文摘

rna结合蛋白Lin28调节neurogliogenesis在哺乳动物中,独立于let-7 microRNA。然而,详细的监管机制仍然模糊。在这里,我们建立了Lin28a或基因Lin28b超表达小鼠胚胎干细胞(ESCs),发现这些细胞表达了类似的水平的核心多能性因素,如Oct4 Sox2,增加Yap1但减少lineage-specific标记而ESCs的控制。ESCs进一步分化的神经元和神经胶质细胞谱系表明Lin28a / b超表达并不影响神经元标记的表达βIII-tubulin,但显著抑制胶质谱系标记,如Gfap和Mbp。有趣的是,过度的Yap1鼠标ESCs拟表型Lin28a / b超表达的ESCs显示缺陷的神经胶质细胞分化。抑制Yap1 / Tead-mediated转录verteporfin部分获救Lin28a / b超表达的ESCs的分化缺陷。从力学上看,我们证明了Lin28可以直接绑定到Yap1信使rna,感应的Yap1 Lin28a Let7制是独立的。综上所述,我们的研究结果揭示小说Lin28-Yap1监管轴在制胶质谱系细胞分化,这可能阐明神经胶质细胞生成在体外。

1。介绍

Lin28a rna结合蛋白和基因Lin28b同系物最初确定为发展时机监管者在秀丽隐杆线虫(1,2]。他们随后发现函数在一个广泛的生物过程,发展,和疾病在哺乳动物中,包括胚胎干细胞自我更新、体细胞重编程,新陈代谢,有机增长,肿瘤发生[3- - - - - -7]。Lin28a / b抑制let-7家人的成熟,多种疾病和癌症的重要球员通过冷休克域(CSD),和一双CCHC-type锌指主题(8- - - - - -10]。此外,Lin28直接结合积极的推动者和新兵Tet1调节目标基因表达,展示其双亲和力DNA和RNA在不同的生物过程(11]。

Lin28广泛表达于多种组织从胚胎到成人,特别是神经系统(6,12]。在活的有机体内研究表明,Lin28a淘汰赛会导致减少神经祖细胞增殖和一个小老鼠大脑,而淘汰赛Lin28a等位基因和一个基因Lin28b等位基因显示相似但比控制更严重的表型,说明Lin28a / b的冗余和关键角色在神经系统发育13]。此外,在体外Lin28a / b的研究显示,组成型表达的结果促进神经发生但gliogenesis块,独立于let-7微rna (14,15]。然而,下游Lin28的目标是什么,他们如何调解Lin28函数在neurogliogenesis在很大程度上仍未知。

多能干细胞(已经),如诱导多能干细胞(万能)和胚胎干细胞(ESCs),可以传播在体外和分化成所有成年细胞。因此他们提供有用的材料来研究细胞分化和疾病重塑蕴含着巨大的希望,药物发现,再生医学(16- - - - - -20.]。探索在neurogliogenesis Lin28的监管机制,我们过表达Lin28a起来从而Lin28b,分别在鼠标的ESCs然后直接分化神经元和胶质细胞在体外。过度的Lin28明显抑制神经胶质的表达谱系标记,Gfap和Mbp,但并不影响神经元标记的表达βIII-tubulin。有趣的是,本构超表达的Yap1制显示类似的效应Lin28a / b OE ESCs期间在体外neurogliogenesis,而抑制Yap1 / Tead-mediated转录输出部分救出这些表型。此外,RNA免疫沉淀反应和qPCR化验证明Lin28可以直接绑定到Yap1信使rna,感应的Yap1 Lin28a Let7制是独立的。我们的研究揭示了一个小说Lin28-Yap1监管轴制胶质细胞谱系分化在体外。

