HGF-Modified牙髓干细胞减轻炎症和纤维化该文就近年来关于百草枯所致急性呼吸窘迫综合征发生反应

文摘

百草枯(PQ)中毒可引起急性肺损伤和肺纤维化进展并最终死亡没有有效的疗法。间充质干细胞(msc)和肝细胞生长因子(HGF)已被证明部分弥补这个损失。可以来源于骨髓msc (BM-MSCs),脂肪组织(AD-MSCs),脐带(UC-MSCs)、牙髓(DPSCs),和其他来源。msc特定于组织的生物学特性。开发一个有效的治疗PQ中毒,我们比较了抗炎和antifibrotic UC-MSCs DPSCs和选择的影响和修改一个合适的来源与HGF调查他们的治疗效果在体外和体内。在这项研究中,msc的上层清液有利于人类肺上皮细胞的生存能力和扩散BEAS-2B。炎症和实时PCR fibrosis-related细胞因子进行了分析。结果表明,msc的上层清液能抑制促炎和profibrotic细胞因子的表达,增加抗炎和BEAS-2B antifibrotic细胞因子的表达细胞和人类肺纤维母细胞MRC-5。细胞外囊泡(EVs)源自msc比msc的上层清液更有效地执行。DPSCs的影响强于UC-MSCs和进一步加强了HGF修改。 PQ-poisoned mice were established, and UC-MSCs, DPSCs, and DPSCs-HGF were administered. Histopathological assessments revealed that DPSCs-HGF mitigated lung inflammation and collagen accumulation more effectively than the other treatments. DPSCs-HGF reduced lung permeability and increased the survival rate of PQ mice from 20% to 50%. Taken together, these results indicated that DPSCs can suppress inflammation and fibrosis in human lung cells better than UC-MSCs. The anti-inflammatory and antifibrotic effects were significantly enhanced by HGF modification. DPSCs-HGF ameliorated pulmonitis and pulmonary fibrosis in PQ mice, effectively improving the survival rate, which might be mediated by paracrine mechanisms. The results suggested that DPSCs-HGF transplantation was a potential therapeutic approach for PQ poisoning.

1。介绍

百草枯(1,1 - - - - - -dimethyl-4 4 - - - - - -二氯化bipyridinium PQ)是广泛使用的除草剂,特别是在发展中国家,由于其强烈的氧化和非选择性属性,低成本和廉价的生产过程1,2]。然而,口头或误食PQ的发病率在过去的二十年里有了长足的进步。PQ中毒导致损伤多个器官,如肝脏、肾脏、心脏、肺和中枢神经系统,但主要目标组织(3,4]。PQ中毒的死亡率高达90%,没有有效的解药或药物治疗方案除了减少其吸收和试图防止组织损伤(1,5,6]。尽管PQ使用已被禁止在许多国家,它仍然是其他除草剂的重要组成部分,如在中国杀。因此,有必要开发一个有效的临床治疗策略。

目前,人们普遍认为,PQ最初导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS),包括肺部水肿和出血,炎症细胞的浸润间质和肺泡的早期阶段(1,3]。疾病的进展、肺纤维化、肺间质纤维化发生,和呼吸衰竭是死于PQ中毒的主要原因7]。因此,规范和减少炎症和纤维化的发展可能是一个有效的策略治疗PQ中毒。

最近,间充质干细胞(msc)用于治疗肺损伤,因为他们的低免疫原性和旁分泌作用[8,9]。msc可以来自各种来源,包括骨髓、脐带、牙髓,脂肪组织,和胎盘(8]。骨骨髓来源msc (BM-MSCs)和脂肪msc (AD-MSCs)需要侵入性的手术,如穿刺或抽脂,增加感染的风险。脐带和牙齿医疗废物,从脐带获得msc (UC-MSCs)和牙髓(DPSCs)几乎没有危害。此外,这些细胞具有很强的增殖能力和低免疫原性,因此广泛使用。此外,msc的生物属性可能不同来自不同来源的细胞之间由于组织特异性和可塑性10- - - - - -12]。因此,选择一个合适的msc移植是重要来源PQ中毒的治疗在临床医学。

肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能细胞因子,防止和减弱疾病进展通过影响多个病理生理进程参与炎症和免疫反应,包括细胞迁移、成熟,细胞因子的生产、抗原表达,T细胞效应函数(13]。此外,据报道,HGF的功能抑制肺纤维化。一些研究批准,HGF能减轻受伤ARDS通过保护肺肺通透性。例如,HGF保护血管内皮屏障功能障碍和细胞凋亡14];胡锦涛等人发现,HGF-overexpressed msc维持肺渗透率和保护对LPS诱导的肺损伤(15]。PQ中毒的症状肺的肺毒性包括肺出血、充血、水肿,肝纤维化(3]。它类似于ARDS的病理特性的特点是弥漫性肺血管内皮和上皮细胞损伤,alveolar-capillary渗透率增加,肺泡肺水肿。除了肺渗透率和肺泡肺水肿,PQ中毒的组织病理学也包括炎性浸润和纤维化的快速发展,这将是有益的,如果治疗可以抑制纤维化反应。HGF-induced抑制纤维化的重塑可能发生直接和间接通过多种机制包括促进细胞肺上皮细胞和内皮细胞的存活和增殖和减少myofibroblast积累(16]。渡边等人报道,HGF被认定为一个重要的配体引起myofibroblast细胞凋亡和细胞外基质降解增加活动的基质金属蛋白酶(MMP) 2/9 (17]。上述研究说明,HGF能调节炎症和肺纤维化。所以,我们修改了最有前途的msc与胶质瘤基因治疗PQ中毒在这项研究。

此外,生物活性成分由msc不仅是细胞因子分泌细胞外囊泡(EVs),富含蛋白质,mrna, microrna和其他物质,参与细胞间的沟通(18,19]。电动汽车可以减轻肺纤维化的发展(20.]。

在这项研究中,我们培养的人类肺上皮细胞(BEAS-2B)和人类的肺成纤维细胞(MRC-5) UC-MSCs的上层清液或DPSCs来比较这两种类型的抗炎和antifibrotic效果msc、同时MSCs-derived电动汽车的影响进行调查。然后,msc被选的最佳来源与HGF和修改,以及这些修改细胞在炎症和纤维化的抑制作用进行了分析调查PQ-induced肺损伤的治疗效果。这些结果提供了第一个综合评价msc移植治疗PQ中毒。

2。材料和方法

2.1。细胞

人类UC-MSCs和DPSCs礼物来自北京上海生物技术公司。msc的两种类型是在段落使用4 - 6,无血清培养系统和媒体(SANYL,北京Sanyouli技术先进的有限公司,中国)。所有的实验学院伦理委员会批准的程序。

人肺上皮细胞(BEAS-2B)请的周教授(北京对放射生物学重点实验室)和生长因子和hormone-supplemented培养基培养(LHC-8) (Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国)。正常成人肺成纤维细胞(MRC-5)从写明ATCC获得和在DMEM培养补充10%胎牛血清和1% NEAA (Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国)。收集MSCs-derived文化上层清液和电动汽车或孤立coculture BEAS-2B和MRC-5细胞。

2.2。运载体和基因修改

本研究中使用的腺病毒(副词)Ad-HGF Ad-null。副词是replication-defective腺病毒。Ad-HGF表达人类胶质瘤,Ad-null不携带外源基因。这两个向量构造与AdEasy系统(美国Stratagene拉霍亚,CA)如前所述[21]。DPSCs被感染,感染复数(MOI) 150年Ad-HGF或Ad-null和上层清液或细胞收集postinfection 2天。

2.3。细胞生存和增殖试验

细胞计数Kit-8 (CCK8) (Bimake、上海、中国)是用来测量细胞的生存能力在24 h, 48 h,和72 h后文化根据制造商的指示。BEAS-2B被播种在96孔板( 细胞每)10μL / msc的上层清液。对照组与同等体积的新鲜培养基培养。

BEAS-2B被播种在6-well板( 细胞每)200μL / msc的上层清液72 h。增殖指数由流式细胞术和细胞增殖染料eFluor®670(染料670)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。

2.4。肺细胞炎症和纤维化归纳

BEAS-2B MRC-5细胞分别被播种 每在6-well细胞细胞培养板(Nalge Nunc国际,罗切斯特,纽约,美国)。TGF -β(美国新泽西州PeproTech)在最后一个使用的浓度10 ng / mL 48 h体外诱导炎症和纤维化。然后,BEAS-2B或MRC-5细胞培养与200年μL / msc的上层清液或约 电动汽车/细胞48 h根据我们之前的研究22]。

