锂和铜诱导骨髓间充质干细胞的Osteogenesis-Angiogenesis耦合通过规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路

文摘

骨生成和血管生成dual-delivery跟踪element-carrying生物活性支架和干细胞骨再生和修复是一种很有前途的方法。规范化Wnt和HIF-1α信号通路是至关重要的bmsc的成骨分化成骨及分泌的因素,分别。同时,锂(李)和铜(铜)可以激活规范Wnt和HIF-1α信号通路。此外,新兴证据表明规范化Wnt和低氧诱导因子信号通路相关耦合骨生成和血管生成。然而,目前尚不清楚锂和copper-doped生物活性支架是否能诱导骨生成和血管生成的耦合bmsc和底层机制。我们制作的锂-(李⁺-)和铜-(铜^{2 +}2.5 -)掺杂有机/无机(李铜1.0公顷/坳)支架评价耦合骨生成和血管生成锂和铜对bmsc的影响,进一步探讨其机制。我们调查,持续释放的李锂和铜2.5铜1.0公顷/坳支架可以两骨生成和分泌angiogenesis-related因素bmsc播种。此外,我们的研究结果显示,500年μ李米⁺可以激活规范Wnt信号通路和救援xav - 939抑制。此外,我们证明了25μ立方米^{2 +}类似于1%的氧气环境激活HIF-1的有效性α信号通路。更重要的是,李的组合刺激⁺和铜^{2 +}可能会进一步骨生成和血管生成过程和移植骨,angiogenesis-related基因表达规范化Wnt和HIF-1之间通过相声吗α信号通路。总之,本研究显示,锂和铜可以规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路两骨生成和血管生成在bmsc可持续释放时Li-Cu-HA /坳脚手架。

1。介绍

超过160万人获得骨移植,因为肿瘤切除,病理变形、先天性变形、运动损伤和感染治疗每年在美国(1]。批评-大小的骨缺损的修复仍是一个真正的挑战在骨科领域(1,2]。目前,干细胞组织工程骨缺损的重建是可行的,不断发展战略来恢复(结构和功能3]。骨髓间充质干细胞(bmsc),骨再生的种子,可以分化为成骨细胞和分泌血管生成因素促进骨再生(4- - - - - -6]。因此,bmsc两骨生成和血管生成过程有潜力。同时,微量元素被认为是骨者因其稳定的释放动力学,在生物环境中,更好的稳定和低成本(7]。它已经表明,许多微量元素可以促进骨生成或血管生成在骨再生7]。因此,微量元素释放的生物活性支架两骨生成和血管生成的bmsc在骨组织再生成为一个有前途的治疗策略。

骨生成的bmsc涉及许多分子信号通路和规范化Wnt信号通路已被证明是其中之一。Wnt信号起着重要的作用在骨骼发育,体内平衡,成骨细胞分化和骨形成8]。可以通过抑制Wnt信号通路激活规范锂GSK3的活动β,从而抑制磷酸化和退化β连环蛋白(9]。积累β连环蛋白被运送到细胞核骨生成基因的转录(Wnt目标基因)绑定到T细胞因子/淋巴enhancer-binding因子(TCF /中位数)转录记者(10]。近年来,一些研究表明,规范Wnt信号通路的激活可以促进骨髓间充质干细胞的迁移和增殖,脂肪干细胞、成骨的differentiation-related基因(Runt-related转录因子2,osterix等)表达(11,12]。此外,锂支架可以刺激骨髓间充质干细胞的成骨,提高骨再生通过Wnt信号通路的激活规范(13,14]。因此,锂可以作为一个有前途的生物活性微量元素,促进骨生成的过程。

血管生成的过程中生理和病理生理的方式激活的HIF-1高度相关α信号通路(15,16]。越来越多的证据已经表明,低氧诱导因子1的表达α(HIF-1α)间充质干细胞提高VEGF表达和分泌促进血管形成的(17]。铜、人体必需的微量元素,可以抑制prolyl HIF-1羟基化α由prolyl羟化酶稳定HIF-1(博士)α表达式[18]。同时,铜充当FIH-1生理抑制剂抑制HIF-1(羟化酶或因素α)[18]。富士康已经被证实能抑制HIF-1α的与代数余子式的交互SRC-1 CBP, p300然后降级HIF-1的表达α目标基因(VEGF、Glut1等。)18]。此外,含铜支架可以移植血管生成因子水平和增强通过激活HIF-1骨缺损愈合α信号通路(19]。因此,铜是有前途的血管化组织工程骨的诱导物。

