持续抑制声波刺猬信号导致人为多能干细胞分化为功能性胰岛素生产β细胞

文摘

人类多能干细胞——(iPSC)派生的胰岛素生产细胞(ipc)可用于胰岛细胞移植为1型糖尿病患者和小说发展的特定的细胞抗糖尿病的药物。然而,需要一个方法来生成功能由万能干细胞ipc和简化协议。我们比较组合的小分子可以诱导细胞分化成一个明确的内胚层和优先胰岛细胞前体。当使用小分子的最佳组合,生成IPCs分泌胰岛素对葡萄糖刺激的反应。我们构造的球体ipc和优化文化和成熟条件。定量PCR显示明确的表达endoderm-specific标记不同取决于小分子的结合。小分子,N - [(3 5-dimethyl-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl)亚甲基]4 - (phenylmethyl) 1-piperazinamine,诱导分化的细胞功能ipc通过抑制声波刺猬信号。的2 d图像文化表明IPCs形成球状体从第五天,不断分泌胰岛素。我们开发了一个简单的区分方法使用小分子产生功能性ipc对葡萄糖刺激在相对较短的时间内。我们认为这种方法以及进一步分化过程的细化可以应用到文化IPCs可用于临床试验。

1。介绍

胰岛素生产细胞(ipc)来自人类胚胎干细胞(ESCs)或人为多能干细胞(万能)不仅可以用于移植胰岛细胞,由患者自身免疫破坏1型糖尿病,而且对确定发展的新靶点抗糖尿病的药物体外。几项研究已经分化ipc的ESCs或万能(1- - - - - -5)通过模仿胰腺癌发展,已经建立了一个分段协议(3,4,6- - - - - -8]。这个协议需要添加各种因素文化媒体在每个阶段的胰腺分化,诱导特定于每个阶段的转录因子。小分子是受欢迎的分化诱导,ipc以这种方式生成的功能是健壮的体内和体外9- - - - - -12]。

许多小分子已确定可以应用体外和体内干细胞生长13- - - - - -15),直接分化(10,11,16- - - - - -18),重新编程体细胞进入更幼稚的状态(19]。这些分子也提供有用信息的信号和分化机制调节干细胞生物学。具有独特生物活性的小分子启用新的生物方法的建立和新疗法的发展,大幅度地降低了生产成本。因此,我们利用这些小分子IPC差异化的优势。我们筛选小分子诱导和调节干细胞的分化成胰腺祖细胞。其中包括dorsomorphin(金龟子),骨形成蛋白(BMP)信号的选择性抑制剂(9,20.];转化生长因子抑制剂——SB431542βI型受体/ ALK5 [9,21,22];N - [(3 5-dimethyl-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl)亚甲基]4 - (phenylmethyl) 1-piperazinamine (SANT-1)抑制剂的声波刺猬信号(23- - - - - -26];FR180204 ATP-competitive抑制剂的细胞外signal-related激酶1 (ERK1)和ERK2 [20.,27),和视黄酸28- - - - - -30.]。我们开发功能性IPCs分泌胰岛素响应葡萄糖与这些小分子相结合。

虽然ESC -或iPSC-derived ipc与功能类似天然胰岛细胞生成,他们不分泌胰岛素响应葡萄糖(5,20.,24]。这是因为在体外分化和文化条件不准确地模拟自然人类胰腺癌的发展阶段。因此,尽管结合differentiation-inducing因素是很重要的,在文化生产这些细胞的方法也必须得到改善。

我们开发了一个简单、高效的逐步协议由万能干细胞生成IPCs使用SANT-1和FR180204。我们诱导分化的细胞则明确的内胚层,胰腺祖细胞,最后,ipc。此外,功能性IPCs不断培养和成熟达到一个球体形态类似于自然的胰岛细胞。

2。材料和方法

2.1。小分子

几个小分子化合物,抑制细胞信号通路已经被应用于区分万能ipc。我们将分化过程分为三个步骤来模仿胚胎胰腺发育的过程中,也就是说,最终内胚层的形成,其分化成胰腺内胚层和胰腺祖细胞,和细胞分化的具体感应到ipc。小分子在每一步处理,结果被证实通过比较和分析这些代理(表相结合的影响1)。

