探索电动汽车从祖细胞的趋化作用人群人类脱落的乳牙促进迁移的天真bmsc骨修复过程

文摘

天真的动员骨髓间充质基质细胞(bmsc)是理想的骨再生的关键在骨科和牙科上下文。在这样的条件下,间叶细胞祖细胞的数量由人类脱落乳牙(棚)存在有利的多功能特性与简单的可访问性使得他们一个很好的候选人在骨和牙周组织再生。细胞外囊泡(EVs)是一个功能膜结构可以参与多种细胞相互作用和模仿父母细胞主要的生物功能。评估其能力动员天真bmsc在骨修复过程中,Nanosight跟踪分析(NTA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行说明的成分和功能内容EV样本来自棚屋与不同培养时间(24小时、48小时和72小时)。后来,Boyden室试验进行比较他们的动员天真的bmsc的能力。单向方差分析(方差分析),事后土耳其测试进行了统计分析。SHEDs-derived EVs收集24 h, 48 h, h和72的时间点,即EV24, EV48, EV72,主要是分泌液和倾向于改革成更小的尺寸结果NTA声波降解法表示的结果。此外,不同的EV组被发现与多种生长因子包括丰富的转化生长因子-β1 (TGF -β1),血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和纤维母细胞生长因子2 (FGF-2)考虑到通过ELISA检测。Boyden室化验隐含bmsc的迁移效率驱动电动汽车以不同的浓度。然而,结果表明,迁移的bmsc由不同的EV组无统计学意义甚至包含趋化因子( )。综上所述,这些数据表明,EVs源自棚屋中分泌功能形式和动员天真的bmsc的潜力,可以提出他们的相关性在协助骨再生。

1。介绍

骨质疏松面临众多的挑战在患病的情况下骨科和牙科上下文。被公认为“黄金标准”自体治疗骨缺损;然而,骨收获量在很大程度上是有限的,施主能级发病率也报道(1,2]。在口腔组织损失情况下,牙假体和植入物只能缓解临床症状,但不影响骨骼和周围组织的损失。自然骨修复组织良好的过程,大量的分子信号精确控制。当发生骨折时,一系列的功能因素,包括血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1 (TGF -β1),胰岛素样生长因子(igf)和纤维母细胞生长因子2 (FGF-2)释放到细胞外空间裂缝部位(3- - - - - -5]。这些因素共同协调动员骨髓基质细胞(bmsc),随后增殖并分化为成骨细胞,促进新骨形成。干细胞移植已被证明是有效的促进骨的再生潜力的骨折不愈合骨折(6]。然而,干细胞移植提出警告,如免疫抑制和消耗的氧气和营养的微环境使其严厉的天真的祖细胞迁移到受伤部位(7]。因此,动员天真的间充质基质细胞(msc)针对损伤部位将救援居民bmsc的不足,促进骨修复(8- - - - - -10]。bmsc是公认的多功能细胞,修复性能依赖于动员和迁移到目标站点(11]。它们在组织再生中的作用依赖于旁分泌效果和定向分化,这是依赖于针对迁移有关组织的网站。已经注意到骨骨髓来源多能祖细胞可以产生治疗效果以旁分泌的方式通过分泌的因素,而不是嫁接或微分(12]。

关于因子分泌,细胞外囊泡(EVs)目前正在关注他们在货物运输中发挥作用的蛋白质和核酸,即细胞信使在生物过程。电动汽车作为异构现有人口特征可作为液(30 - 100 nm),微泡(100 - 1000海里),和凋亡(50 nm-2尸体μ米)根据大小和功能根据国际社会定义的细胞外囊泡13]。研究表明,电动汽车都涉及生理和病理过程,包括刺激特定和非特异性免疫反应14),抑制肿瘤的生长15),或药物输送16]。外生EVs源自bmsc可以被内源性内化骨骼细胞,从而启动骨祖细胞的分化(17]。结合三维(3 d)支架,电动汽车已经应用于大规模骨骨修复工程缺陷。据报道,工程3 d聚乳酸(PLA)支架结合人类牙龈干细胞和电动汽车可能产生增强骨骼和细胞外基质的形成(18),这暗示,电动汽车可以促进骨修复微环境中通过内化和运输功能货物。电动汽车也被称为功能与性能的模仿父母细胞囊泡(7]。oral-derived干细胞显示新兴利益与简单的可访问性和多分化干细胞疗法属性,间叶细胞祖细胞数量由人类脱落乳牙(棚)被认为是多功能干细胞成骨和牙原性的潜力,这可能是电动汽车的一个重要来源,物流可以通过一个无痛技术,方便与更大的增殖能力与牙髓干细胞(DPSCs)相比,这是有利于修复骨和牙周组织(19]。