有趣的是,有解不开的和广泛的规范化Wnt和HIF-1之间的连接α信号通路。凯迪和她的同事们发现β连环蛋白可以作为一个cotranscription因素与HIF-1绑定α和促进HIF-1的表达α信号通路下游基因(20.]。虽然HIF-1的角色αWnt信号通路中的仍然是有争议的。在神经发生和双相情感障碍,Valvezan和克莱因HIF-1报道α促进Wnt目标基因表达在干细胞(21]。然而,在结肠癌,hypoxia-activated HIF-1α抑制β-catenin-T细胞4 (TCF-4)复杂的形成和缺氧(转录活动20.),而是否规范化Wnt和HIF-1α信号通路激活锂和铜可以夫妇和增强osteogenesis-angiogenesis bmsc仍不清楚。

在这项研究中,我们制作的锂-(李⁺-)和铜-(铜^{2 +}-)掺杂有机/无机(Li-Cu-HA /坳)支架对耦合osteogenesis-angiogenesis探索他们的影响。然后,我们筛选最优锂和铜的浓度来评估他们的能力作为一个规范化Wnt和HIF-1受体激动剂α信号通路。最后,我们调查了osteogenesis-angiogenesis耦合能力bmsc的聚集有关下最优锂和铜浓度和探索底层机制。

2。材料和方法

2.1。bmsc的隔离和表征

bmsc被隔绝6-to-8-week老Balc / c小鼠。从小鼠股骨和胫骨解剖,骨髓是刷新与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;美国HyClone)。通过70年骨骨髓来源的细胞被过滤μm细胞收集的过滤器(美国BD猎鹰)和离心10分钟的250克。Resuspend细胞2毫升Ammonium-Chloride-Potassium裂解缓冲(Beyotime,中国),并添加6毫升DMEM 5分钟后停止反应。然后,离心机在250 g 5分钟获得bmsc,细胞在DMEM培养,补充10%胎牛血清(美国Invitrogen-Gibco)和1% ( )抗生素、抗真菌的(美国Invitrogen-Gibco)。当细胞融合增长到80%,0.25%胰蛋白酶(美国Sigma-Aldrich)是用于通道细胞。

伴着被播种到6-well盘子和完全培养基中培养。根据制造商的指示,成骨和脂肪形成的诱导刺激通过使用商业套装(Cyagen,中国)。骨生成效果检测到茜素红染色(ARS;Sigma-Aldrich)后三星期的感应,油红O用于脂肪形成的检测后三星期的感应。Chondrogenic分化诱导使用micromass文化技术。bmsc收集和清洗三次chondrogenic感应介质(中国Cyagen)在350 g离心5分钟。颗粒是在0.5毫升chondrogenic诱导培养基培养15毫升管。2天之后,颗粒被略管的底部。媒介是每两天更换一次,小球是28天的培养。被阿尔新蓝染色检测软骨形成影响。

2.2。茜素红、油红O、阿尔新蓝染色

茜素红染色法培养细胞,伴着洗了1×磷酸盐(PBS)和10%的福尔马林固定的20分钟。然后,细胞在自来水洗前三次染色茜素红溶液(美国Sigma-Aldrich) 15分钟。最后,细胞再洗了三次自来水,在倒置显微镜下观看(Eclipse TS100尼康,美国)。

油红O染色法培养细胞,伴着洗了1×PBS和10%的福尔马林固定的20分钟。然后,细胞在自来水洗了三次与油红O染色之前解决方案(美国Sigma-Aldrich) 15分钟。多余的污点被用70%乙醇洗涤三次。最后,细胞用稀释水再洗3次,在倒置显微镜(Eclipse TS100尼康,美国)。

