骨骼间充质干细胞为韧带再生和Graft-Bone治疗前交叉韧带重建后Silk-Collagen脚手架

文摘

前交叉韧带(ACL)重建实现使用一个骨骼间充质干细胞(bmsc)和silk-collagen支架,和体内评价的结合。通过结合I型胶原蛋白和脱胶丝素蛋白网,silk-collagen支架准备模拟韧带组件。兔子的bmsc从骨髓中分离培养的同质人口和播种silk-collagen脚手架。脚手架和BMSC (S / C)组,支架被播种的BMSC 72 h,然后滚,用来取代ACL在20个兔子。支架(S)组支架只沉浸在培养基72 h用于ACL重建。标本收集4和16周术后评估韧带和骨骼再生一体化。他和免疫组织化学染色(包含IHC)进行评估膝盖韧带再生腔。评估graft-bone界面骨整合,他Russell-Movat染色,ct机,并进行生物力学测试。4周后,积极观察细胞增殖的核心部分脚手架在S / C组,和一个数量的纤维母细胞和细胞外基质(ECM)是观察到的中心部分移植手术后16周。在术后4和16周,tenascin-C表达式在S / C组明显高于在S组(4 w, ;16 w, )。此外,骨整合是S / C组比S组的组织学观察小梁骨生长到贪污和更多的矿化组织形成微ct探测到(4 w,骨体积分数(BV /电视), ,骨矿物质密度(BMD), ;16 w, BV /电视, ,弹道导弹防御, )。这些结果表明,bmsc促进膝盖韧带再生腔和graft-bone界面骨整合。Silk-collagen支架和bmsc可能会为今后临床实践相结合。

1。介绍

前交叉韧带(ACL)是一个主要的结构,保持膝关节的稳定性(1]。作为一种常见的运动损伤,膝关节ACL断裂会造成严重破坏,如不稳定,其他韧带受伤,位错,骨关节炎(2,3]。ACL重建目前被认为是治疗的黄金标准ACL断裂,和移植包括自体、同种异体,合成移植物用于此目的(4- - - - - -6]。然而,这些移植有一定的局限性。的缺点包括手术时间长、自体供体,康复时间长,并发症减少膝盖的活动范围(7]。同种异体的缺点是成本较高,较高的感染率,相比更高的失败率(自体8]。永久合成移植的并发症包括骨关节炎、慢性滑膜炎、异物反应,和长期的破裂(9]。骨间充质干细胞(bmsc)和韧带组织工程已成为有前途的技术解决这些缺点。

重建ACL,组织工程需要满足以下条件:提供立即联合手术后稳定,保证良好的韧带在膝关节腔再生工程组织逐渐降解,减少,和建立良好的骨整合在手术后长期稳定graft-bone接口(10]。在先前的研究中,我们设计了一个移植结合与针织脱胶丝素蛋白胶原基质重建ACL在一只兔子模型(11]。silk-collagen脚手架被发现具有良好的生物相容性和生物力学性能(12]。然而,在术后早期,有限长在肉内的韧带在膝关节腔限制新再生结缔组织再生,和骨组织骨隧道破坏graft-bone治疗(13,14]。

bmsc多能细胞,成为一个非常重要的细胞来源的细胞治疗和组织工程修复(15]。多个分化潜力的治疗应用程序时植入的生物可降解支架在几个以前的研究已经证明(16- - - - - -19]。虽然细胞启动和调节韧带再生和graft-bone愈合过程尚未澄清(20.),似乎bmsc的骨髓从促进韧带骨隧道再生和修复graft-bone接口(21]。林等人证明MSC-enhanced大腿肌腱的破坏载荷和刚度明显在ACL重建手术后8周大兔子模型(22]。根据很快et al ., msc可能形成一个中间纤维软骨区骨与异体肌腱重建手术后(23]。

没有统一的和被广泛接受的方法可用来指导bmsc是如何应用的。BMSC应用程序方法包括局部注射(24],bmsc表技术[25),结合纤维蛋白胶或胶原蛋白凝胶17,26),植入组织工程的支架(27,28]。在组织工程的支架植入bmsc似乎更可靠,因为它小分心bmsc的生长状态和环境。基于此背景下,我们播种bmsc silk-collagen脚手架,试图确定bmsc能否促进膝盖韧带再生腔和graft-bone愈合。在目前的研究中,一只兔子ACL重建模型与silk-collagen脚手架有或没有bmsc成立。我们假设bmsc可提高膝盖韧带和骨再生graft-bone接口集成,通过组织学评估,ct机和生物力学测试。