2.5。RNA隔离和逆转录-聚合酶链反应

从细胞总RNA分离使用RNA-Quick净化设备(ES科学,中国上海)。从肺组织总RNA分离使用试剂盒试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。使用StarScript II互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成混合gDNA剂工具包(GenStar,北京)。定量聚合酶链反应(qPCR)都使用了RealStar绿色快速混合火箭II (GenStar,北京)ABI 7500快速系统(应用生物系统公司、热费希尔科学、钙、美国)。PCR分析每个样本一式四份,和mRNA水平测量使用标准曲线。炎症相关的和fibrosis-related因素进行了分析研究。促炎细胞因子包括TNF -α,il - 1β、il - 6和引发,抗炎细胞因子il - 4、il - 10, IL-13。fibrosis-related因素包括αsma、波形蛋白、胶原蛋白,我的基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、基质金属蛋白酶- 9 (MMP),钙粘蛋白。引物序列见表细节1。

2.6。PQ模型和msc移植化验

所有的动物实验伦理委员会批准北京放射医学研究所,和所有程序都按照指导方针和有关规定进行。C57BL / 6 j小鼠(女,SPF级)从北京购买重要河流实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)。45小鼠随机分为5组:正常组( ),PQ组( ),UC-MSCs集团( ),DPSCs集团( ),和DPSCs-HGF集团( )。初步实验结果显示,老鼠intragastrically管理0.2毫升的PQ (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)的剂量150毫克/公斤,和正常组与同样体积的生理盐水填喂法。

UC-MSCs、DPSCs或DPSCs-HGF通过尾静脉注入小鼠PQ-poisoned在200年μL的盐水( 细胞)在第1和3天之后胃内的PQ管理。200年PQ组μL(生理盐水没有任何细胞。每组的死亡记录。剩下的老鼠在28天牺牲了。

2.7。组织病理学评价

正确的肺叶固定在4%多聚甲醛(Servicebio技术、武汉、湖北)。苏木精和伊红染色(圆))进行评估组织炎症和形态,马森和染色进行量化组织纤维化。

显微照片的放大的×400人获得使用光学显微镜(奥林巴斯CKX53;奥林巴斯拉丁美洲Inc .)、巴西)。炎症损伤程度分级使用先前描述的评分系统用细微的修改(23]。病理特征包括炎症细胞浸润、出血,和II型肺泡上皮增生分级从0到4基于其缺席(0)或存在轻微的(1),(2)温和,温和的(3),或严重(4)学位。十微观领域被随机选择从每个Masson-stained部分评估组织纤维化和胶原纤维的百分比像素区域总组织像素面积的统计确定。

2.8。酶联免疫吸附试验

支气管肺泡灌洗液(BALF)收集和离心机在4°C 8000转10分钟。上层清液存储−70°C的蛋白质和细胞因子分析。白蛋白(铝青铜)、碱性磷酸酶(ALP)、羟脯氨酸(忧郁)BALF浮在表面的量化使用商用酶联immunoabsorbent化验(MLbio、上海、中国)根据制造商的指示。

2.9。统计分析

数据表示为 或与GraphPad棱镜6 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。对比组的方差分析与图基或邓恩的多个对比测试来评估统计学意义。值≤0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。msc提升BEAS-2B细胞的生存能力和扩散

BEAS-2B细胞培养的上层清液UC-MSCs和DPSCs分别为3天,细胞生存能力是衡量CCK8化验,扩散后,流式细胞仪分析细胞被染色的染料670。CCK8测定结果表明,异常两msc治疗组高于对照组,和UC-MSCs组细胞生存能力高于DPSCs组(图1(一))。流式细胞术结果显示,两组msc增殖指数高于对照组,和UC-MSCs组表现出比DPSCs集团(数据更好的扩散指数1 (b)和1 (c))。这些结果表明,msc可以促进BEAS-2B细胞的生存能力和扩散,UC-MSCs略优于DPSCs执行。