阿尔新蓝染色,颗粒产生的组织文化是在10%的福尔马林固定2 h,然后洗两次1×PBS前阿尔新蓝的0.1%股票的解决方案。在室温下30分钟孵化后,染料溶液被和结构用蒸馏水洗净。此外,染色结果记录在倒置显微镜(Eclipse TS100尼康,美国)。

2.3。制造的锂和Copper-Doped羟磷灰石/坳脚手架(Li-Cu-nHA /坳)

我们首先合成锂,copper-doped羟磷灰石(李2.5铜1.0公顷)粉末通过微波水热法(22]。李2.5铜1.0公顷粉准备如下:Ca(没有₃)₂h·4₂O和NH₄H₂阿宝₄(奥尔德里奇化工、美国)溶解在去离子水分别形成0.1米和0.06米的解决方案。然后,添加漆布₃和铜(不₃)₂固体与李设计/(李+铜+ Ca)和铜/(李+铜+ Ca)的摩尔比率0.025和0.01,分别形成了混合解决方案。随后,混合溶液的pH值和北半球₄H₂阿宝₄解决方案被NH缓冲接近12₃·H₂啊,然后,把NH调整₄H₂阿宝₄解决方案为Ca(没有₃)₂h·4₂啊,慢慢的解决方案。然后,上述决议转移到反应釜(60毫升)并在微波炉中加热(中国Sineo MDS-6) 120分钟在130°C。离心收集的产品冷却后,洗了三次用去离子水和乙醇溶液,然后干60°C。获得的产品贴上李2.5铜1.0公顷。

李的多孔陶瓷结构2.5铜1.0公顷生产和设计使用H₂O₂发泡法(23]。大约100克的李2.5铜1.0公顷粉,7.5毫升的纤维素,25毫升的H₂O₂7.5毫升的聚乙烯醇(PVA)和60毫升的去离子水混合而形成一个陶瓷泥浆。这种泥浆在微波炉加热2分钟生成气体,然后成型得到多孔陶瓷支架。之后,脚手架在80°C 12 h,干后烧结升温速率的5°C·分钟¹6 h到1200°C,然后,陶瓷在炉冷却至室温。所有的样品都切成 气缸,阿基米德原理方法被用来测试烧结李2.5铜1.0 ha支架的孔隙度。

然后,我们使用了真空灌注方法,被周et al .,建立李2.5铜1.0公顷/坳支架根据“实体”强化理论(23]。我们分散I型胶原蛋白(σ化学、美国)到1.5模拟体液(SBF)解决方案在10 g·毫升¹浓度为20 g·毫升¹使用5%,调整·¹醋酸的pH值从4.0到6.5不等。之后,支架完全沉浸到I型拼贴解决方案和密封在高压容器。然后,真空注入压力的10 Pa被用来填补拼贴我解决方案在多孔李2.5铜1.0 ha支架,持续2 h允许完整的陶瓷材料的饱和。超声振动和重复过程进行了真空灌注。最后,李2.5铜1.0公顷/脚手架上校在-20°C和无菌冻干γ射线(⁶⁰有限公司)的剂量25 kGy的1 h使用。

2.4。描述Li-Cu-HA /坳的脚手架

支架的化学成分进行了分析,傅里叶变换红外光谱(红外光谱;PerkinElmer谱一个B,美国)4000厘米的扫描⁻¹到500厘米⁻¹。单轴压缩测试的力学性能进行了调查哈,李2.5铜1.0公顷,和李2.5铜1.0公顷/坳支架使用万能力学试验机(Shimadzu-Series AGS-IX,日本)。简单地说, 滚筒支架固定在测试。然后,我们使用了满载排水量测量获得的应力-应变曲线通过10 kN负载细胞十字头的速度0.5毫米·分钟¹。在那之后,我们得到了最大抗压强度(最大负载)通过应力-应变曲线。此外,支架的使用扫描电子显微镜观察微观结构表征(电子有限公司、日本)。