2。材料和方法

2.1。支架制备

提供的生丝纤维浙江Cathaya国际有限公司使用0.02 Na脱胶过程完成₂有限公司₃(100°C 60分钟,3次)提取丝胶,如先前所述的研究[11]。分离和提纯的胶原基质猪跟腱进行稀酸和中性的盐提取(29日]。针织丝绸网提取丝胶被浸泡在酸性胶原溶液(I型、pH值3.2 w / v 1%),冷冻干燥(-80°C 12 h紧随其后Heto PowerDry LL1500 24 h),并受dehydrothermal交联在真空炉(30毫托,105°C 24 h) (11]。生丝的表面微观结构的观察,脱胶丝,silk-collagen脚手架使用扫描电子显微镜(SEM)进行。最后,cobalt-60-sterilized silk-collagen支架准备以下评估。

2.2。隔离、文化和bmsc的识别

从新西兰白兔骨髓吸入物提取( ,12周大)被用来分离和文化bmsc,如前所述[17]。单核细胞聚集在Ficoll-Hypaque梯度离心后(σ),然后悬浮在细胞培养中含10%胎牛血清(的边后卫,Gibco)。培养基的改变,悬浮细胞后被文化37°C公司5%₂72 h。当贴壁细胞融合达到70 - 80%,亚文化。文化2周后,同质BMSC人口了,第三段是收集和播种silk-collagen脚手架。bmsc附着脚手架上的扫描电镜观察到72 h后播种。成骨、脂肪形成的3和chondrogenic分化能力的细胞被发现后文化有特殊诱导媒体(Gibco)为3周。最后,茜素红(Sangon),油红O (Sangon)、阿尔新蓝染色(Sangon)是根据制造商的协议执行。

2.3。流式细胞术

确认的齐次性质通过3 bmsc培养2周,具备干细胞标记物进行了表征。羊anti-rabbit抗体CD29、CD73 CD105和藻红蛋白(PE)标记免疫球蛋白二次抗体从eBioscience购买(CA)圣地亚哥。约 细胞被收获,100年resuspendedμL磷酸盐(PBS)。细胞培养的初级抗体CD29 (1: 100), CD73(1: 100),和CD105(1: 100) 1小时在4°C。随后,PBS的细胞被洗3次,和上层清液被丢弃在250×g离心5分钟。在100年和细胞resuspendedμL PBS和孵化PE-labeled二级羊抗体(1:200)40分钟在黑暗中在4°C。PBS的细胞被洗3次,和上层清液被丢弃在250×g离心5分钟。细胞被立即测试机(BD LSRFortessa) resuspended后400μL PBS。数据与FlowJo 10.0软件进行了分析。

2.4。动物模型研究设计

本研究使用40华兰生物工程公司提供的雄性新西兰白兔(2.5 - -3.0公斤,12周大,没有认证。:SYDW20190409)。在郑州大学第一附属医院伦理委员会批准试验协议(伦理审查。:2020 - ky - 012)。两个equal-numbered组(支架组,年代;脚手架和bmsc集团S / C)是由随机划分兔子,和ACL重建进行了膝盖的左后腿。S组、丝绸支架是沉浸在培养基72 h, S / C组,而丝绸支架被播种的bmsc 72 h;那么这两种类型的支架,用于滚ACL重建(图1(一))。在手术后4和16周,每组10只兔子被牺牲了。每组五个标本进行评估韧带再生的苏木精和伊红(他)染色和免疫组织化学染色(包含IHC)和graft-bone为骨整合界面由他和Russell-Movat (RM)染色。在剩余的标本Graft-bone愈合评估( )使用ct机和生物力学测试。

2.5。外科手术

ACL重建是在严格的无菌条件下进行的,和所有操作都由一个人(Bi)。全身麻醉后通过戊巴比妥(饲,30毫克/公斤体重),手术区域剃,消毒和覆盖。暴露的膝关节腔通过沿着髌腱3厘米切口,然后本机ACL(图中删除1 (b))。2.0毫米柯式线是用来使隧道在股骨和胫骨。贪污插入穿过骨隧道,其目的是连接到周围的软组织和骨膜1:0 Ethibond缝合(图1 (c))。然后,兔子在笼子里没有限制手术后。

2.6。韧带重建评估

收集后,tibia-graft-femur复合物( 每组在每个时间点)立即放入多聚甲醛(4%;Sangon) 24 h。膝关节腔的贪污是收集、脱水和嵌入。切片后,片沾着他。分析了韧带再生tenascin-C免疫组织化学染色。Image-Pro + 6.0软件(IPP6.0)是用来计算的平均密度免疫反应性tenacin-C贪污。

2.7。Graft-Bone治疗评估

移植后从tibia-graft-femur解剖复杂,在graft-bone界面骨整合评估使用剩下的骨头样本。骨样本脱钙,乙二胺四乙酸(EDTA);10%),直到他们可以很容易地用刀片切割。脱水和包埋后样本分组,和片沾他和RM评估骨整合。

