由人类Placenta-Derived CD146的表达和再生细胞因子间充质基质细胞在不同GMP-Compliant媒体扩张

文摘

间充质基质细胞(msc)已经成功地应用于临床应用。在大多数研究中,自体骨髓msc的(bmMSCs)被使用,和其他人使用自体脂肪tissue-derived基质细胞(ADSCs)。最近,临床可行性研究提供的证据表明,msc从人类术语胎盘(pMSCs)可用于同源疗法促进再生细胞在紧急情况下,当自体的细胞不可用或不适合。因此我们研究MSC具备干细胞标记CD146的表达和神经的表达,由人类pMSCs myoregenerative细胞因子在三个不同的媒体扩张后符合良好生产协议(GMP)相比pMSCs扩大商业媒体MSC扩张。取代异型生物质血清GMP-compliant媒体在这项研究中,使用人类血清、人血清+血小板溶解产物(锁相环),或人工等离子体+使用锁相环。我们报告说,浓缩的媒体与锁相环加速pMSC扩散但显著减少了具备干细胞标记CD146的表达,而锁相环剥夺增强CD146的表达。相比之下,CD146的表达减少了锁相环剥夺bmMSCs没有被观察到。细胞因子的表达不是由锁相环调制显著的调查。我们得出这样的结论:加速膨胀pMSCs GMP-compliant媒体丰富了锁相环降低具备干细胞标记CD146的表达,但不影响神经和myoregenerative细胞因子的表达。

1。介绍

CD146是113 kDa主要表达于内皮细胞跨膜糖蛋白。击倒CD146减少内皮细胞迁移和增殖1]。是参与Ca-dependent粘附在解决由外向内信号激酶菲英岛和FAK以及衔接分子桩蛋白(2]。CD146(别名MCAM MUC18等等)也表达了黑色素瘤和白血病细胞作为血管生成的重要标志和癌症(3]。最近,许多研究探讨CD146的表达在间充质基质细胞(msc)骨髓(bmMSCs),脂肪组织(ADSCs),和其他来源的骨再生(4,5),血管的承诺(6[],proangiogenic活动7在骨髓本身[],功能8,9炎症),调制(10- - - - - -12),细胞衰老13),和其他方面3]。CD146 bmMSCs因此被认为是一个多功能的标志少年增殖的祖细胞(13- - - - - -16]。在扩张bmMSCs与10%牛血清中补充,TGFβ1增强CD146的表达但弱智增殖,而FGF2 (= bFGF)减少了表达和激活扩散(6]。相比bmMSCs ADSCs,调节人类术语placenta-derived CD146 MSC-like细胞(pMSCs)是研究较少。以前,我们报道了低CD146的表达pMSCs与降低成骨分化潜能(17)和成骨分化因子的显著差异表达Runx2 [18,19]。此外,我们注意到,在pMSCs CD146的表达,但不是bmMSCs,在一定程度上是受细胞培养条件(20.]。CD146在msc对许多重要的途径,我们现在调查的规定详细pMSCs细胞表面分子。此外,pMSCs最近被使用在临床试验中外源的细胞(21]。在临床情况下,细胞因子的生产使用的msc是他们的再生潜力的关键(22),和msc被用来促进伤口愈合21,23)、调节免疫和炎症(10),调节许多其他病理参数(24,25]。因此,我们调查的影响不同GMP-compliant媒体CD146的表达和表达神经,myoregenerative细胞因子与细胞培养在一个标准化的商业媒介MSC扩张。

2。材料和方法

2.1。隔离和msc的扩张

msc是孤立的从手术浪费人类骨髓的患者假体手术( ,平均67岁),从抽脂的志愿者组织(= 3),或从人类胎盘从健康的母亲在凯撒的交付( ,是说34岁)早些时候发表(17,26- - - - - -28]。简而言之,骨髓与PBS稀释,和单核细胞是由密度梯度离心法分离(470 g×20°C, 20分钟。Ficoll-Paque;通用电气医疗集团),洗净,去籽扩张中如下所述。隔离pMSCs和ADSCs组织切成碎片,消化蛋白质水解(750 U /毫升胶原酶,Sigma-Aldrich;250毫克/毫升Dispase,罗氏公司;37°C, 60分钟。)在温和的运动。添加血清蛋白水解作用停止。细胞被洗和Ficoll-Paque梯度离心法分离,再次清洗,讲究的。获得胎儿(fpMSC)与孕产妇(mpMSCs) pMSCs具体来说,胎盘是切片从羊膜分离子宫内膜部分。孕产妇和胎儿的部分被单独处理如上所述。