2.2。细胞培养

提供的万能干细胞研究中心峨山研究所(首尔,韩国)与基本保持在evitronectin-coated菜肴8™基础培养基(美国马里兰州盖瑟斯堡Gibco实验室,)。向最终内胚层分化,细胞分散与TrypLE™表达酶(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国),然后 细胞/ mL被播种在基本8™基础培养基与10毫米Y27632 (Selleck化学品,休斯顿,德克萨斯州,美国)。媒介改变了24 h后基本没有Y27632 8™基底介质。我们培养细胞则在1640年RPMI介质(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)含1% B27™补充(-胰岛素,英杰公司)有或没有人类苯丙酸诺龙(100 ng / mL) (PeproTech落基山,新泽西),3μM CHIR99021 (Sigma-Aldrich Corp .,圣路易斯,密苏里州,美国),和5μ24 h M LY294002 (Sigma-Aldrich corp .),其次是RPMI 1640中包含1% B27与苯丙酸诺龙(100 ng / mL) 48 h。随后被孵化的细胞则在改善MEM培养基锌选项(表达载体)含1% B27与1μM金龟子(Sigma-Aldrich corp .) 4μM RA, 10μM SB431542 (Tocris生物科学,英国布里斯托尔),有或没有FGF2 (50 ng / mL, PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国),3μ0.25 M FR180204,μM SANT-1(来自Sigma-Aldrich corp .)胰腺祖细胞分化。细胞被培养在6 d differentiation-inducing媒介,媒介是每天变化。最后,分化成ipc, 10μM每个forskolin()、地塞米松(敏捷),和烟酰胺(Nic)(从Sigma-Aldrich corp .)添加到培养基中,细胞可以分化为10 d。

2.3。畸胎瘤的分析

则是收获和离解成单细胞悬TrypLE™表达(Gibco) 细胞皮下注射背到老鼠8-week-old重度联合免疫缺陷症。老鼠保持在非特异性无菌(SFP)条件在峨山研究所实验动物设施,并达到肿瘤后安乐死> 1厘米³,或者一个观察期后40 d。包含肿瘤组织和4%多聚甲醛固定(PFA)嵌入在石蜡,切成系列4μ米的部分。部分被苏木精和伊红染色,显微组织学分析。

2.4。疣状

细胞被固定为4% PFA在室温下30分钟(RT),然后洗了三次磷酸盐(PBS)。0.1%的细胞被permeabilized Triton x - 100 5分钟,然后用PBS洗。非特异性蛋白质绑定被孵化的细胞与正常马血清(1:30)30分钟。此后,这些细胞被孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:兔子anti-Oct4,稀释1:50;鼠标anti-Nanog,稀释1:200;兔子anti-Sox2,稀释1:1000;鼠标anti-SSEA4,稀释1:200;鼠标anti-FoxA2,稀释1:100;山羊anti-CXCR4,稀释1:300;山羊anti-Pdx1稀释1:10000(从Abcam Plc。英国,剑桥); mouse anti-insulin, diluted 1 : 200; and rabbit anti-glucagon, diluted 1 : 200 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA). The cells were washed with PBS, then incubated with Alexa Fluor 488- or 594-conjugated donkey or goat antibodies directed against rabbit, goat, or mouse IgG at a 1 : 250 dilution at RT for 1 h. Nucleotides were stained with Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc.).