李的孔隙度2.5李铜1.0公顷和2.5铜1.0公顷/坳支架是由使用阿基米德原理方法决定的。我们测量三种权重( , ,和 )在不同条件下。是干燥的样品的质量(30分钟真空处理),是饱和的质量样品称重,然后呢明显的质量饱和液体样品称重。然后,我们使用方程(1)计算孔隙度。

solution-mediated降解支架的性能进行了测试在模拟体液(SBF)。2.5公顷/坳和李铜1.0公顷/坳支架( ,每个浓度)被放置在干净的瓶瓶,完全沉浸在SBF 5毫升。然后,瓶子密封,放入37°C水洗澡恒温振荡器、和SBF每3天刷新。支架是在指定的时间间隔为2,4、7、10、14、17、21日,28日和30天。一种过时的释放介质收集测量电离/铜/磷酸锂浓度。

2.5。Live-Dead细胞染色和MTS试验的bmsc Cocultured脚手架

BMSC播种之前,所有的支架都浸泡在培养基为24小时37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。P3 bmsc被播种一滴一滴地移除培养基后支架上。随后,梗塞部位支架被保持在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂2 h,允许细胞附着在支架。最后,梗塞部位支架在培养基培养。

支架上的细胞增殖率的bmsc测量使用CellTiter 96®AQ_ueous一个解决方案细胞增殖试验设备(美国Promega) 1天,3,5,7个时间点。的BMSC coculture支架与PBS和孵化200洗两次μ+ 800 l MTS的解决方案μ为3 h l培养基湿润孵化器。之后,培养基的吸光度是读通过协同™Mx Monochromator-Based多模标仪(美国BioTek仪器,Inc .)在490海里。

coculture支架与P3 bmsc后3天,Live-Dead细胞染色工具包(calcein-AM / PI双染色设备,台湾、中国)被用于检测死细胞。BMSC coculture支架被洗两次与PBS和沾Live-Dye(活细胞的绿色荧光染料, )和碘化propidium(π,红色荧光染料, )。孵化后15分钟在37°C,用荧光显微镜观察生活和死细胞(TCS SPS徕卡、徕卡、德国)。

2.6。ELISA对细胞因子检测

考虑示例培养基在3000转离心管,离心10分钟4°C。收集上层介质和使用冻结在-80°。碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN), VEGF蛋白浓度培养基使用酶联免疫吸附试验检测设备(宝来生物技术,中国)。测试每治疗进行五个样品,根据制造商的协议。

2.7。细胞增殖MTS试验和细胞计数

bmsc在P3培养在不同干预措施1、3、5、7天。然后,CellTiter 96 r AQ_ueous一个解决方案(美国MTS Promega公司)添加到每个在1:10培养基稀释。孵化后4小时37°C和5%的公司₂加湿空气,吸光度测量在490 nm标(美国分子设备)。同时,BMSC数字计算通过使用Cellometer迷你自动细胞计数(美国Nexcelom生物科学)在7天。

2.8。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫印迹(WB)分析

提取的总RNA随后使用RNeasy迷你设备制造商的指示后(美国试剂盒)和reverse-transcribed互补使用上标IV逆转录酶(美国热费希尔)。RT-qPCR是ABI StepOnePlus™工具(美国应用生物系统公司)使用SYBR®预混料交货Taq™(豆类、日本)。每个RT-qPCR使用六个独立的生物样品分析。相对mRNA表达水平计算使用方法,glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为辅助控制。使用的引物RT-qPCR补充表中列出1。

西方墨点法,bmsc与radioimmunoprecipitation收获分析裂解缓冲(美国σ)补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ1:100年,美国)。蛋白质浓度测定使用分析工具(美国热费希尔)根据制造商的指示。的表达载体NuPage®Novex®凝胶体系在4 - 12%用于蛋白质分离Bis-Tris蛋白质凝胶在200 V 50分钟。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜通过iBlot™传输堆栈。膜被封锁在TBST 5%脱脂牛奶(tris-buffered盐的混合物(美国热费希尔TBS)和0.1%吐温20(美国热费希尔渐变))1 h,其后孵化主要抗体(TBST在1%脱脂牛奶稀释0.1%)一夜之间在4°C。洗后,膜被孵化与HRP-conjugated二级抗体(美国Abcam)为1.5 h在室温下,用0.1% TBST洗净,成像与ChemiDoc™触摸成像系统(美国Bio-Rad)。抗体补充表中提供的信息2。