细胞扩大商业MSC扩张中(MSCGM、Lonza = LM)或低葡萄糖DMEM培养基(Sigma-Aldrich)辅以GMP-compliant组件:人类血清血清+人类血小板溶解产物(锁相环),或者人血浆+锁相环(表1)、抗生素(笔/喉炎,Lonza),和玫瑰谷酰胺(Lonza)和缓冲(Lonza)所描述的28,29日]。集中批人类血清和锁相环从临床与实验输血医学研究所获得Tuebingen大学医院。锁相环是描述最近准备(30.]。人血浆从TCS获得生物科学(Botolph Claydon,白金汉MK182LR,英国)。除非另有说明,对锁相环感应实验,细胞被扩大到第二段在一个中等大小的w / o锁相环,收割,分成了两组。一组是持续了1、3或7天在同一介质。另一组是由锁相环继续媒介丰富(表1)。相对,锁相环剥夺实验,细胞被扩大了在给定介质存在5%的锁相环,收割,分成了两组。一组是持续了1、3或7天在锁相环中富含5%。另一组是继续增长中没有锁相环(表1)。数据归一化到各自的控制或细胞扩大LM (= 100%)。所有基质细胞群进行调查,以满足MSC入选标准为bmMSCs定义(26]。

确定细胞增殖,msc被扩大到2^nd通道、收获和计算,3 e05细胞/天水瓶被播种 。当达到80%的融合 ,msc收获和统计,扩散计算使用 。

2.2。分析稳态mRNA

mRNA的表达文本探讨了定量rt - pcr(存在)所描述的17]。总之,细胞收获和清洗,RNA是孤立的援助RNeasy工具包(试剂盒)。收益率是由测光(NanoPhotometer IMPLEN),和1的互补脱氧核糖核酸生成μg总RNA使用益生元(dT)启动(RT-for-PCR装备优势,TaKaRa-Clontech)。互补脱氧核糖核酸的量化,进行聚合酶链反应(PCR)使用LightCycler 480 SYBR主设备和硬件是要求的供应商(罗氏)使用以下温度设置:变性94°C,退火60°C,底漆在72°C扩展。引物用于CD146 glycerinaldehyde 3 -磷酸脱氢酶(GAPDH)和γ(PPIA peptidylprolyl异构酶γ)存在表中列出2。目标基因的大量CD146计算采用两个内部标准成绩单GAPDH和PPIAγ作为被罗氏软件(31日]。检测记录编码细胞因子、商业使用引物(试剂盒)。

2.3。通过免疫印迹检测的蛋白质

CD146蛋白检测在细胞溶解产物SDS-polyarcrylamide凝胶电泳(sds - page)和免疫印迹32]。总之,1 e06细胞被轻微的蛋白水解作用采用accutase收获(罗氏)和均质1毫升裂解缓冲(150毫米氯化钠,10毫米Tris-HCl pH值7.4;特里同x - 100 1%;0.1% SDS, 1毫米PMSF) [32]。蛋白质产量是由比色法要求的供应商(直流蛋白质化验设备II, BioRad)。50μ克总蛋白提取被sds - page分离和转移到尼龙膜。膜被封锁5%奶粉在PBS Tween20纯度1%32]。CD146检测到抗体(1:1000年PBS-Tween20 rb-ā-huCD146马伯,Abcam),其次是检测血清(1:300年PBS-Tween20;HRP-labelled gt-ā-rb血清,Dako)和记录通过化学发光(西方确定保险费;Licor)扫描仪(C-Digit Licor)。脱膜后,检测的β肌动蛋白表达作为控制。CD146和信号强度β肌动蛋白是由ImageStudio计算(https://www.licor.com/bio/software)和NIH-Image (https://imagej.nih.gov/nih-image/)软件。

2.4。流式细胞术检测细胞表面蛋白

细胞表面标记物的表达在msc描述被流式细胞术研究[17]。总之,细胞被轻微的蛋白质水解收获(Accutase),水洗,统计,和孵化fluorochrome-labeled单克隆抗体CD14, CD73 (BD Pharmingen)、CD34、CD45 (BioLegend), CD90、CD146(研发系统),或CD105 (AbD Serotec)所要求的供应商。孵化后,细胞被洗和resuspended PFEA缓冲区(PBS, 2%胎牛血清,2毫米EDTA, 0.01%叠氮化钠)对流式细胞仪采用流式细胞分析仪(LSR II, BD生物科学)17]。细胞培养与一个同形像抗体和COMP珠子(BD)作为控制。的平均荧光强度(MFI)染色和流式细胞仪数据计算软件(BD生物科学),然后由流式细胞仪天后处理FlowJo 10.3.0 (Treestar)软件准备数据。