2.5。定量实时逆转录聚合酶链反应

总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体),然后使用上标三世第一链合成第一链cDNA reverse-transcribed SuperMix(英杰公司)与RNA数量完整性的9到10。mRNA转录水平相对于18岁的RNA测定使用预拌SsoAdvanced™普遍SYBR®绿色Supermix (Bio-Rad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)和特定的引物。分析了样品一式两份,和值是平均的。正向和反向引物序列如下(5 3 ):Sox17, CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG;FoxA2, ACTGGAGCAGCTACTTAGCAGAGC TCATGGAGTTCATGTTGGCGTAG;趋化因子受体CXCR4, GGTGGTCTATGTTGGCGTCT TGGAGTGTGACAGCTTGGAG;Pdx1, GCATCCCAGGTCTGTCTTCT ATCCCACTGCCAGAAAGGTT;Ngn3, CTTGCTGCTCAGGAAATCCC CTTCTGGTCGCCAAGTTCAG;Nkx6.1, CGTTGGGGATGACAGAGAGT TGGGATCCAGAGGCTTATTG;Sox9、TACGACTACACCGACCACCA TCAAGGTCGAGTGAGCTGTG;NeuroD, GCCGACGGAGATTAGGAGAA TCTTGTCCTGACACTGGCAT;胰岛素,ATCCTGGATCTCAGCTCCCT CTCACAGCCCTTCAGAGAC;胰高血糖素,ATTGCTTGGCTGGTGAAAGG TATAAAGTCCCTGGCGGCAA; 18S RNA, GAGCCTGCGGCTTAATTTGA and AACTAAGAACGGCCATGCAC-3. The PCR amplification protocol comprised 45 cycles of 20 s at 98°C, 20 s at 55°C, and 20 s at 72°C. Relative levels of gene mRNA transcripts to that of 18S RNA were analyzed using the 2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。

2.6。胰岛素释放试验

分化细胞在孵化Krebs-Ringer碳酸氢盐玫瑰NaHCO缓冲区(115毫米氯化钠,24毫米₃氯化钾、5毫米,2.5毫米CaCl₂,1.2毫米KH₂阿宝₄,1.2毫米MgSO₄和25毫米玫瑰)含0.5% BSA和没有葡萄糖在37°C 2 h。细胞被顺序孵化与2.8,20日和30毫米葡萄糖和30毫米KCl-Krebs缓冲区1 h。胰岛素分泌柠檬酸缓冲和样品differentiation-induced媒体测量使用胰岛素ELISA试剂盒(美国NH ALPCO,萨勒姆)。

2.7。流式细胞术

使用Accutase分化细胞被分离成单个细胞,固定与4% PFA和permeabilized烫缓冲III (BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。细胞被孵化与普通马血清10分钟,其次是鼠标anti-insulin,兔子anti-glucagon,和兔子anti-Ngn3抗体为30分钟RT,这些细胞被沾Alexa萤石488 -共轭驴抗体针对鼠标或兔免疫球蛋白在RT为30分钟,然后荧光发射测量通过流式细胞术使用FACSAria II(正)。

2.8。统计分析

标准偏差使用双尾未配对学生的决心 - - - - - -测试。多个比较进行评估,使用双向方差分析,包括计算和意义值。所有数据进行统计分析使用棱镜版本8 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。值和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述的万能

我们培养细胞则在vitronectin-coated文化菜没有支线细胞。我们发现殖民地的体外细胞则可能保持稳定(图2周1(一))。特定的核标记细胞则,即homeodomain POU家族的转录因子,Oct4(图1 (b)),Nanog(图1 (c)),和Sox2(图1 (d)疣状),被确定的未分化细胞。我们还发现SSEA4,万能的细胞表面标记代表(图1 (e))。我们检查了使用畸胎瘤分析万能干细胞的多能性。的万能干细胞移植到小鼠生长成一团的组织了40 d,然后各种组织的集群出现在肿瘤表面(图1 (f))。部分群众固体的组织学变化,代表内胚层、外胚层和中胚层组织被确定。这些特征证实了万能干细胞是多能,有可能分化成ipc。

3.2。iPSC诱导分化成一个明确的使用小分子内胚层

我们研究了小分子能够区分则变成一个明确的内胚层(图2(一个))。我们比较的分化效率CHIR99021和LY294002基于激活素浓度(图2 (b))在第一天的3 d的诱导期。免疫染色显示细胞表达更加丰富FoxA2(图2 (c)),以及更多的细胞表达趋化因子受体CXCR4在孵化CHIR99021和LY294002比单独(图2 (d))。qPCR显示的结果略小于FoxA2表达细胞孵化与化合物比CHIR99021孤单。更多Sox17和趋化因子受体CXCR4表达的细胞孵化与化合物(图2 (e))。这些发现表明,CHIR99021和LY294002诱导分化的细胞则变成一个明确的内胚层更有效地比单独的使用。