2.9。染色质免疫沉淀反应(芯片)

染色质免疫沉淀反应(芯片)测定了如前所述[24]。简单地说,这些细胞被孵化1%甲醛10分钟37°C DNA蛋白质交联。这后,收集细胞和细胞溶解在十二烷基硫酸钠溶解缓冲区,和200 - 1000个基点DNA片段获得通过使用布兰森声波降解器450(美国宾夕法尼亚州)在下列条件:六次15秒的时间。使离心后,上清液含染色质是稀释100倍,和一个整除(2%体积)是用来表示输入DNA量在每个样本。剩下的染色质提取与反孵化β连环蛋白,anti-HIF-1α和anti-IgG(负控制)在一夜之间使用鲑鱼精子DNA /蛋白琼脂糖珠在4°C温柔旋转。交联是逆转4 h在65°C和随后蛋白酶K消化。DNA纯化了一个标准的酚/氯仿法,反转录酶,进行实时PCR。引物序列补充表中是可用的2。

2.10。免疫荧光染色(如果)

如果分析培养细胞,bmsc与10%福尔马林固定15分钟。Permeabilize细胞为0.1%。然后,他们被封锁在PBS 5%牛血清白蛋白在室温下30分钟。疣状进行使用的主要抗体β连环蛋白和VEGF和二级抗体免疫球蛋白兔子和老鼠。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。使用荧光显微镜图像捕获(TCS SPS徕卡、徕卡、德国)。

2.11。统计分析

GraphPad Prism 7.0软件(圣地亚哥,CA)是用于统计分析。给出的数据 (SE)。单向方差分析是用于多组之间的比较结果,紧随其后的是每个使用图基两组之间的比较分析。表明值< 0.05,表明值< 0.01,表明值< 0.001。

3所示。结果

3.1。bmsc的识别

描述细胞分离的依从性方法,我们发现了成骨、脂肪形成,软骨形成潜力和表面标记的小鼠骨髓间充质干细胞(bmsc)。茜素红、油红O和阿尔新蓝染色结果显示,bmsc成骨、脂肪形成,软骨形成分化潜能(数字1(一)- - - - - -1 (c))。细胞积极表达CD29、CD44和CD90,虽然对CD11b不利,CD34、CD45,与干细胞的特性(数据一致1 (d)- - - - - -1(j))。

3.2。Li-Cu-HA /坳支架具有良好的物理化学性质

我们成功地利用微波水热法制造Li-Cu-HA /坳脚手架。红外光谱结果表明,陶瓷粉(哈,李2.5公顷,铜1.0公顷,和李2.5铜1.0公顷)有吸收峰的羟磷灰石,和李2.5铜1.0公顷/坳粉末也介绍了胶原蛋白的吸收峰(图2(一个))。之后,我们建立了李2.5李铜1.0公顷和2.5铜1.0公顷/坳支架由发泡的孔隙度和真空灌注方法,发现李铜1.0公顷(2.5 )明显高于李2.5铜1.0公顷/坳( )脚手架,这反映了更高的压实的李2.5铜1.0公顷/坳。同时,李2.5铜1.0公顷/坳也优越的机械强度李铜1.0公顷和2.5公顷支架(图2 (b))。在组织层面上,李2.5铜1.0 ha陶瓷的孔隙大小是200μm - 400μ(数据2 (c)(1)),我来填补的真空灌注过程迫使胶原蛋白的陶瓷多孔矩阵(图2 (c)(2)、(3)和(4))。支架降解实验,李⁺、铜^{2 +}李,和磷酸盐离子缓慢释放2.5铜1.0公顷/坳脚手架。由于胶原蛋白的吸附表面的陶瓷支架,微量元素和磷酸盐离子的释放率是相对缓慢的早期阶段。然后,释放速率逐渐增加,达到一个稳定的速率(图7天之后2 (d)),而,HA /坳脚手架相比,磷酸离子释放李2.5铜1.0公顷/坳支架被显著降低。