2。材料和方法

2.1。ESC文化和分化

老鼠胚胎干细胞线用于本研究从野生型分离C57 / BL6鼠标如前所述[21,22]。通常,E3.5胚胎囊胚阶段刷新从子宫和培养在mitomycin-C治疗小鼠胚胎成纤维细胞在96孔板与N2B27介质2我(0.4μM PD0325901和3μM CHIR99021)和生活(1000 U /毫升)。ICM(内细胞团)扩展处理0.05%胰蛋白酶和通道24-well板直到稳定ESC线。下的ESCs保持在喂食器正常ES介质(DMEM补充15%的边后卫,0.1毫米不重要的氨基酸,0.1毫米2-mercaptoethanol, 2毫米谷氨酰胺,青霉素和链霉素100 U /毫升、和1000 U /毫升的生活)。ESCs获得feeder-free ESCs,生长在一个0.1% gelatin-coated菜2我+生活中。细胞分化为神经元和神经胶质细胞谱系,我们综合前文所述的差异化协议(23,24]。首先,ESCs的鼠标是使胰蛋白酶化单个细胞,然后取代 细胞每口井的超低粘附96孔板快速聚合,形成均匀大小的拟胚体在KSR介质(高血清DMEM补充葡萄糖15%击倒替换,0.1毫米不重要的氨基酸,0.1毫米2-mercaptoethanol, 2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素,和10μ米SB431542)。悬浮培养5天之后,受到拟胚体粘附文化N2介质(DMEM / F12补充与N2)十天使用6-well板涂有人类纤连蛋白25 ng / ml。

2.2。DNA结构和慢病毒生产和感染

慢病毒表达结构pUbi-MCS-3xFlag (GV358),与鼠标Lin28a / b或鼠标Yap1 subcloned,是从GeneChem公司购买的https://www.genechem.com.cn/。生产慢病毒和感染,慢病毒质粒(1.2μg),包括overexpressing质粒或成分质粒(pLKO.1-Puro),同0.8μ克包装质粒pSPAX2 (Addgene # 12260)和0.5μ克信封表达质粒(Addgene # 12259)瞬变cotransfected到293 T细胞使用Lipofectamine 2000试剂按照制造商的指示;慢病毒转染后48小时,上层清液与0.45收集和过滤μm膜过滤器(微孔)。制被感染的5μg / mL聚凝胺和选择1μg / mL嘌呤霉素72小时,益生元的鼠标Lin28a序列成分补充表中列出1。

2.3。逆转录和定量实时PCR

逆转录和先前存在分析后进行了描述22]。制的总rna提取使用试剂盒试剂(豆类)遵循制造商的指示。1μ克总RNA被用作模板与PrimeScript RT执行反转录试剂盒(豆类)根据指令。实时PCR分析使用Bio-Rad机SYBR预混料Taq交货(豆类)。生成的阈值周期(CT)值为每个记录内部控制规范化的CT值,β肌动蛋白,随后规范化的CT值对应的记录的控制样本。RT的益生元序列引物补充表中列出1。

2.4。免疫印迹分析

制或ESC-derived细胞5天,第十天,day15细胞溶解使用蛋白质裂解缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,100毫米氯化钠,1%三全音x - 100, EDTA 0.1毫米,0.5毫米MgCl2,蛋白酶和磷酸酶抑制剂)。然后,我们遵循以前描述的方法(22]。总之,蛋白质样品被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到PVDF膜(微孔)。膜被封锁的5%脱脂奶粉(BD公司)在TBST + 0.1% Tween-20和孵化主要抗体TBST + 0.1% Tween-20一夜之间在4°C。一级/二级抗体和稀释使用补充表中列出2。

2.5。免疫荧光染色

ESC分化细胞的免疫荧光染色进行如前所描述(21,25]。简单,细胞被固定在4%多聚甲醛在磷酸盐(PBS)在室温下(RT) 30分钟,其次是阻塞与1% BSA在PBS 1小时然后一夜之间主要的抗体在4度。主要的抗体和稀释使用补充表中列出2。与PBS 3次洗后第二天,样本适当的二次抗体孵育,共轭Alexa萤石594(分子探针)PBS室温1小时。细胞与4,然后复染色6-diamidino-2-phenylindole dilactate (DAKO) 15分钟后在RT(描述的方法22]。使用卡尔蔡司共焦显微镜图像捕获800 (LSM)。