3.2。抗炎作用UC-MSCs和DPSCs BEAS-2B和MRC-5细胞

抗炎作用的阐明UC-MSCs和DPSCs BEAS-2B TGF -后和MRC-5细胞β治疗,我们测量qPCR几个促炎和抗炎细胞因子。促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 1 (IL)β、il - 6和引发,抗炎细胞因子il - 4、il - 10, IL-13。在BEAS-2B细胞,促炎细胞因子和抗炎细胞因子的增加而减少的两个msc组相比TGF -β组(图2(一个))。在这些细胞因子中,TNF -α急剧减少,几乎是正常。DPSCs组明显降低il - 1βil - 6,引发与UC-MSCs组相比,两组之间有显著差异。没有统计上的显著差异引发的表达水平和抗炎细胞因子il - 4和IL-13 UC-MSCs组和TGF -β组。然而,DPSCs组显著增加的抗炎细胞因子的表达,尤其是il - 4和il - 10。结果表明,UC-MSCs DPSCs可以抑制促炎细胞因子释放BEAS-2B细胞刺激TGF -β的影响,DPSCs强于UC-MSCs。此外,DPSCs可能诱发BEAS-2B细胞分泌抗炎细胞因子比UC-MSCs。与DPSCs-EVs BEAS-2B细胞被培养,研究电动汽车的抗炎作用。结果表明,DPSCs-EVs il - 6和调节使之抑制il - 4比DPSCs更强烈(补充图1)。

确定msc MRC-5细胞的抗炎效果是否符合BEAS-2B的细胞,我们还测量了il - 6的表达,il - 10, IL-13 MRC-5细胞(图2 (b))。MRC-5细胞的两个msc组表现出降低il - 6和il - 10和IL-13表达增加,类似于对BEAS-2B细胞的影响。此外,DPSCs组相比有统计学意义差异UC-MSCs组。这些结果表明,这两种类型的msc可以抑制促炎细胞因子,促进抗炎细胞因子表达,和DPSCs可能比UC-MSCs更有效地缓解炎症反应。

3.3。Antifibrotic UC-MSCs和DPSCs BEAS-2B和MRC-5细胞

α光滑的肌肉肌动蛋白(α分析了sma)和波形蛋白(VIM) BEAS-2B和MRC-5细胞检查的antifibrotic影响的差异两个MSC组。αTGF - sma和VIM显著增加β组,表明BEAS-2B和MRC-5接受纤维化(图3)。msc管理后的表达水平αsma和VIM细胞系都不同程度下降,特别是αsma,大大降低了。没有统计上的显著差异表达的VIM BEAS-2B UC-MSC组和TGF -之间的细胞β集团在VIM特别是DPSCs组中表达下调。这些结果表明,DPSCs抑制纤维化因素比UC-MSCs更强烈的表达。antifibrotic DPSCs-EVs的影响也进行了分析,结果表明,电动汽车可以减少纤维化BEAS-2B细胞因子的表达,和上层清液的效果比DPSCs(补充图1)。

3.4。DPSCs-HGF有效缓解BEAS-2B MRC-5细胞炎症

根据前面的结果,我们发现DPSCs最好抗炎和antifibrotic效果,因此,我们修改DPSCs HGF基因和调查的影响DPSCs-HGF的减轻炎症和纤维化。结果表明,TNF的表达α,il - 1β和il - 4、il - 6和引发的水平降低,il - 10, IL-13 BEAS-2B细胞不同程度增加DPSCs后上层清液治疗(图4(一))。DPSCs-null组相比,DPSCs-HGF显著影响TNF的表达α,il - 1β引发,il - 4、il - 10和IL-13。在MRC-5细胞,符合BEAS-2B细胞,DPSCs两组表现出抑制il - 6,但增加了il - 10和IL-13表达式(图4 (b))。IL-13是具有统计学意义的表达DPSCs-HGF组相比DPSCs-null组。这些结果表明,HGF修改可以加强DPSCs的抗炎能力。

3.5。DPSCs-HGF BEAS-2B和MRC-5细胞抑制纤维化

探讨antifibrotic DPSCs-HGF、纤维化胶原蛋白等因素,TIMP, MMP-9进行了分析。结果表明,的表达αsma, VIM、胶原蛋白我和TIMP在TGF - MRC-5细胞增加β组,这表明MRC-5细胞经历了纤维化(图5(一个))。这些fibrosis-related DPSCs两组因素减少,特别是αsma。DPSCs-HGF集团相比DPSCs-null组表现出减少αsma,胶原蛋白和TIMP。TGF -β减少MMP-9 MRC-5细胞,但DPSCs-HGF MMP-9增加。这些结果表明,DPSCs-HGF可以提高MRC-5细胞纤维化DPSCs的抑制效应。

αsma, VIM, MMP-9和钙粘蛋白也以BEAS-2B细胞(图5 (b))。我们发现DPSCs-HGF下降αsma, VIM, MMP-9 DPSCs-null相比大大增加钙粘蛋白。这些结果表明,DPSCs-HGF可以抑制BEAS-2B细胞的纤维化和优于DPSCs-null执行。