虽然这些报告显示潜在的EVs协助驾驶成骨的过程,知识在骨修复的机制的角色目前有限的。因此,我们旨在探索电动汽车的潜在作用来源于棚屋在动员bmsc通过检测化学引诱物因素在电动汽车和电动汽车产生的迁移效率。零假设国家电动汽车无法影响bmsc的迁移。确认化学引诱物的作用这些电动汽车可能会进一步展示他们在骨修复过程中的作用,并可能被用来缓解与现有的治疗药物相关的临床意义。

2。材料和方法

2.1。EV-Depleted介质生成和细胞培养

棚屋是一个慷慨的礼物BioEden(美国TX BioEden)。细胞培养基是一个EV-depleted一般介质,由间充质干细胞基础媒体(英国Lonza)补充EV-depleted 15%胎牛血清(的边后卫)(英国表达载体),1% L-ascorbate 2-phosphate (Sigma-Aldrich,普尔,英国),1%谷酰胺(表达载体、英国),1% Antibiotic-Antimycotic(英国表达载体)。的边后卫灭活在59.5°C为30分钟,其次是超速离心法在100000 g 18 h在4°C(英国Sorvall发现100 se)和过滤得到的上层清液通过0.2μ米耐尔根™快速流动™过滤器(热费希尔科学、英国)获得EV-depleted的边后卫。解冻后,棚屋被播种到T175培养瓶(Sarstedt、德国)10000细胞/厘米²和孵化37°C,在5%的股份有限公司₂和95%的湿度,介质变化每2 - 3天完成。

2.2。EV条件培养液(CM)集合

当达到了80% - -90% confluency、文化媒体吸气,取而代之的是20毫升新鲜培养基。收集后,培养基后24 h, 48 h,和72 h,这被认为是细胞外泡文化传媒(EVCM)。每组三个烧瓶EVCM收集。EVCM经历了连续离心上清液净化的过程EVs(5分钟400克、2000克15分钟,30分钟,10000克和100000克90分钟)。最后离心后的EV颗粒一步是resuspended 5毫升的MEM(含有核糖核苷和脱氧核苷(英国)热费希尔科学)分析和利用之前在这项研究中,与电动汽车收集后24 h, 48 h, EV24 72 h表示,EV48和EV72分别。最后的上层清液离心步骤每个EV组保留分析和被称为最高分数(TF)。EVs和TFs进一步分析之前储存在-80°C。

2.3。EV声波降解法

1毫升每个EV组保持在冰和用(美国布兰森超声学)最大强度为5 s,三次,每隔5 s。电动汽车与不同的文化乘以声波降解法后表示EV24所以,EV48如此,EV72。

2.4。纳米粒子跟踪分析(NTA)

纳米颗粒分析系统(NanoSight LM10 HS显微镜,NanoSight有限公司处,英国)被用来分析丰富和电动汽车的大小根据先前描述的协议(20.,21),纠正与αmem(热费希尔科学、英国)作为参考稀释剂。样本解冻的稀释和去离子的蒸馏水稀释1:100年之间达到一个近似浓度10⁶和109个粒子/毫升)进行分析。粒子被发现使用638 nm激光,6执行复制/分析组。分析了电动汽车使用纳米粒子跟踪分析2.3分析软件。

2.5。趋化因子检测

2.5.1。酶联免疫吸附试验(ELISA)

生长因子被发现在电动车样品通过商用设备,制造商的协议:人类TGF -β1白金酶联免疫试剂盒(英国eBioscience);PDGF-BB并使用各自的人类FGF-2迷你ELISA试剂盒(英国PeproTech);人类igf - 1 Quantikine®酶联免疫试剂盒(英国研发系统)。化验在重复进行三次。

2.5.2。伴着文化和纤连蛋白的选择

bmsc是商业上获得(英国Lonza)和fibronectin-adherent bmsc (FNA-BMSCs)被李获得如前所述et al。22]。FNA-BMSCs被镀成组织培养瓶(Sarstedt、德国)5000细胞/厘米²在基础培养基αmem补充10%的边后卫,1% L-ascorbate 2-phosphate (Sigma-Aldrich,普尔,英国),和1% Antibiotic-Antimycotic(英国表达载体)。FNA-BMSCs培养在37°C, 5%的公司₂与媒体改变了每2 - 3天。