2.5。统计数据

实验数据处理数据表格应用(Excel,微软)。统计学意义是计算一个双边无偏 - - - - - -测试。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。CD146的表达在bmMSCs与pMSCs扩张不同GMP-Compliant媒体

在第一组分析,bmMSCs pMSCs从胎儿(fpMSCs)或产妇(mpMSCs)的部分术语胎盘在三个不同的GMP-compliant扩张扩大先验媒体补充与等离子体加锁相环,血清加锁相环,或血清。CD146的表达被流式细胞术枚举(图1)。CD146的表达没有不同bmMSCs扩大媒体包含人类血清或血浆中丰富了锁相环相比,媒体补充血清,和CD146的平均荧光强度(MFI)被记录在1900年到2500年(图的范围1)。相比之下,对于fpMSCs mpMSCs、锁相环丰富扩张中CD146表达减少。在媒体辅以血清,fpMSCs以及mpMSCs CD146表达比在媒体扩张后以锁相环作为补充。fpMSCs扩大与血清中补充只有达到CD146水平测量bmMSCs在同一介质(图1)。在另一项研究中CD146的表达在pMSCs探索从4额外的捐助者在LM或扩大GMP-compliant DMEM培养基血清和丰富的补充,由锁相环。在LM pMSCs扩大,CD146的小额信贷机构 ,和75%的细胞被封闭的积极。相比之下,在GMP-compliant DMEM媒体丰富了血清加锁相环,CD146的小额信贷机构( , 每一个; )和细胞的百分比的把关积极(59%; )明显降低(没有显示)。这证实了我们先前的研究[17,20.]。锁相环的除了扩大媒体pMSCs CD146的健壮的减少引起的,我们研究了锁相环的影响人类pMSCs CD146表达的更多细节。

3.2。锁相环的影响在pMSCs CD146的表达上

在第二组实验中,我们比较了锁相环对CD146表达在不同的媒体组合(图2)。为此,pMSCs体外扩大到第二段体外LM或GMP-compliant媒体富含人类血清只有10%。值得注意的是,人类msc没有生长在培养基补充与等离子体(没有显示)。然后,文化被分裂,一组是维持7天在同一介质(即。、LM、血清DMEM + 10%)。另一组在锁相环的存在扩大为7天,即在LM +血清DMEM锁相环或5% + 5% + 5%的锁相环,分别。的表达CD 146年探索通过流式细胞术和存在(图2)。CD146的表达明显减少的表达在细胞表面上增加锁相环在LM pMSCs扩展( , )或者在DMEM +血清( ;图2(一个))。成绩单上的观察同样的趋势水平( ,图2 (b))。

相反,当pMSCs最初扩大体外DMEM媒体富含血清加锁相环的锁相环,然后剥夺了进一步扩张的细胞在DMEM媒体富含血清,MFI CD146的表达显著增加( , ;图2(一个))。增加CD146成绩单数量也出现在细胞从血清DMEM + +锁相环只血清DMEM + ( ,图2 (b))。没有增加被认为当细胞从DMEM +等离子+锁相环只血清DMEM +(图2)。值得注意的是,整个CD146表达水平不同的细胞在DMEM最初扩大+血清(MFI 2072或1697)相比,pMSCs最初的扩张在DMEM +等离子+锁相环锁相环不足和进一步扩大在DMEM +血清(MFI 5720)。CD73的表达,CD90 SUSD2 pMSCs培养在不同的媒体上分析了流式细胞术,但PLL-dependent显著差异并没有指出(没有显示)。

3.3。动力学调控CD146的锁相环

调查的时间线PLL-mediated CD146的监管,pMSCs扩大LM第二通道和分裂。锁相环(5%)增加了对1、3、7天,CD146的表达是通过流式细胞仪记录在细胞表面,通过免疫印迹来确定总蛋白质含量和转录水平上存在(图3)。CD146 MFI的轻微减少细胞表面观察早在1和3天后锁相环通过流式细胞术。然而,7天后,观察CD146染色显著下降( , ,图3(一个))。大幅下降后7天总CD146蛋白质的锁相环加成以及通过免疫印迹( , ,图3 (b))。监管CD146在转录水平发生明显的动力学。显著下降CD146编码记录枚举早在一天前,锁相环加成( , )。然而,接下来的几天内记录数量增加。稳态记录大量编码CD146仍低于水平记录在pMSCs之前的锁相环(图3 (c))。我们得出这样的结论:锁相环在一定程度上调节CD146表达的转录水平。

