGF2 MSC生长介质测量已知诱导这表面抗原的表达22]。

评估自我更新的孤立hBMSCs, CFU-F化验使用这是一个科学的建立方法单独使用来衡量潜在的定量形式(23,24]。三个实验小组在段落的比较1和4并没有发现统计学显著差异。因此,我们假设检查储存条件没有影响干细胞的自我更新。在通道1中,在通过观察菌落的数量高于4在所有组与统计学意义组0 h。这种情况下是由于复制衰老细胞的文化也被Schellenberg et al。在他们的实验中,集落形成单位拒绝的频率越来越多的细胞通道(25]。

至少其他先前的研究检查了可能来自其他组织来源的干细胞隔离后存储。佩里等人表明牙科pulp-derived msc是可能的隔离五天后拔牙和储存在4°C和暗示一个立即准备不是强制性的(26]。脂肪干细胞可用于长期储存后隔离从脂肪组织。使用的示例应该储存在室温下,在24小时内(27]。

6。结论

总之,结果认为没有明显的最喜欢的角色一个检查存储条件骨髓送气音。这表明一个存储的骨髓送气18到24小时在室温或4°C有可能没有丧失干细胞有关脂肪形成的特点,chondrogenic,和成骨分化,以及自我更新能力和评估表面蛋白的表达。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Valentin Schrodi和克劳迪娅Neunaber同样这项工作。

确认

这项研究是由其他Kroner-Fresenius-Stiftung(2016年格兰特- a188)。我们要感谢所有参与病人的骨髓捐赠。此外,我们要感谢克劳迪娅磨蹭和媚兰维斯宝贵的援助。功能和应用解剖学研究所的汉诺威医学院慷慨使我们为本研究使用流式细胞分析仪。这项工作是Valentin Schrodi博士论文的一部分。

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