3.3。诱导分化的细胞则为IPCs使用小分子的组合

虽然万能干细胞分化成一个明确的内胚层,他们保留了内部分化为中胚层和外胚层的细胞的能力。因此,我们利用小分子抑制所有信号通过细胞分化途径,除了胰腺祖细胞(图2(一个))。我们比较小分子的影响,可以抑制细胞的分化成肝祖细胞。我们孵化differentiation-inducing媒体包含金龟子和SB431542抑制细胞分化成外胚层和中胚层细胞,分别比较细胞与纤维母细胞生长因子2 (FGF2)孵化,ERK信号传导抑制剂FR180204,刺猬信号传导抑制剂SANT-1引起细胞的分化成成熟的胰腺祖细胞。日-培养细胞的形态不同根据诱导分化的条件。一般来说,所有条件诱导激烈的细胞生长,导致较高的细胞密度。然而,细胞的形态和增长率没有显著差异(图3(一个))。因此,我们分析转录因子的表达胰腺祖细胞的特征,Pdx1, Ngn3, Nkx6.1 Sox9, NeuroD,在所有条件。的整体表达的转录因子高于基本分化因素组1。然而,每个转录因子的表达显著增加在4和6组孵化SANT-1相比其他组(图中的每个转录因子3 (b))。这些结果表明,抑制刺猬信号通过特定的途径导致一个更有效的分化成胰腺祖细胞。

分化后胰腺祖细胞诱导在步骤2的情况下,我们同样诱导分化成IPCs超过8天包含敏捷的培养基,网卡,(图4(一))。然后我们使用qPCR分析胰岛素和胰高血糖素的基因表达,这是代表成熟的胰岛细胞激素和转录因子,Pdx1, Nkx6.1。所有组中的每个标记的平均表达倾向于增加与第1组,但没有达到统计学意义。然而,基因表达显著增加在4和6组孵化SANT-1与第1组相比,从而确认所有组(图的统计学意义4 (b))。组6,相对比其他群体更完整的分化是由免疫染色和流式细胞术分析。细胞表达胰岛素和胰高血糖素是分散在细胞组6。此外,分化发生在小群体而不是在大型集群(图4 (c))。在大多数组织细胞表达Pdx1被确定,但很少在细胞表达胰岛素(图4 (d))。流式细胞术结果显示,大约38%的分化细胞表达胰岛素,胰高糖素和23%表达。胰岛细胞最重要的转录因子,Ngn3,表示在大约66%的分化细胞(图4 (e))。这些结果表明,一些细胞可以直接分化成胰岛细胞即使在存在大量的胰岛祖细胞表达Pdx1 Ngn3。因此,分化条件可以改善提高分化效率。

3.4。差异化IPCs分泌胰岛素的能力

我们量化IPCs基于组合的分化诱导因子和确定glucose-regulated功能ipc质量的变化。分析了自发分泌胰岛素的浓度培养基分化为成熟ipc的第五天。所有组分泌胰岛素,但数量没有显著不同的组织(图5(一个))。胰岛素浓度大约在8天15倍高于所有组的第五天。特别是SANT-1-treated组4和6显示胰岛素浓度高于其他组,和浓度的增加没有明显其他组(图中不同5 (b))。Forskolin是腺苷酸环化酶激活,参与在IPC分化细胞的活力和增长,但也会使成熟的胰腺细胞释放更多的胰岛素。因此,我们培养的细胞为另一个4 d后删除,然后在媒体上测量胰岛素浓度。胰岛素浓度下降和略减少细胞倍没有孵化SANT-1,分别(图5 (c))。

我们还确定葡萄糖能否刺激分化IPCs分泌胰岛素。组1没有桑特显示胰岛素浓度的增加在中氯化钾添加在分化时,但没有明显的分泌物基于葡萄糖浓度观察(图5 (d))。然而,该集团与桑特显示增加胰岛素分泌,以应对高浓度的葡萄糖(数字5 (e)和5 (f))。总体而言,高水平的自然控制胰岛素分泌胰岛素的能力利用葡萄糖明显只有在集团与SANT-1孵化抑制刺猬信号机制。这些结果表明抑制刺猬信号传导过程中起着重要作用则分化成成熟的胰岛细胞。

3.5。IPC文化创建细胞类似于胰岛细胞

我们区分ipc在2 d使用小分子附着文化和试图培养球体的ipc与天然胰岛细胞相似。10 d后分化的步骤3中,细胞分离、细胞密度高。小细胞聚集形成的第一天,小球体的第五天(图上形成统一的大小6(a))。球体IPC集群的协调、连贯和表达胰岛素和胰高血糖素(图6(b))。我们确认的球体形态和基础胰岛素分泌能力IPCs可以保持在长期文化体外体内移植前。