2.8。微ct评估

tibia-graft-femur复合物( 每组在每个时间点(36)准备ct机扫描μ米厚度;力量Skyscan 1176年,比利时安特卫普)和立即收集后储存在-80°C。标本被放置在冰箱(4°C)一夜之间在测试之前解冻。检测的矿化组织再生graft-bone界面都使用x光照片图像。计算骨矿物质密度(BMD),小梁数目(Tb.N),骨体积分数(BV /电视),小梁厚度(Tb.Th)和小梁分离(Tb.Sp) 2.0毫米直径的圆柱范围包括graft-bone接口标准是由三维微观结构分析(30.]。

2.9。生物力学测试

下一步是进行生物力学测试。tibia-graft-femur复杂( 每组在每个时间点)是由解剖膝关节周围软组织除了贪污。股骨和胫骨拧成定制的钢管,钢管是英斯特朗553年获得一个英斯特朗)(生物力学测试系统。十字头的速度拉伸载荷在生物力学测试是5毫米/分钟。伸长(毫米)和破坏载荷(N)记录,并记录曲线的斜率表示刚度(N /毫米)。tibia-graft-femur复合物与生理盐水保持湿润。

2.10。统计分析

本研究中收集的数据表示为 (SD)。SPSS 16.0软件是用于统计分析。被认为具有统计显著性差异 。独立样本 - - - - - -测试被用来检测组之间的差异。

3所示。结果

3.1。扫描电镜观察

生丝纤维的表面是不规则的丝胶涂层在蚕丝蛋白(图2(一个))。丝蚕丝蛋白,约10μ米直径,表面光滑,完整的脱胶后(图可见2 (b))。冷冻干燥的过程和dehydrothermal交联后,丝素蛋白表面的胶原蛋白海绵分布式进入编织网的戒指,导致一个模糊的表面(图2 (c))。bmsc坚持胶原表面播种后固定在支架在培养皿(图72 h2 (d))和保持着良好的细胞形态(数字2 (e)和2 (f))。

3.2。bmsc的识别

茜素红、油红O、阿尔新蓝染色进行细胞培养后3周的诱导培养基。矿化结节、脂滴和绿色细胞质与茜素红染色后在显微镜下观察,油红O、阿尔新蓝(图3)。流式细胞术结果显示,第三段细胞有高表达CD29 (71.7%)、CD73(98.9%),和CD105(98.1%)(图4)。

3.3。韧带重建评估

细胞浸润和tenascin-C生产被他和免疫组织化学染色法评估。S / C组中,相当大的细胞中观察到移植的核心部分,而S组,只能观察到一些细胞在移植术后4周(数字5(一)和5(b))。纤维母细胞在16周手术后,变得更加规律和密度比S组(S / C数据5(c)和5(d))。tenascin-C表达式S组明显低于S / C组在手术后4和16周(数字6(一)和6(b))。

3.4。Graft-Bone治疗评估

组织学染色显示与软骨细胞薄层结缔组织graft-bone接口在4周后重建手术。没有发现明显的骨整合两组;虽然,更多的细胞分布在核心部分的S / C组比S组(数字7(一)和7(b);图8(一)和8(b))。术后16周,成熟的骨小梁和相当大的细胞入侵的脚手架可以注意到graft-bone接口S组,而集成的小梁骨移植在S / C组(观察数据7(c)和7(d);数据8(c)和8(d))。

3.5。微ct评估

微ct重建高分辨率的横截面图像的胫骨和股骨。形成的矿化组织graft-bone接口可以很容易地观察到。在两组,很少有矿化组织发现在术后4周(graft-bone接口数据9(一)和9(b))。BV /电视,结核病。Th和BMD值显著增加更多的S / C比S组(表1)。然而,在16周后重建手术,不同的信号指示出现新矿化组织再生graft-bone接口两组(数字9(c)和9(d)),更大的增加结核病。Th和BMD在S / C比年代观察组(表1)。

3.6。生物力学测试

在两组移植失败在膝关节腔破裂或从骨隧道撤军。没有明显的差异之间的破坏载荷被发现两组在手术后4和16周(4 w S 和S / C , ;16 w,年代 vs。 , ;图10 ())。刚度计算通过记录载荷变形的位移和破坏载荷曲线。刚度没有明显不同的两组手术后4和16周(4 w S 和S / C , ;16 w,年代 vs。 , ;图10 (b))。

4所示。讨论

ACL重建组织工程移植物都集中在膝盖韧带再生腔和graft-bone骨整合界面(31日]。目前的研究显示,综合提升韧带重建手术后再生和graft-bone愈合使用silk-collagen脚手架。纤维母细胞和支架是由许多渗透tenascin-C口供在手术后4和16周。graft-bone界面表现出良好的骨整合在手术后16周。结果表明:bmsc结合silk-collagen ACL组织工程支架是一个很好的前景和未来的临床使用。