2.6。RNA免疫沉淀反应(RIP)测定

EZ-Magna RIP™RNA结合蛋白免疫沉淀反应工具包(17 - 701;微孔)被用来执行撕裂试验。总之,在 控制和Lin28a-flag中制分别细胞溶解,RIP裂解缓冲工具包中提供的。Anti-Flag M2磁珠(No.8223;σ)孵化与溶解产物,Lin28a-flag-RNA复合物沉淀。复合物的清洗和处理蛋白酶k .使用酚/氯仿法提取RNA, RNA和检索受到补充表中列出与gene-specific实时定量rt - pcr引物1。

2.7。数据分析

统计学意义是由未配对的学生 - - - - - -测试。的值是由星号表示的数据( (), (])。不同的 和更低的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Lin28a / b诱发Yap1但在制抑制Lineage-Specific基因表达

调查的潜在调节机制Lin28期间公司的神经元和神经胶质分化,Lin28a和28 b分别建立稳定表达公司的行,通过与相应的慢病毒感染的ESCs。Lin28a和28 b超表达(Lin28a / b-Flag OE)细胞保持典型的圆顶状菌落形态和表达高水平的制表面蛋白碱性磷酸酶ESCs的控制(图1(一))。一致,整体蛋白质水平的ESC核心多能性因素,如Oct4、Sox2, Nanog,没有明显改变Lin28a / b超表达(图1 (b))。然而,lineage-specific基因的表达,包括Cdx2,巢蛋白,T,Gata6在Lin28a / b OE制显著下降(图1 (c))。以前的基于网络的分析表明Lin28a可能河马信号通路的调节因子(26]。因此,我们进一步检查关键河马途径激酶的表达,如Mst和背阔肌,和磷酸化Yap1 (S127和397年),这是细胞质Yap1通过免疫印迹(本地化和退化27]。所有这些蛋白质并没有显示出明显的变化在Lin28a / b的过度表达,但Yap1的总蛋白质含量及其下游目标Ctgf显著调节,这表明Lin28a / b促进功能性Yap1蛋白质通过其他方式而不是规范的河马通路(图1 (d))。进一步的检查Yap1信使rna的存在分析表明Lin28a / b OE并不影响Yap1在制(图表达在转录水平1 (e))。此外,两个鼠标的shrna针对两个不同的地区Lin28a基因了,他们两人可以有效地减少Lin28a mRNA和蛋白水平。符合Lin28a / b OE制,击倒Lin28a的蛋白质水平显著降低Yap1及其下游目标Ctgf,但没有影响Yap1转录水平(图S1b-c)。然而,的减少Lin28a多能制造商限制言论和快速诱导公司的差异化,并存在结果显示lineage-specific基因的表达显著调节Lin28a稳定击倒制(图S1b-c)。综上所述,这些研究结果表明,Lin28a / b是必要的为了维护自我更新和mES的多能性细胞,特别是Lin28影响Yap1蛋白质丰度。