球体ipc是任何文化条件下保持相当大的一段。然而,他们分泌胰岛素的能力逐渐降低孵化时没有的边后卫的分化诱导培养基。

基底c -肽分泌很低但显著减少11天当被撤的分化诱导介质。同样,1066年CMRL c -肽分泌胰岛细胞培养介质较低,比,但对7 d(图保持稳定6(c))。我们建议最优培养条件球体ipc组成CMRL 1066中7 d的使用,维护稳定培养正常胰岛细胞体外超出7 d是很困难的。

4所示。讨论

ESCs的相同的方法已经应用于区分,则在大多数胰岛素生产细胞的研究。这是因为,尽管他们被RNA-based病毒诱导分化,万能ESCs的分化能力一样。然而,则可以避免ESCs的伦理问题参与收集和很容易从成人细胞产生。然而,ESCs和后仍未分化的细胞则分化过程构成的风险如果移植肿瘤形成。这个问题可以解决使用成人msc,但他们分化成靶细胞分化能力有限。因此,删除未分化细胞的方法防止肿瘤形成具有重要的意义和阻止移植细胞生长的封装正在接受调查。因此,许多其他的研究旨在安全地移植体内的细胞则。

我们只是万能干细胞分化成IPCs使用小分子抑制分化途径除ipc。我们结合小分子,以确保对ipc万能的自然分化。

我们每个GSK3相结合β特殊技能抑制剂CHIR99021 [20.)和磷酸肌醇3-kinase抑制剂LY294002激活素诱导分化的细胞则明确的内胚层。稍微FoxA2表达集团与CHIR99021诱导和激活素a .然而,其他特定标记的表达式的结果表明,添加LY294002会更有效。胰腺祖细胞诱导了孵化的内胚层FGF家人,RA和金龟子。因此,我们调查了IPC分化是否更有效与FR180204孵化后,ERK1 ATP-competitive抑制剂、ERK2 [20.,27]和SANT-1 [23,24),抑制分化成肝细胞前体细胞(23- - - - - -26]。研究结果表明,SANT-1和FR180204增加万能干细胞的诱导分化成ipc,培养基中的胰岛素水平增加,生产功能性ipc对葡萄糖。

许多研究从干细胞研究胰岛素生产细胞的生成。然而,胰岛素分泌、线粒体代谢和特定基因表达的成人胰岛细胞在胰岛素生产细胞来源于干细胞仍然不足。这个问题已经被区分细胞更好的克服胰岛素生产能力利用PCL / PVA nanofibrous支架和collagen-coated,实际上电纺polyethersulfone纳米纤维(31日,32]。更多样化的组合differentiation-inducing因素和信号传导抑制剂也被应用4,33]。因此,成熟的生产胰岛素生产细胞从一个复杂的观点,认为应该进一步研究环境和细胞信号转导,而不是集中在一个单一的分化诱导因素。在这里,我们描述了一个简单和有效的分化方法和一个重要的机制。

5。结论

我们呈现IPCs更多类似于培养他们获取天然胰岛细胞球体形态,因为2 d文化导致IPCs不分泌胰岛素对葡萄糖刺激的反应。我们应用小分子二维文化的组合诱导分化的细胞则成功能性IPCs响应葡萄糖;然而,进一步成熟和增长允许IPCs形成球状体,易于移植和posttransplantation可以生存。

我们建议诱导分化的细胞则为IPCs使用这种方法将适用于人类移植。则是维护和分化xeno-free矩阵vitronectin支持增长和人类万能干细胞无血清feeder-free条件下的分化。此外,我们使用小分子诱导分化,稳定,安全比蛋白生长因子,对大规模生产和经济足够了。

本研究分化为胰岛素生产细胞的细胞则使用一种新方法。然而,这些细胞没有成人胰岛细胞,一样的成熟和分化率很低。由成人胰岛细胞分泌胰岛素的数量根据葡萄糖浓度是最重要的。成熟阶段分化过程中需要进一步详细调查前细胞产生胰岛素的能力与成人胰岛细胞可以来源于干细胞。因此,我们计划研究胚胎胰腺发育识别关键要点成熟,适合在临床试验中的应用。