2.5.3。细胞迁移试验

潜在的SHED-derived EVs刺激迁移FNA-BMSCs使用Boyden室试验进行,如前所述[23]。电动汽车集中与TGF -的浓度β1在0.1μ克/毫升的软化牙本质矩阵(DDM),已被证明能够有效地刺激FNA-BMSC迁移(23),表示1 x。低十倍浓度也使用(0.1 x)表示。分析进行了一式三份和三次。

2.6。统计分析

所有化验上面执行,一式三份样本分析每个样本组(除非另有提到),和化验重复三次。统计分析来确定样本之间的方差分析组由单向方差分析与事后图基测试使用GraphPad棱镜8软件(美国GraphPad拉霍亚,CA)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。使用NTA EV分析

NTA进行分析粒度和浓度20.]。数据1(一)和1 (b)说明粒子的浓度和粒度,纠正EV-depleted媒体在所有组。所有电动汽车群体表现出相对粒子浓度。此外,颗粒大小的所有团体仅限于1000海里,匹配粒度组成的电动汽车(24]。对于unsonicated (EV)和用()组,最高浓度的颗粒被EV72, EV72组。峰浓度在每组不同粒径的粒子。颗粒大小的主要群体是在50到120纳米(25),是指外来体大小。这个概要文件为每个时间点大小分布是不同的。EV组,粒子浓度在150 - 180年达到高峰EV24纳米,而EV48和EV72达到250 - 280和210 - 230 nm,分别。所以组织,改变了粒子的分布结果的声波降解法EV组,在粒子数的大小超过300海里减少而与100 nm和300 nm之间的大小增加。

3.2。趋化因子量化使用ELISA

趋化因子浓度的EV样本化验ELISA声波降解法后,为了释放货物分析。数据2(一个)- - - - - -2 (d)显示不同浓度的TGF -β1,igf - 1、FGF-2 PDGF-BB包含在EV24, EV48, EV72组。相对于mem浓度被纠正。TGF -β1,图2(一个)显示最高浓度出现在EV48 2556 pg / 10³粒子,明显高于EV24和EV72样本( )。TGF -没有显著差异β1 EV24和EV72样本之间的浓度( )。igf - 1、图2 (b)表明EV24 igf - 1和EV48包含略高于EV72 EV24之间没有明显差异的地方集中,EV48,电动车72组( )。PDGF-BB EV24 (79 pg / 10³粒子)和EV48 (48 pg / 10³粒子)浓度组都表现出显著大于EV72 (8 pg / 10³粒子)( )。然而,EV24之间没有观察不同浓度和EV48组( )(图2 (c))。FGF-2,最高浓度(90 pg / 10³粒子)出现在EV24样本,明显高于EV48和EV72样本( )(图2 (d))。没有显著差异FGF-2 EV48和EV72样本之间的浓度( )。

3.3。细胞迁移分析

Boyden室进行化验检测的迁移潜力FNA-BMSCs由unsonicated和用电动车,基于1和0.1 x TGF -的浓度β1 BMSC移植所需(15.6 pg / mL和1.56 pg / mL,分别),正如前面演示(23]。EV组稀释成1和0.1 x有或没有在EV24声波降解法,EV48, EV72组。无血清媒体作为消极的控制。图3显示了不同荧光信号,仿佛通过collagen-coated膜细胞迁移的相对数量。通过对比发现了不同的迁徙活动迁移相对于消极的控制。团体之间的迁移效率略提高了电动汽车驱动控制相比,但它不是统计学意义( )。所以组织证实趋化现象的效果略优于EV24 unsonicated团体(0.1 x)或没有(1 x)稀释,而电动汽车没有稀释(1 x)显示略好趋化现象的效率对FNA-BMSCs EV48和EV72团体。

4所示。讨论

电动汽车已被描述为重要介质在关键功能和生物过程在疾病上下文或组织修复细胞(26,27]。鉴于模仿父母的财产细胞(28),应考虑电动汽车的起源。在牙周维修情况下,棚屋以前探索骨和牙周组织修复能力。体外模型,在一个棚屋呈现巨大的生物反应包括细胞生存能力和形态在丝素蛋白支架29日),为组织工程准备了一个有前途的候选人。在骨缺损模型,SHED-derived条件媒体(SHED-CM)和棚屋被移植到缺陷区域和成骨的结果进行了比较。SHED-CM显示更好的骨再生结果与改善骨矿化和血管生成潜力(30.]。多种细胞因子也发现,旨在阐明SHED-CM中包含的功能因素。据报道,在骨形成protein-2 SHED-CM充足(BMP-2) BMP-4, osteoprotegerin(功能),提出了一个抗炎的表现(30.,31日),这表明了作为一个有前途的候选人有利于成骨以旁分泌的方式。