3.6。DPSCs-HGF对PQ体内导致的肺损伤的保护

生存曲线分析了PQ填喂法(图后28天6(一))。对照组的存活率,PQ组UC-MSCs集团DPSCs集团和DPSCs-HGF组分别为100%,20%,30%,30%,和50%,分别。没有显著差异UC-MSCs和DPSCs组相比PQ组。然而,DPSCs-HGF组表现出显著增加存活率相比的PQ组。这些结果表明,DPSCs-HGF PQ-poisoned小鼠的死亡率降低。

)染色进行探讨肺部炎症的程度(数字6 (b)和6 (c))。结果表明:正常组的肺组织肺泡结构完整性,没有炎症浸润。PQ诱导肺泡结构损伤,肺间质充血、水肿,以及明显的炎性细胞浸润。UC-MSCs DPSCs治疗减轻肺损伤,但血管周的炎症和胸膜炎仍然发生。DPSCs-HGF抑制炎症介质,肺泡结构几乎是集成没有出血和炎性细胞浸润。

马森染色进行评估肺纤维化的进展(数字6 (b)和6 (d))。结果显示出血和崩溃,大面积彩色蓝色代表PQ组胶原纤维积累。三个msc组表现出蓝色区域减少,胶原面积大大减少在DPSCs-HGF组。没有明显的肺泡壁增厚DPSCs-HGF组。这些结果表明,DPSCs-HGF有效地阻止纤维化发展和胶原蛋白的积累。

铝青铜的表达、高山和忧郁BALF中衡量ELISA评估肺渗透(图6 (e))。结果表明,UC-MSCs、DPSCs DPSCs-HGF所有忧郁的表达下降2天,第五天,第八天;第五天,第八天的高山;和铝青铜在5天。有一个铝青铜的表达下降8天只有DPSCs-HGF组。两个DPSCs组降低了忧郁的表达与显著差异在8天,相比UC-MSCs组。这个结果说明msc团体可以减轻肺渗透率和DPSCs比UC-MSCs更好。

一些在肺组织炎症相关的和fibrosis-related因素也被qPCR确认msc PQ老鼠(图上的效果6 (f))。数据显示三个msc组TNF的表达水平降低α,il - 1β,il - 6。这些炎性细胞因子的表达水平在DPSCs DPSCs-HGF组与UC-MSCs组相比有显著性差异。此外,DPSCs-HGF比DPSCs表现更好。的表达αsma和波形蛋白都是由三个msc组显著降低,和HGF修改集团似乎比其他两组。

4所示。讨论

在诊所的主要方法治疗PQ血液透析,血液过滤排除毒素,和药物,如脂联素、钠ferulate结合氧化苦参碱,pirfenidone +强的松(3,24,25]。然而,这些目前可用的治疗是无效的在阻止疾病的进展,和存活率仍然很低。较低的免疫原性和强大的免疫抑制和抗炎作用,msc被用在许多研究多种呼吸道疾病,如急性呼吸窘迫综合征(ARDS),急性肺损伤(ALI),慢性阻塞性肺病(COPD),在临床试验中(26- - - - - -29日]。这表明,msc移植治疗PQ中毒可能是一个有效的策略。

迄今为止,msc用于治疗PQ中毒已经通常来源于骨髓(30.- - - - - -32]。影响msc的治疗效果的一个因素是他们的来源。先前的研究已经比较了不同来源的msc对ARDS的影响。任等人调查UC-MSCs和BM-MSCs阿里的效果,发现UC-MSCs分泌较高水平的抗炎细胞因子与BM-MSCs [33]。席尔瓦等人发现BM-MSCs和AD-MSCs产生有利影响大于肺组织间充质干细胞在ARDS [34]。这表明,不同来源的msc对呼吸道疾病可能会导致不同的影响。然而,没有信息的最佳来源msc治疗PQ中毒。

因此,我们比较了抗炎和antifibrotic属性UC-MSCs和DPSCs msc的找到合适的来源。我们发现DPSCs拥有更强大的抗炎和比UC-MSCs antifibrosis能力。此外,由msc分泌细胞因子的数量似乎不足以防止炎症和纤维化的进展。一些研究人员使用msc转基因与趋化因子受体CXCR4等因素,基本纤维化生长因子(bFGF),和HGF减轻急性和慢性肺损伤和肺纤维化的影响(35- - - - - -37]。在这项研究中,我们介绍了胶质瘤的基因,我们观察到HGF-modified DPSCs可以促进细胞生存和抑制炎症。结果表明,胶质瘤基因治疗的联合应用和msc可以提高治疗效果。因此,在这项研究中,我们修改msc与HGF从适当的来源,研究其对PQ-induced肺损伤的保护作用。