3.4。锁相环对pMSCs的增殖和细胞因子表达的影响

CD146的表达在msc增殖能力,我们列举的有丝分裂活动pMSCs媒体富含锁相环相比,相同的媒体没有锁相环。在所有组合调查,饥饿的锁相环推迟细胞增殖,而锁相环的加入加速扩散pMSCs(图4)。这证实了我们之前的研究采用人类bmMSCs [28]。我们得出这样的结论:锁相环提高了人类的扩散pMSCs GMP-compliant媒体所需(pre -)临床研究,但它减少CD146的表达。因此,锁相环会间接影响人类pMSCs“具备干细胞”。

接下来,转录水平编码神经——myoregenerative bmMSCs细胞因子进行了探讨,ADSCs, fpMSC, mpMSCs,扩张后GMP-compliant媒体(图5)。主要区别bmMSCs ADSCs, pMSCs也不突出,并未观察到锁相环的影响在一个单独的细胞因子的调节。的因素参与肌细胞生成和血管化的表达,肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子2 (IGF-2)、血管内皮生长因子(VEFG)、转化生长因子β1 (TGF -β1)、基本成纤维细胞生长因子(BFGF),分别达到杰出的记录水平。参与本次记录编码因素,神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)枚举低约100倍,甚至胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)是低于其他因素(图3 - 5日志5)。血清和锁相环富含细胞因子,细胞因子释放的细胞不是文化探索的上层清液。

4所示。讨论

粘附分子的表达CD146 pMSCs调制锁相环中包含的因素,在bmMSCs,锁相环没有调节这种“具备干细胞标记物的表达。“因此,媒体的构成用来生产pMSCs (pre -)临床用途是生产bmMSCs相比更重要。CD146的表达升高msc与分化能力,扩散,端粒酶活性(13]。在一些细胞,激活TNF - CD146的表达α,在其他endothelin-1 il - 1、IL-13 TGF -β,或者神经生长因子(3]。锁相环包含PDGF的igf - 1, TGF -β年代,和其他细胞因子(33),这表明这些因素有助于CD146的规定。所有的媒体组合调查在我们的研究证明,锁相环干细胞标记CD146的表达减少。这表明PLL-but中包含的因素可能不是TNF -α监管CD146 pMSCs。

葡萄糖和细胞内钙^{2 +}离子通过升高显示激活CD146发起人阵营,因此再次促进CD146表达(3]。然而,锁相环的影响观察在所有媒体独立调查。在人血浆( mg / dL)与血清( mg / dL),类似的Ca^{2 +}据报道[浓度34),这表明Ca^{2 +}信号不是CD146规定主要涉及的观察。同样,葡萄糖浓度在DMEM基本媒体(100 mg / dL),人类血液(80 - 120 mg / dL),等离子体(70 - 130 mg / dL),或血清(25 - 250 mg / dL)是在相同的范围。因此,我们得出这样的结论:葡萄糖不pMSCs theCD146表情发挥重要作用。然而,等离子体含有纤维蛋白原,可溶性纤维蛋白原可能通过激活细胞整合素ß1——或者β2-integrins和NF -κB信号(35,36]。体外纤维蛋白原调制MSC增殖和分化。Fibrin-modulated基因表达在msc被报道37,38]。因此,纤维蛋白原的含量或纤维蛋白在MSC扩张媒体可能调节CD146的表达。此外,使用批处理和准备协议的依赖,锁相环含有不同数量的bFGF [33]。bFGF增强bmMSC增殖和抑制CD146表达(6,8,16]。在这项研究中观察到的影响符合bFGF的影响报道。因此,我们得出这样的结论:bFGF可能导致CD146的监管pMSCs bmMSCs相比,以不同的方式。突出bFGF的表达被记录在pMSCs扩张在同一个GMP-compliant媒体使用这里(没有显示)。