动员bmsc的目标站点提供了一个关键的角色在骨修复,在目前的研究中,我们希望说明SHED-derived EVs执行驾驶天真MSC迁移执行一系列的检测。NTA结果提供了一个整体组成的SHED-derived电动汽车的数量和大小。大多数电动汽车在直径50 - 200纳米,表明SHED-derived电动车主要是液分泌。NTA结果还提供信息关于声波降解法影响电动汽车作为电动汽车膜囊泡释放内容需要中断。声波降解法执行,平均粒径减少,粒子表现出广泛的粒度分布。这种方法导致内容发布的电动汽车也提到了Haque et al。32]。建议不同类型和洗涤剂的浓度会导致低破坏和改革的粒子32];因此,声波降解法应用于干扰EVs在这项研究。

SHED-derived电动汽车检测趋化现象的能力,趋化因子EV组进行调查。这是承认TGF -β1是最重要的一个因素驱动MSC移植以及igf - 1 (4,33]。这两个因素是所有电动汽车群体在我们的研究中发现的。此外,PDGF-BB的浓度和FGF-2也发现大多在EV24集团相比EV48和EV72组。随着培养时间的增加,电动汽车进行了后续吸收可能引发了其生长因子的浓度减少EV48和EV72团体(13]。作为电动汽车的潜在推动MSC移植已经提到在骨修复和伤口愈合的情况(34,35),细胞迁移实验进行,以确定对bmsc SHED-derived电动汽车的趋化现象的能力。EV24集团在我们的研究中,显示轻微的但不是潜在的符合他们明显不同的趋化作用更广泛的组成内容,与生长因子EV24丰富更多的多样性。然而,msc的招聘是组织根据化验中没有明显不同。这表明,趋化因子包含在电动汽车仍不足以驱动迁移在我们的研究中。根据之前的工作由我们小组,迁移过程可能是由DDM有生物活性的内容,这也证实,msc的迁徙过程需要合作工作的多种因素(23]。在我们之前的研究中,DDM的0.1μ克/毫升浓度诱导更好的细胞迁移相比高出10或100 x浓度(23),使电动汽车需要优化更有效浓度,并在未来的工作可能是一个潜在的途径调查。另一个潜在的解释是,额外的矩阵组件在DDM的存在,可能不会出现在电动汽车,增强迁徙潜在可比的趋化因子浓度(23]。同时,建议msc更有可能迁移之外的刺激呈现时处于静止状态(36]。事实上,动员骨髓间充质目标网站,更天真的丰富的努力在过去。回顾,多个msc在体外的化学引诱物参与招聘37]。另一方面,据报道,梯度建立试验的敏感性会太小,不足以驱动明显迁移性能(34]。msc的迁移能力也不同属性包括干细胞衰老和当地条件干细胞利基(38]。在这些方面,建立了化验检测电动汽车的趋化作用来源于棚屋应该浓度的优化方面,配合其他化学引诱物,并通过综合使用,也是本研究的局限性。尽管EVs携带功能货物在我们的分析中,他们如何与细胞在骨修复体内微环境仍然需要进一步检测。

SHED-derived EVs丰富液含有各种货物包括趋化因子,引起驱动细胞迁移的可能性。这提供了一个机会SHED-derived EVs动员更多的祖细胞在骨修复上下文中,和努力可以促进骨愈合过程通过刺激分泌的EV货物,电动汽车可以作为治疗目的的工具(39]。即使这些因素似乎不足以驱动的天真的bmsc移植可能是因为多种生长因子的数量将集体调解细胞迁移。综上所述,我们的研究结果说明了电动汽车的潜力起源于棚屋bmsc作为引诱剂,由异构明显生长因子包含而理想浓度的电动汽车在未来仍然需要优化,特别是在与其他成分可能是也可能不是在电动汽车货物,影响趋化因子的生物效应。

总的来说,我们的工作有助于更好地理解动员bmsc在临床的交互上下文和电动汽车从天真的棚屋骨修复微环境可能为阻碍了骨修复提供新的治疗方案。

数据可用性

底层的数据都可以在请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢迈克Byrom补充道:博士,BioEden,奥斯汀,得克萨斯州,美国提供了细胞的细胞银行处理和存储设施。

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