3.3。Li-Cu-HA /坳支架可以促进骨生成和血管生成的过程

优良的物理和化学性质的基础上李2.5铜1.0公顷/坳,我们进一步探讨了支架的生物相容性和成骨的血管生成属性。正如所料,李2.5铜1.0公顷/坳支架促进bmsc的扩散和福利bmsc的活力(数字3(一个)和3 (b))。此外,bmsc分泌骨生成的能力-(高山,OCN)和血管生成(VEGF)相关因素显著增强当cocultured李2.5铜1.0公顷/坳支架体外(图3 (c))。

3.4。锂(500μ米)可以抑制Wnt信号通路中解救出来

获得洞察规范化Wnt信号通路中的锂的作用,我们研究了扩散bmsc的刺激下锂和进一步探讨是否最优锂浓度可以有效地抑制Wnt信号通路中解救出来。低浓度的李⁺(125μm - 1毫米)被证明是有益的bmsc的扩散,500μM是刺激的最佳浓度,证实了MTS试验(图4(一)(图)和细胞数量4 (b))。重要的是,500年μ李米⁺可以在bmsc Wnt信号通路激活规范。RT-qPCR和免疫印迹分析显示β连环蛋白和osterix表达增加,pgsk3β急剧下降的bmsc的刺激下500μM锂(数据4 (c)和4 (d)1、酒吧和酒吧2)。值得注意的是,锂(500μ米)可以拯救10的抑制作用μM xav - 939在bmsc规范化Wnt信号通路。在500μM锂和10μxav - 939聚集有关组织的表达β连环蛋白、osterix和pgsk3β相似的Wnt信号pathway-activated集团(数据吗4 (c)和4 (d)2、酒吧和酒吧比10。3)μxav - 939刺激组的表达β连环蛋白和osterix bmsc结合集团大幅升高。与此同时,pgsk3β显著降低(数据4 (c)和4 (d)3、酒吧和酒吧4)。此外,我们得到了类似的结果在免疫荧光染色β连环蛋白在不同刺激下bmsc(图4 (e))。

3.5。25μ铜米是激活HIF-1一个合适的浓度α信号通路

确定铜在HIF-1中扮演的角色α信号通路,我们检查了VEGF表达的刺激下bmsc的铜。进一步,我们研究了铜的功效HIF-1的激活α信号通路。铜离子浓度较低(5μm - 100μ米)能促进VEGF表达,25岁μ米铜离子有相同的功效与1%氧微环境刺激VEGF的分泌(图5(一个))。此外,铜的刺激下,HIF-1的表达α和VEGF明显比对照组(透露数据5 (b)和5 (c)1、酒吧和酒吧2),和他们的表达水平相当于1%低氧环境(数字5 (b)和5 (c)2、酒吧和酒吧3)。此外,我们得到了类似的结果在免疫荧光染色bmsc的VEGF在不同的刺激(图5 (d))。

3.6。锂和铜聚集有关能促进骨生成和血管生成通过规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路

之前的研究已经显示,规范化Wnt和HIF-1α信号通路有解不开的和广泛的连接(20.,21,虽然我们发现,500年μ李米⁺和25μ立方米^{2 +}能有效地激活规范Wnt和HIF-1吗α信号通路在bmsc,分别。然而,锂和铜能否夫妇和增强骨生成和血管生成和底层机制仍然未知。因此,我们使用了500年μ李米⁺和25μ立方米^{2 +}costimulate bmsc,发现钙结节和VEGF-positive表达细胞的数量与500年相比显著增加μ李米⁺或25μ立方米^{2 +}刺激(图6(一))。同时,RT-qPCR和免疫印迹显示骨-(高山,osterix)和血管生成(VEGF)相关因素coculture组显著增加(数据6 (b)和6 (c))。所有这些表明,骨生成和血管生成能力的bmsc聚集有关组增强。此外,凯迪等人报道β连环蛋白可以结合HIF-1α促进VEGF和过剩1表达[20.]。和HIF-1广域网等人报道α可以绑定到osterix启动子区域,促进成骨细胞分化在msc (25]。所以,我们使用的芯片分析证明了osterix HIF-1基因启动子区域明显α浓缩聚集有关组和下25μ立方米^{2 +}在bmsc(图6 (d)3、酒吧和酒吧,酒吧1)。同时,有β连环蛋白浓缩聚集有关组中VEGF促进地区和500年μ李米⁺在bmsc(图6 (e))。因此,锂和铜的聚集有关规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路的bmsc的耦合,提高骨生成和血管生成。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,微量元素(锂、镁、锌、铜等)释放生物活性支架可以促进骨生成或血管生成在骨再生7,13,26]。增加的证据显示,dual-delivery支架可以两骨生成和血管生成促进骨再生27,28]。我们最近发现锂和铜可持续释放羟基磷灰石/胶原支架(李2.5铜1.0公顷/坳)可以促进骨生成的表达式,当cocultured bmsc angiogenesis-related因素。这表明锂和铜两bmsc的骨生成和血管生成。因此,澄清机理耦合骨生成和血管生成的锂和铜bmsc将为骨缺损修复提供新策略。在这项研究中,我们进一步确认,500μM锂和25μ米铜能有效地激活规范Wnt和HIF-1α信号通路。此外,我们表明,规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路在bmsc夫妇,增强骨生成和血管生成的聚集有关锂和铜。