如今,大多数策略采用msc在临床前或临床研究认为这些细胞来源增强生产再生的因素和免疫调节(12,22,39,40]。然而,物种,组织,和donor-dependent差异观察细胞因子的生产。在老鼠中,激活CD146^负的msc表达更多的il - 6与CD146相比^pos细胞,分泌的TGF -β1保持不变在激活(12]。CD146^负的msc引起显著激活Th17 T-leukocytes和增强一个实验性炎症动物模型。相比之下,CD146^pos改善炎症细胞(12]。可拆卸的CD318 CD318表达式^pos/ CD146^负的基质细胞升高引起g - csf的生产,il - 1β,引发和其他人,而il - 6和vegf是没有改变41]。浓缩的CD146^低细胞的扩张pMSC锁相环媒体可能因此在一定程度上减少再生潜力的临床情况。这可能是有关MSC分化时考虑。然而,目前很多研究表明msc体内的主要行动与释放的因素促进伤口愈合,调节炎症,促进血管化(22,40]。的mRNA表达我们的研究表明,伤口愈合的关键细胞因子参与调控,肌肉和神经再生和血管生成没有显著差异当bmMSCs, ADSCs, fpMSCs, mpMSCs扩大无锁相环的存在(42]。

作为pdgf锁相环十分丰富,igf - 1, tgf信号(33),我们没有执行分析细胞因子释放的msc在锁相环媒体。我们认为锁相环和文化条件会导致此类研究的重大偏差。此外,细胞内细胞因子的调查数量超出了本研究的重点,因此没有探索。这项研究的另一个局限性是bmMSCS是从老年人获得捐助者在胎盘获得相对年轻的母亲。因此,精确匹配的供者性别和年龄当然是不可能的。此外,改变细胞的造型是由microscopy-seem更依赖时间的体外文化和人口倍增,在较小程度上的复合媒体调查。人类胎盘来有明显的优势。

msc可以隔绝人类胎盘只有一些伦理问题和一个相当大的血管和组织。这个收益率许多体外细胞从一个样本,需要更少的扩张来生成所需的细胞。胎盘中含有“年轻细胞”长调聚物促进体外延长扩张没有复制衰老(风险升高19]。最后,他们的隔离收益率捐赠者没有缺点。

骨骨髓来源msc的特点是高水平的“具备干细胞标记”CD146表达在体外细胞因子模式没有显著不同于pMSCs CD146表达明显减少。bmMSCs倾向于接受体内骨与更高的疗效相比pMSCs [17- - - - - -20.,43),pMSCs可能在不同的应用程序和一个了不起的替代bmMSCs细胞疗法,包括方案为当地持续释放生长因子。

5。结论

丰富GMP-compliant媒体通过锁相环激活pMSCs扩散。在临床情况下,这有助于更快地扩张pMSCs所需的数据的应用程序。尽管干细胞标记CD146的表达减少锁相环在pMSCs所有媒体组合调查,这里所述的细胞因子的表达没有明显改变。作为pMSCs已获批准的可行性研究同种异体的接受者,pMSCs可能成为一个有趣的候选细胞治疗各种各样的疾病。

缩写

ADSC:	atMSC脂肪tissue-derived基质细胞,别名
bmMSC:	来源于MSC的骨头
流式细胞仪:	荧光激活细胞分类
fpMSC:	胎儿pMSC
GMP:	良好生产协议
LM:	Lonza介质,MSC生长培养基从Lonza (MSCGM)
mpMSC:	孕产妇pMSC
硕士:	间充质基质细胞和间充质干细胞
锁相环:	(人类)血小板溶解产物
pMSC:	(人类)placenta-derived MSC
SUSD2:	粘附分子与癌症和干细胞bmMSCs标记。

数据可用性

所有的数据都包含在本研究可从WKA同事研究合理的请求。

附加分

高光。(我)的扩张pMSCs媒体丰富的锁相环可以提高细胞扩张但减少具备干细胞标记CD146的表达。(2)神经,myoregenerative细胞因子的表达不是调制pMSCs锁相环。(3)的锁相环补充GMP-compliant扩张媒体加速生产pMSCs (pre -)临床情况

的利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

FP、HDEG和BM进行了实验。助教进行实验、培训和实验监督学生,和数据评估。公顷导致提供组织样本和批判性回顾手稿。WKA进行研究设计、数据评估、写作手稿,和资金。

确认

我们感谢助产士和医生在妇产科中心UKT pMSC隔离提供组织样本,部门的手术团队在BG医院创伤学Tuebingen提供骨髓,脂肪组织和居民皮肤科医生。我们表达我们的感谢皮肤科部门UKT便利地获取BD LSR II的流式细胞术在数据处理和专家支持。我们感谢Kourosh c输入的同时,卢卡斯胡贝尔,贝蒂娜·m·穆勒和亚历山大Pilz msc文化和查Goziga准备作品。DFG拨款支持的研究部分WKA (KFO273 # Ai16/27-1)和部分机构基金。

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