理想情况下,一个ACL重建组织工程支架需要模拟生物功能以及韧带的几何结构(32]。ECM是重要的指导组织的生成,维持体内平衡,提供机械支持韧带重建过程中。丝绸的silk-collagen脚手架利用固有的力学性能和针织的适用性以及胶原蛋白的良好的生物相容性矩阵。胶原蛋白基质丝蚕丝蛋白之间的空间和提供了一个附件点种子细胞。

滑膜层包括膝关节腔,提供更少的血管微环境。在4和16周后手术,较少的细胞被吸引到支架,和ECM沉积发生在S组比S / C组。结果显示,很少有从周围组织细胞迁移到支架,并植入bmsc扩散细胞支架和再生ECM起到了推波助澜的作用。球迷和他的同事们发现,生产tenascin-C collagen-II, collagen-I干细胞共培养后大大提高了丝支架后7和14天(33]。Tenascin-C,细胞外基质糖蛋白在关节内的移植,总是积极地重塑组织中表达,高度受限的基因表达模式34]。tenascin-C表达式S组明显低于S / C组在术后4和16周。结果表明,移植在S / C组表现出更多的充满活力的韧带再生比那些年代集团和植入bmsc导致细胞增殖和基质沉积。

成功的ACL重建需要固体graft-bone治疗(17]。Graft-bone愈合骨隧道内要求骨骼生长到Graft-bone接口。Kanaya和他的同事们(35)报道,切断部分萎缩,MSC(-)组和界面仍然缺乏组织术后时间点,而在MSC(+)组,GFP-positive细胞被发现在术后2、4周愈合组织覆盖断掉的部分。MSC(+)组的组织学评分明显优于MSC(-)组。据香港和他的同事们,bmsc可能促进graft-bone愈合过程,cartilage-like细胞扩散和垂直的胶原纤维逐渐形成于术后4周在一只兔子模型(36]。在目前的研究中,cartilage-like细胞扩散,少fibrocartilage-like graft-bone界面的组织形成S组比S / C组在手术后4周。成熟的骨小梁的核心部分被发现贪污S / C组在术后16周,只有成熟的骨小梁发现S组的接口。graft-bone愈合过程可能会被主人从周围的骨髓干细胞在骨隧道37- - - - - -39),但宿主细胞渗透到移植手术后可能需要超过4周(20.]。基于目前的研究,认为植入bmsc主要是促进骨移植和骨之间的集成。

奥卡河和他的同事们发现,在graft-bone界面骨整合确定ct机参数(40]。ct机可以辨别细微变化骨隧道和收集新形成的矿化组织的总信息通过成像(41]。本研究评估使用微ct骨整合。更多的矿化组织中检测到骨隧道的S / C组比S组在术后4和16周;这一发现与组织学研究。

的两个主要参数韧带组织工程再生的破坏载荷和刚度。之前的研究表明,丝绸通过蛋白水解降解退化,导致减少支架的机械强度(42,43]。机械强度下降的速度主要取决于生理状态、机械环境,植入网站,支架结构。ECM包括胶原纤维和蛋白聚糖可能产生的渗透细胞,使机械强度降低由于退化。意味着破坏载荷和刚度的S / C组大于那些年代组在术后4和16周。没有显著的区别这两个可能是由于小样本维度。

本研究的一个限制是,我们没有量化的bmsc silk-collagen支架植入,和最优数量的植入细胞仍然是未知的。此外,播种bmsc没有标签和跟踪,代表另一个限制。尽管bmsc播种支架保持着良好的体外细胞形态学,关节腔和骨隧道的环境不同于培养皿中。在先前的研究中,自体bmsc与慢病毒载体转染表达增强型绿色荧光蛋白(Lv-eGFP)被播种在脱细胞semitendinous ACL重建肌腱移植物(44]。eGFP-positive细胞可以在术后12周观察;虽然,eGFP-positive在第12周的细胞数量明显低于在星期4。本研究的结论是基于细胞浸润和tenascin-C沉积和graft-bone治疗观察组织学检查。需要更多的数据来证实移植细胞的命运在未来的研究。

5。结论

bmsc可以促进韧带再生腔和graft-bone界面骨整合。Silk-collagen脚手架和bmsc很可能为今后临床实践相结合。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Fanggang Bi的构思和设计实验。Fanggang Bi,杨地陈、刘琪和朱文昊胡锦涛进行实验。陈Fanggang Bi和杨地分析数据。科田贡献试剂/材料/分析工具。Fanggang Bi手稿写道:。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是由河南的基础教育委员会(19 a320011)和河南省科学技术厅重点项目- 2020 (22170139)。

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