缩写

敏捷:	地塞米松
金龟子:	Dorsomorphin
ESCs:	人类胚胎干细胞
:	Forskolin
GSIS:	分子生物学胰岛素分泌
ipc:	胰岛素生产细胞
则:	人类多能干细胞
网卡:	烟酰胺PFA,多聚甲醛。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

人类则是来自汉族Choe(峨山研究所干细胞研究中心)的机构审查委员会批准下峨山医疗中心(韩国首尔)。伦理委员会的峨山医学院医学中心研究批准,进行据赫尔辛基宣言的原则(2013)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

SL,问,JYO、EHS和SCK概念化和设计研究,进行数据分析和解释,起草和批准。EJ IKS次方进行这项研究和批准。歌Lee Jae Hyun Joo)、云哦了同样的研究。

确认

这手稿发表在研究广场作为《提交评论过程中预印本版本。这个项目是使用提供的赠款资助NRF - 2017 r1f1a1071045 NRF - 2017 m3a9c6032060和联盟- 2015 k1a4a3046807韩国国家研究基金会(NRF)的项目。这项工作是支持的学生科研补助金(年)的韩国蔚山大学医学院,首尔,韩国。

引用

1. j . v . Schiesser s . j .失物,s·霍斯,a·g·Elefanty和e . g . Stanley”派生人类胰岛素生产细胞的多能干细胞,”糖尿病研究的回顾,11卷,不。1,6 - 18,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . g . Yabe福田,武田,k . Nashiro m .《下田,h . Okochi功能性胰腺的有效生成β从人类诱导多能干细胞的肽,”糖尿病杂志》,9卷,不。2、168 - 179年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 陆j .江m . Au k . et al .,“分泌胰岛素的胰岛代集群从人类胚胎干细胞”干细胞,25卷,不。8,1940 - 1953年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. d . Zhang w .江,m .刘et al .,“高效的人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的分化为成熟胰腺产生胰岛素的细胞,”细胞研究,19卷,不。4、429 - 438年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. w .江,y, d .赵等。”在体外推导从人类胚胎干细胞功能胰岛素生产细胞,”细胞研究,17卷,不。4、333 - 344年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. k . D, a . g .爆炸美国Eliazer et al .,“生产胰腺内分泌细胞hormone-expressing从人类胚胎干细胞”自然生物技术,24卷,不。11日,第1401 - 1392页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. e·克朗l·a·马丁森k Kadoya et al .,“胰腺内胚层来自人类胚胎干细胞生成glucose-responsive分泌细胞体内,”自然生物技术,26卷,不。4、443 - 452年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. h·戈夫b . Fishman, a . Ziskind m·舒尔曼和j . Itskovitz-Eldor“人类胚胎干细胞分化为胰岛素生产集群,”干细胞,22卷,不。3、265 - 274年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. y Kunisada: Tsubooka-Yamazoe、m . Shoji和m . Hosoya”小分子诱导有效的人类诱导多能干细胞分化为胰岛素生产细胞,”干细胞研究,8卷,不。2、274 - 284年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. s, m . Borowiak j·l·福克斯et al .,“人类的ESCs的小分子引导分化到胰腺血统,”化学生物学性质,5卷,不。4、258 - 265年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. m . Borowiak r . Maehr s . Chen等人“小分子有效地直接内胚层的老鼠和人类胚胎干细胞的分化,“细胞干细胞,4卷,不。4、348 - 358年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. m·p·查克a . m . Drozd e . Stoczynska-Fidelus p . Rieske和d . p . Grzela”定向分化的人类iPSC成胰岛素生产细胞是提高诱导表达PDX1 NKX6.1因素IPC祖细胞,”转化医学杂志》,14卷,不。1,p。341年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 票价,l . Rivest-Khan s·科恩,g .工作”“小分子调节正常和白血病干细胞,”目前在血液学的意见,22卷,不。4、309 - 316年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. y, w·李,t·劳伦和丁,“小分子,大角色——干细胞命运的化学处理和体细胞重编程”《细胞科学,卷125,不。23日,第5620 - 5609页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. j .山r·e·施瓦茨n t·罗斯et al .,“小分子的识别对人类肝细胞扩张和iPS分化,“化学生物学性质,9卷,不。8,514 - 520年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. f·斯,d .