3.2。Lin28a / b抑制酶斯卡灵胶质谱系细胞的分化

积累的研究已经表明,Lin28调节ESC扩散和神经发生在体外,但这种现象的潜在机制仍不清楚14,15]。在这里,我们使用先前描述的协议直接区分鼠标ESCs神经元和胶质细胞在体外(23,24]。如数据所示2(一个)和2 (b),制使胰蛋白酶化单个细胞和培养超低附件96孔板快速聚合和生长均匀大小的拟胚体(EBs) KSR媒介。悬浮培养5天后,EBs受到粘附在N2媒介文化另一个10天。5天的采用无血清悬浮培养技术极大地诱发细胞生长和神经干细胞分化。我们观察到神经干细胞标记,包括Sox1, Sox2,巢蛋白,大幅度增加,而多能标记Oct4下降(数字2 (c)和2 (e))。更有趣的是,蛋白质水平的Lin28a / b和Yap1调节未分化细胞(第0天制)相比,在神经系感应来显示他们的潜在作用。进一步贴壁培养N2中极大地促进了神经元和神经胶质细胞谱系分化(图2 (b))。免疫印迹和免疫荧光分析显示的表达特异性神经元类III-tubulin (Tubb3)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(Mbp)显著增加贴壁培养5天后(数字2 (d)和2 (e))。gaba ergic,此外,不同的神经元亚型包括glutamatergic多巴胺,和胆碱能神经元特征基于水泡谷氨酸转运蛋白2的表达(Vglut2) Gad1, Th,聊天文化(图15天2 (d))。总的来说,这些结果清单的建立小鼠ESC神经胶质细胞和神经元功能分化体系。

评估Lin28a / b在神经谱系分化的作用,我们进行了神经元和神经胶质细胞谱系分化与Lin28a / b OE ESCs化验如上所述。Yap1的表达和神经祖细胞标记,Sox1, Sox2,巢蛋白显著调节Lin28a / b OE细胞相比,控制细胞分化(图的第五天3(一个))。分化的第十天,神经元的表达标记Tubb3相当控制ESCs和Lin28a / b OE ESCs之间,但神经胶质细胞标记Gfap的表达和Mbp Lin28a / b的ESCs的大幅低于ESCs的控制(图3 (b))。分化时间的进一步延长15天不能重新安装Gfap的表达在Lin28a / b细胞,而不同的神经元标记Th,聊天,vGlut2, Gad1表示在控制细胞和Lin28a / b OE细胞(图3 (c))。免疫荧光分析也证实了神经元标记Tubb3和Th的表达式,而不是神经胶质细胞标记Gfap和Mbp Lin28a / b OE ESCs,表明专制Lin28a / b在ESC神经胶质细胞分化(图3 (d))。更有趣的是,Yap1 Lin28a / b OE细胞总是高于控制整个细胞在体外分化过程中,建议Lin28a / b之间的正相关和Yap1(数据3(一个)- - - - - -3 (c))。

3.3。Yap1过度制拟表型神经胶质细胞谱系分化Lin28a / b OE ESCs的缺陷

澄清是否upregulation Yap1 Lin28a / b OE细胞与胶质谱系细胞的抑制小鼠ESC分化期间,我们生成Yap1过度(Yap1-Flag OE)鼠标ESCs使用慢病毒。这些细胞也保持着典型的圆顶状菌落形态和表达高水平的制表面蛋白碱性磷酸酶类似Lin28a / b OE细胞(图4(一))。此外,Yap1超表达并不影响的表达核心多能性因素,但大大提升其下游目标Ctgf(图4 (b))。分化的ESCs Yap1 OE如上显示upregulation Yap1确实促进了神经干细胞标记物的表达,如Sox1 Sox2,巢蛋白,类似于Lin28a / b ESCs OE(图4 (c))。同样,Yap1 OE ESCs表现得像Lin28a / b OE表达低水平的神经胶质细胞谱系细胞制造商Gfap和Mbp,但类似水平的神经细胞谱系标记Tubb3和其他功能神经元标记Th,聊天,vGlut2, Gad1而控制细胞在诱导分化(数字4 (d)- - - - - -4(g)),这表明Yap1可能Lin28a / b效应在控制小鼠ESC分化神经元和神经胶质细胞谱系。