肺PQ中毒的症状是早期的炎症反应,和持续的炎症可促进肺成纤维细胞的过度增殖,加速成纤维细胞分化myofibroblasts,导致intra-alveolar和间质纤维化晚期阶段(38]。因此,我们使用人类肺上皮细胞BEAS-2B和人类肺成纤维细胞MRC-5调查抗炎和antifibrotic UC-MSCs和DPSCs研究的影响。

之前的研究表明,msc的极好来源细胞启动肺细胞增殖(39]。我们的研究结果表明,UC-MSCs和DPSCs移植能促进BEAS-2B细胞增殖,促进肺修复无论来源;然而,UC-MSCs比DPSCs(图执行1)。任等人表明,UC-MSCs细胞增殖能力高于DPSCs分泌的生长因子和能量代谢(12]。

PQ可以诱导一些炎性细胞因子的释放。王等人报道,PQ诱导释放肿瘤坏死因子-α,il - 1β、il - 6和引发,导致急性肺损伤(40]。李等人表明TNF -α是由肺泡巨噬细胞在肺损伤的早期阶段,在后期纤维化阶段,引发各种促炎细胞因子的释放,导致纤维母细胞增生(41]。我们发现,msc可以抑制促炎因子的表达式,如肿瘤坏死因子-α,il - 1βil - 6,增加抗炎因子,如IL-13,从而减轻炎症BEAS-2B和MRC-5细胞(图的效果2)。这一发现是一致的与一些研究[42,43]。il - 10中扮演一个重要的抗炎作用通过抑制炎症因子,il - 6、TNF -αil - 1,保护受损组织和器官在某些慢性炎性疾病44]。最近,山本等人报道,il - 10可能显著降低刺激了TGF - 1胶原蛋白和纤维连接β(45]。在我们的研究中,il - 10的表达水平MRC-5细胞被DPSCs和DPSCs-HGF(数据显著增加2和4)。这些结果说明,msc可能抑制炎症和纤维化通过促进il - 10的表达。

有小UC-MSCs和DPSCs之间的差异。低水平的促炎细胞因子和较高的抗炎细胞因子分泌当BEAS-2B或MRC-5细胞培养与DPSCs上层清液然后UC-MSCs上层清液。此外,抑制促炎细胞因子和加速抗炎因子显著增强与HGF(图修改后4)。因此,DPSCs,尤其是DPSCs-HGF,可以防止炎症进展通过抑制肿瘤坏死因子-α和促进il - 10。这可能是一个msc治疗PQ-induced肺损伤的机制。

纤维化是一个后期的PQ中毒症状。许多研究人员已经证明,管理的msc可以预防和逆转肺纤维化46,47]。αsma被认为是成纤维细胞的生物标志物,在myofibroblast分化和波形蛋白是一个中间产品。我们发现,msc下降αsma和波形蛋白,DPSCs有更强的影响比UC-MSCs(图3)。这些结果表明,DPSCs可能阻止纤维化的理想来源。

额外的纤维变性的因素,如胶原蛋白I, TIMP, MMP-9,分析评估DPSCs-HGF在肺纤维化进展的抑制作用。Myofibroblasts被认为是一个主要诱发细胞类型在肺纤维化的进展48]。Myofibroblasts可以来自成纤维细胞转分化49,50)和epithelial-mesenchymal转换(EMT) (51,52]。EMT参与PQ-induced肺纤维化(53,54]。在EMT过程中,钙上皮细胞标记,却降低了,αsma和波形蛋白增加(55,56]。我们发现DPSCs-HGF增加BEAS-2B上皮细胞(图5)。这一结果表明,EMT DPSCs-HGF可以抑制。

MMP的家庭在不同的细胞类型中扮演不同的角色。MMP-9在成纤维细胞的作用包括抑制纤维化的细胞外基质的降解57]。然而,MMP-9促进上皮细胞纤维化晚期阶段(58]。这些发现符合我们的研究结果显示,MMP-9 MRC-5细胞确实是增加和减少由DPSCs-HGF BEAS-2B细胞。因此,这些结果提供洞察DPSCs-HGF抑制纤维化的机制通过分泌的各种因素。