正常的骨修复涉及多个重叠的过程,如炎症、骨生成和血管化et al。骨生成和血管生成的耦合是不可缺少的一部分骨再生和修复。越来越多的研究表明,dual-delivery脚手架耦合骨生成和血管生成是一个可行的方法对骨再生(27,28]。在我们的研究中,我们经过Li-Cu-HA /坳支架使用微波热液结合,发泡,真空灌注方法(22,23]。与I型胶原的沉积Li-Cu-HA支架表面,支架的抗压弹性达到了骨小梁的要求(3.65 MPa),孔隙度,已经被证明可以促进骨的生成(29日]。同时,Li-Cu-HA /坳支架具有良好的生物相容性,可以鼓励bmsc的扩散。更重要的是,锂和铜可以维持释放支架,促进骨生成和血管生成与bmsc cocultured时。以前,一些学者掺杂两种或两种以上的微量元素到支架,证明它可以两骨生成和血管生成,增强骨修复。Bose和他的同事们设计了一个镁-和3 d印刷公司长期磷酸三钙脚手架的镁和硅被用来促进血管新生和骨生成,分别。他们调查,支架可以促进高山的表达,OCN, VEGF提高骨缺损愈合(27]。翁等人被掺杂锶和铜支架打骨生成和血管生成的作用。他们表明,支架可以两骨生成和血管生成促进骨形成的过程28]。因此,我们认为,锂,copper-doped脚手架osteogenesis-angiogenesis耦合承诺作为治疗骨缺损的新方法。

锂被用作医学治疗精神病人半个多世纪以来,它可以激活规范Wnt信号通路促进MSC增殖,迁移、骨等。30.- - - - - -32]。根据先前的研究,低浓度锂通常被用来刺激间充质干细胞的增殖和成骨分化(31日- - - - - -33),而积累或高浓度的锂可能抑制骨34- - - - - -36]。唐家璇等人调查,氯化锂(200 mg·公斤¹)gavage-fed大鼠2周可以促进骨形成在根尖周的骨损伤,而连续氯化锂治疗4周受损根尖周的骨愈合(36]。符合这些发现,我们调查bmsc接受了在低浓度刺激增殖和成骨分化的锂。此外,我们进一步透露,500年μ10 M锂获救的抑制效应μM xav - 939规范Wnt信号通路和bmsc的成骨分化。xav - 939已被广泛证明是Wnt信号通路的抑制剂(37]。最近,新兴证据显示xav - 939可能通过抑制抑制骨生成过程规范化Wnt信号通路(37,38]。杨和他的同事报道说,xav - 939能显著抑制osteoprotegerin表达preosteoblast细胞和wnt3a(标准Wnt受体激动剂)可能恢复的影响39]。因此,能有效地激活锂Wnt信号通路在500的浓度μM。