3.4。抑制Yap1-Tead交互使用Verteporfin部分获救的缺陷Lin28a / b OE制胶质细胞谱系分化

Yap1已经证明作为共激活剂,及其转录输出主要是依赖于绑定而家族转录因子(28,29日]。找出upregulation Yap1-mediated转录输出是否负责胶质谱系分化缺陷Lin28a / b OE制,我们介绍了抑制剂verteporfin Yap1-Tead交互在体外分化测定Lin28a OE制。我们第一次治疗Lin28a ESCs OE verteporfin不同浓度的24小时。我们发现增加Yap1抑制剂浓度急剧下降和Ctgf蛋白水平,和Lin28和核心的表达多能性因素Oct4和Sox2减少(图5(一个))。自0.5年μM verteporfin明显减少Yap1函数,我们下一个治疗的贴壁细胞分化Lin28a OE制5天在这个浓度,然后分析了神经元和神经胶质的表达谱系标记免疫印迹和免疫荧光检测10和15天,分别为(图5 (b))。我们发现抑制与verteporfin Yap1-Tead交互部分获救的表达胶质谱系标记,如Gfap和Mbp,但并不影响Tubb3的表达和功能神经元标记,像在Lin28a OE mESC-differentiated细胞(Th和聊天5 (c)- - - - - -5 (e)),表明胶质谱系分化Lin28a / b OE制的缺陷在一定程度上造成Yap1 / Tead-mediated转录输出增加。

3.5。感应的Yap1 Lin28a / b在鼠标的ESCs Let7独立的

Lin28是众所周知的抑制let-7 microrna的生物起源和let-7b在神经干细胞分化中起着至关重要的作用30.,31日]。因此,我们调查是否Lin28调节Yap1通过let-7 microrna在老鼠的ESCs成员。Lin28 LI71 Lin28-let-7a拮抗剂1抑制剂可以抑制Lin28a和let-7交互和microrna的ESCs处理有效地32,33),然后我们对待Lin28a OE制与不同浓度的LI71 Lin28-let-7a拮抗剂1 24小时,分别对蛋白质分析。原来增加了抑制剂的浓度并没有改变老鼠的ESCs Yap1(数字的表达6(一)和6 (b)),这表明感应的Yap1 Lin28a / b超表达在鼠标的ESCs Let7通路独立的。然后,我们想解决Lin28能否直接绑定Yap1信使RNA调节它的翻译,我们进行RNA中使用anti-Flag抗体免疫沉淀反应Lin28a-Flag中制。微管蛋白非特异性RNA信使RNA被用作控制绑定,和H2a和细胞周期蛋白B信使rna作为积极的控制。我们发现这两个Yap1和小胡子mrna展出戏剧性充实Lin28a-Flag过表达,制;这些数据表明,Lin28可以直接绑定到Yap1信使rna(图S2)。集体,我们报道一个小说Lin28a / b-Yap1监管轴在小鼠ESC胶质谱系细胞分化(图6 (c))。Lin28a / b可以直接绑定到Yap1信使rna调节其翻译,和感应Yap1 Lin28a在公司独立于规范河马通路和let-7家庭成员。

4所示。讨论

以前的在体外和在活的有机体内研究已经证明,Lin28a / b在中枢神经发展,扮演着重要的角色,其功能是独立于let-7微rna (13- - - - - -15]。然而,下游目标潜在neurogliogenesis Lin28函数不是很好理解。在这里,我们的研究已经确定了Yap1作为一个至关重要的下游效应Lin28和证明Yap1 / Tead-mediated转录输出部分负责Lin28a / b超表达诱导神经胶质细胞分化从鼠标的ESCs缺陷。

Yap1,一个关键的转录辅因子负监管的河马通路,是至关重要的发展和规模控制多个器官的34,35]。此外,河马的更为多样化功能通路已经认可,包括细胞增殖、分化和迁移12,36]。过度的Yap1鼠标ESCs抑制ESC分化和足以维持干细胞的特征。激活Yap1鼠标万能的小鼠成纤维细胞重编程效率提高。所有这些证据,包括我们在这项研究中观察到的和先前描述,符合的表型overexpressing Lin28a / b在鼠标的ESCs [37- - - - - -40]。Yap1大幅增加在ESC神经干细胞分化和Yap1超表达促进神经祖细胞标记物的表达,包括Sox1和巢蛋白,这表明其关键作用在神经干细胞从ESCs的承诺。然而,在后期分化阶段,从5 - 15天,Yap1逐渐降低了。这符合前面的识别Yap1 neurogliogenesis期间作为抑制因子(38,41]。Sox2-Lin28通路已被证实能支配神经祖细胞增殖和神经发生但gliogenesis压抑在体外(15,30.]。在我们的在体外差异化分析,我们发现Yap1表达谱非常类似于Sox2 Lin28,和本构超表达Yap1鼠标ESCs限制胶质细胞谱系的细胞分化,并进一步抑制Yap1 / Tead-mediated转录输出部分获救的分化缺陷Lin28a / b OE ESCs胶质细胞谱系,确认关键在ES Yap1胶质细胞分化的作用。