此外,我们发现DPSCs-EVs表现出更强的能力比DPSCs抑制炎症和纤维化的上层清液(补充图1)。DPSCs-EVs体积小的优势和强大的渗透。目前,电动汽车已成为一个研究热点,因为他们不存在于细胞疗法的安全性考虑。电动汽车的潜在机制和效果需要进一步调查。

我们建立了PQ中毒动物模型通过胃内的管理PQ 150毫克/公斤。UC-MSCs和DPSCs移植组的生存率仅略高于PQ组(图6(一)),这并不像我们预期的那么好。这个效应有两种可能的原因。首先,老鼠在高剂量导致接受了PQ胃灌注90%死亡率根据我们先前preexperiment结果。刘等人建立了PQ中毒模型通过管理25毫克/公斤PQ填喂法(59]。张等人报道,BMSC疗法可以防止PQ-induced ALI大鼠服用20毫克/公斤PQ腹腔内注射(31日]。Schapochnik等人建立了肺纤维化C57 / BL6由单一注射小鼠PQ(10毫克/公斤;i.p。)60]。显然,PQ在我们研究的剂量明显高于其他研究。第二,PQ中毒病人通常接受医学治疗如催吐剂,第一次洗胃,但这些措施不能适用于老鼠。因此,PQ保留并吸收更多的老鼠和诱发更为严重的肺损伤。这可能是存活率的主要原因和组织病理学UC-MSCs和DPSCs团体并不令人满意。然而,DPSCs-HGF移植PQ-poisoned老鼠的存活率从20%提升到50%(图6(一))。DPSCs-HGF显著降低肺部炎性细胞浸润,胶原纤维积累(图6 (b))。BALF的结果表明DPSCs-HGF改善肺通透性;同时,炎症和肺组织fibrosis-related细胞因子的表达也证实了更强的免疫调节效应DPSCs-HGF(数字6 (e)和6 (f))。体内的数据按照体外。一些研究人员报道,DPSCs健壮(免疫调节作用61年,62年]。此外,HGF, antifibrotic效应,已应用于许多肺损伤疾病(63年]。这些结果表明,DPSCs和胶质瘤基因治疗提供了一个有前途的新的和有效的治疗方法来保护PQ的肺。

msc移植疗法在临床上的安全总是集中关注的研究人员。迄今为止,发表的临床试验数据证明了msc在不同疾病的安全性和可行性,ARDS包容性(64年]。郑等人表明,低剂量的100万脂肪hMSCs /公斤是耐受性良好1 b阶段试验(65年]。两个临床试验阶段1 (NCT01775774),第二阶段(NCT02097641)是由Matthay等人已经证明BM-MSCs耐受性良好在中度到重度的ARDS患者(66年,67年]。因此,msc可以作为安全的再生医学细胞来源。

因此,我们的研究评估的综合疗效UC-MSCs和DPSCs PQ首次引起的急性肺损伤。我们发现DPSCs有更强的能力,抑制炎症和纤维化BEAS-2B比UC-MSCs MRC-5细胞。此外,电动汽车从msc优于msc的上层清液。DPSCs-HGF可以改善PQ老鼠的生存状态和组织病理学通过抑制促炎和profibrotic细胞因子,促进抗炎和antifibrotic细胞因子在肺组织细胞,这可能是一个可能的机制对PQ诱导的肺损伤的衰减。

5。结论

在这项研究中,我们提供了一个新颖的细胞疗法涉及DPSCs-HGF输血治疗PQ-induced肺损伤。DPSCs-HGF有一个健壮的能力调节炎症和纤维化细胞因子和抑制肺部炎症和肺纤维化。旁分泌机制可以解释他们的治疗和预防效果。这是第一个报告显示DPSCs合适的细胞来源的移植DPSCs-HGF可能是一个有效的方法来防止肺部炎症和肺纤维化的进展。这些发现说明小说策略治疗PQ中毒患者。

数据可用性

所有生成的数据和/或分析在这个研究包括在发表的这篇文章。数据共享不适用本文没有生成数据集或在当前的研究分析。然而,数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的科研项目(没有。BWS17J021)。作者感谢教授Pingkun周提供BEAS-2B细胞作为礼物。

补充材料

DPSCs-EVs数据可以在补充图1。(补充材料)

引用

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