表象,y . c . (h . Yu,“成本效益hepatocyte-like细胞分化使用小分子,从人类多能干细胞”生物材料卷,70年,第125 - 115页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f . Osakada z . b .金y Hirami et al .,“视网膜细胞的体外分化人类由小分子诱导多能干细胞”《细胞科学,卷122,不。17日,第3179 - 3169页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. h . y . j . Liu Liu王et al .,“肝干细胞世行细胞直接分化为胰岛素生产细胞使用小分子,”科学报告,3卷,不。1,p。? ? ?,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. d . Huangfu k . Osafune r . Maehr et al .,“诱导多能干细胞从人类成纤维细胞只有主Oct4和Sox2”,自然生物技术,26卷,不。11日,第1275 - 1269页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 竹内h . n . Nakatsuji, h . Suemori”内胚层的人类多能干细胞的分化在3 dculture胰岛素生产细胞,”科学报告,27卷,不。4 p。4488年,2014年。视图:谷歌学术搜索
21. Dhawan s、e . Dirice r . n . Kulkarni和a . Bhushan抑制TGF -β信号促进人类胰腺癌β细胞复制。”糖尿病,卷65,不。5,1208 - 1218年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. j . du y, z Ai, x,和郭z l . Chen”机制的SB431542抑制小鼠胚胎干细胞分化,“细胞信号,26卷,不。10日,2107 - 2116年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m . c .我方f . Sarangi c·杨et al .,“有效的代NKX6-1 +从多个人类胰腺祖细胞多能性干细胞系,“干细胞的报道,4卷,不。4、591 - 604年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m·f·w·Pagliuca j . r . Millman Gurtler et al .,“代人类胰腺功能β细胞体外。”细胞,卷159,不。2、428 - 439年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. a . Rezania j . e .熊先生,p . Arora et al .,“逆转糖尿病与胰岛素生产细胞在体外从人类多能干细胞”,自然生物技术,32卷,不。11日,第1133 - 1121页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m . Rostovskaya:布兰登坎普拥有,a . Smith”走向一致的一代的胰腺血统从人类多能干细胞、祖细胞”英国伦敦皇家学会哲学学报。系列B,生物科学,卷370,不。1680,20140365,页2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. m . Ohori t .木下光男,et al ., m . Okubo”的识别选择性ERK抑制剂和结构测定inhibitor-ERK2复杂,“生物化学和生物物理研究通信,卷336,不。1,第363 - 357页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. m·奥斯特罗姆k . a . Loffler s Edfalk et al .,“视黄酸促进胰腺内分泌的一代祖细胞进一步分化成细胞,”《公共科学图书馆•综合》,3卷,不。7篇文章e2841 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j . Cai c . Yu y刘et al .,“代均匀PDX1(+)胰腺祖细胞从人类ES细胞衍生内胚层细胞,”分子细胞生物学杂志》上,卷2,不。1,50 - 60,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. m . Johannesson a . Stahlberg j .譬如f·w·沙,k . Norrman和h . Semb”FGF4和视黄酸直接分化为成PDX1-expressing前肠内胚层以时间和浓度的方式”《公共科学图书馆•综合》,4卷,不。第三条e4794, 2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m·f·Abazari f . Soleimanifar m .努里·Aleagha et al .,“PCL / PVA nanofibrous脚手架改善胰岛素生产细胞一代人类诱导多能干细胞”基因,卷671,不。671年,50-57,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. r·n·曼苏尔f . Soleimanifar m . f . Abazari et al .,“胶原蛋白涂层实际上电纺polyethersulfon纳米纤维改善胰岛素生产细胞人类诱导多能干细胞分化的潜力,”人工细胞、纳米和生物技术,46卷,补充3,不。sup3, S734-S739, 2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. s e . Enderami y Mortazavi, m . Soleimani s Nadri a . Biglari和r·n·曼苏尔”代胰岛素生产细胞与人类有关的多能干细胞的使用逐步分化的协议优化与富含血小板血浆”细胞生理学杂志,卷232,不。10日,2878 - 2886年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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