河马通路的下游效应,Yap1受是一个高度保守的激酶级联Mst和背阔肌34]。以往的基于网络的表达分析显示Lin28可能是监管核转录因子的河马通路在干细胞(26]。ESCs Lin28a / b超表达的鼠标不影响Yap1上游激酶的表达,如Mst和背阔肌,和Yap1磷酸化水平的关键功能的网站,包括S127, 397年,Y357,指示的规定Yap1 Lin28a / b是独立的规范河马通路。在我们的研究中,抑制老鼠Lin28和Let-7交互的ESCs不会改变Yap1蛋白质水平,这表明Yap1的感应Lin28a Let7通路/ b是独立的,和一些新奇的机制可能是通过Lin28调节Yap1在制胶质细胞谱系分化。以前的研究已经表明Lin28可以作为基于dna的监管机构或直接影响目标mRNA翻译和拼接;ChIP-seq数据表明Lin28a可以直接招募的5-UTR Tet1和绑定Yap1在小鼠胚胎干细胞(11]。然而,在我们的研究中,我们观察到Yap1信使rna没有改变,而Yap1蛋白水平及其下游目标Ctgf显著诱导酶斯卡灵阶段和整个神经与Lin28-overexpressed细胞谱系分化,表明Lin28a / b可能参与转录后的调控Yap1表达式。在老鼠和人类胚胎干细胞,多项研究表明,Lin28调节细胞cycle-related pluripotency-associated基因的表达,如细胞周期蛋白B和Oct4通过直接绑定到这些目标mrna和提高他们的翻译42- - - - - -44]。事实上,RNA-IP qPCR化验也证实Lin28a可以直接绑定到Yap1信使rna,类似的规定H2a和细胞周期蛋白BESCs Lin28a的老鼠。总的来说,我们的研究支持了假设Lin28a / b直接结合Yap1信使rna和参与其翻译规律,进一步阐明监管机制的Yap1 Lin28在未来将是必要的。

数据可用性

数据可以在请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

胡安·罗和Hailin邹了同样的工作。

确认

这项工作得到了中央大学基础研究基金(批准号20 ykzd02),广东基础研究和应用基础研究基金会(批准号2019 a1515110285)和中国国家自然科学基金(批准号32000679)。

补充材料

补充表1:低聚糖使用的引物序列。补充表2:使用抗体列表。补充图S1: (a)相差显微镜检查shNC和Lin28a稳定击倒ESCs鼠标下2我+生活中。酒吧,200μm。(b)总蛋白的免疫印迹分析shNC Lin28a稳定击倒ESCs鼠标使用表示抗体。(c)中存在检查Lin28a的mRNA水平,Yap1, Ctgf, lineage-specific shNC基因表达和击倒鼠标ESCs Lin28a稳定。数据的显示 ( )。统计上显著的差异表示( , 和 , )。补充图S2: Ctrl和Lin28-Flag过表达小鼠ES细胞被用来做标记免疫沉淀反应(Flag-IP)和RNA样本提取IP复合物reverse-transcripted产生互补,其次是qPCR使用以下基因引物。mRNA水平出现在Lin28-Flag过表达小鼠ES细胞相对于控制显示。每条线都表示 ( )。(补充材料)