铜是众所周知的是一个基本的人体所需的微量元素。大量的信息被获得的理解它的作用在血管生成过程与肿瘤相关的开发40]。在bmsc,它已经表明,铜可以上调HIF-1α信号通路来增强VEGF的分泌和血管形成41,42]。在我们的研究中,我们调查了低浓度的铜可以加强bmsc的VEGF的分泌。此外,我们发现,25岁μ米铜有类似的效果与1%氧条件HIF-1的激活α信号通路。氧微环境的一个百分比是氧含量低于大多数组织和器官的physoxic状态(43,44]。和HIF-1α将持续表达,促进细胞的VEGF表达1%氧气的刺激下45,46]。同时,海耶特HIF-1等人报道α主要是在细胞质中5%低氧条件下,转移到细胞核刺激(1%低氧条件下47]。异位核HIF-1可以上调其目标基因。因此,我们认为,25μ铜米是激活HIF-1一个合适的浓度αbmsc的信号通路。

众所周知,有广泛的联系和胞内信号之间的通信。先前的研究表明,蛋白质的表达,如原癌基因和AKT下游的Wnt信号通路可能上调HIF-1的表达α,促进血管生成(48),而HIF-1的激活α信号通路可以促进骨生成的干细胞的分化方向,促进osteogenesis-related基因的表达等结合转录启动子基因启动子区域的一定是(49,50]。此外,越来越多的证据显示,β连环蛋白HIF-1有直接的影响α目标基因。凯迪等人报道,有重叠β连环蛋白和HIF-1α调节基因。cotranscription因素,β连环蛋白和HIF-1α绑定到启动子区域angiogenesis-related因素促进VEGF的表达,过剩1等。20.]。此外,克利福德等人利用记者结构确定,VEGF基因包含两个T细胞因子- (TCF)结合位点β连环蛋白可以结合TCF移植VEGF表达(51]。符合这些发现,我们的结果表明,锂的聚集有关下(500嗯)和铜(25),β连环蛋白可以把启动子地区的VEGF在bmsc增强其表达。此外,骨生成的bmsc也增强聚集有关。我们调查了富含HIF-1 osterix启动子α和osterix显著调节下聚集有关的表达。Osterix是锌finger-containing Sp7编码转录因子的基因,它可以调节bmsc的成骨细胞分化[52]。主调节器的bmsc的成骨分化,osterix胶原蛋白的调节中发挥着关键作用,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的基因表达(52]。osterix-silenced老鼠现在没有完整的骨形成和完全逮捕了成骨细胞分化伴随着缺乏早期和晚期的标记表明成骨细胞分化,导致围产期死亡率(53]。这是间接地表明osterix促进分化具有积极作用。此外,广域网等人发现osterix有两个共识hypoxia-responsive元素(HRE-binding图案)近端启动子利用原位杂交技术,和HIF-1α可以激活osterix表达式(25]。因此,我们相信β连环蛋白和HIF-1α可以激活VEGF (HIF-1吗α目标基因)和osterix (Wnt目标基因)相声规范化Wnt和HIF-1α信号通路,然后提高骨生成和血管生成聚集有关的耦合bmsc的锂和铜。然而,我们报道机制之一可能只是规范化Wnt和HIF-1之间的串扰αbmsc的信号通路。,需要更多的研究来探索之间的交互规范Wnt, HIF-1α和其他信号通路在耦合骨生成和血管生成。

5。结论

我们的研究发现,锂和铜离子的释放HA /坳脚手架两骨生成和血管生成在体外和Li-Cu-HA /坳支架有良好的机械性能和生物相容性。此外,我们发现锂和铜的最佳浓度可以有效地激活规范Wnt和HIF-1α信号通路。最后,我们表明,锂,copper-mediated骨生成和血管生成耦合增强通过规范化Wnt和HIF-1之间的串扰α信号通路。我们的研究结果强调合作的锂,copper-doped多孔有机-无机支架与综合治疗骨缺损的可能策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由深圳市科技创新委员会支持项目(JCYJ20190809152409606)、深圳三个著名的医疗卫生项目(SZSM201612092),医疗主题和关键项目(没有在深圳。SZXK023)。

补充材料

补充1。表S1: RT-qPCR和芯片的引物。

补充2。表S2:免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光、抗体芯片用于这项研究。

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版权

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