各种培养条件的影响在人类间充质基质细胞的新陈代谢

文摘

在体外和在活的有机体内分析是密切相关的,两者之间的互反关系由一个关键假设进行有意义的研究与关注。的主要目的在体外分析是提供一个坚实的背景在活的有机体内和临床研究目的。细胞治疗、组织工程和再生医学取决于高质量和适当程度的间充质基质细胞的扩张(msc)低风险和定义良好的条件。因此,它是必要的,以确定合适的替代胎牛血清(FBS-the实验室金本位),遵守所有相关的临床需求和提供适当的数量的高质量的细胞,同时保留所需的属性。人类血清(自体和同种异体)和血小板溶解产物和releasates目前认为提供承诺和相对well-accessible MSC种植选择。我们的研究相比heat-inactivated的边后卫在MSC新陈代谢的影响比其原生形式(包括作为标准在实验室实践)和潜在的替代品关注临床application-human血清(同种异体和自体)或血小板releasate (PR-SRGF)。血清的起源的影响(胎儿和成人)也确定。结果显示关键影响的热失活的边后卫MSC和人类血清和血小板的有效性releasates对MSC的行为(代谢活动、核扩散、形态学和细胞因子生产)。

1。介绍

胎牛血清(的边后卫)是广泛使用的补充细胞的培养和关注是通用标准组件的大多数文化媒体。的边后卫包含的关键因素在体外保存和成功扩张的细胞,如生长因子、维生素、脂质、激素,和各种蛋白质,直接或间接参与细胞粘附和生长。由于其血液来源,最好的边后卫被认为是工具,有助于模仿自然环境的生物,这是至关重要的短期(1)和长期(2)维护和扩张的细胞(3在体外条件下)。不过,作为一个典型的“代表”的边后卫血清有许多缺点。首先,没有批相同的成分和质量(4),它是化学定义是有害的对于实验重现性。此外,许多分析方法都有不同程度的负面影响其组件和不同浓度。其次,在人类医学背景的边后卫是异种的代理。此外,的边后卫可以与高污染的风险,例如,木糖醇,病毒、朊病毒,尽管通常是热处理。其实际应用之前,热灭活。单一研究描述患者抗体单个组件的胎牛血清(FCS),这导致了arthus-like反应后,政府与FCS的淋巴细胞培养介质补充(5]。因此,它不是特别安全的临床应用也不适合在体外实验,通常它们之前。第三,极具争议的边后卫收集方法和强烈要找人6]。因此,针对重大的负面因素,相当大的努力与其他替代品正在取代的边后卫。

最有前途的边后卫的替代品用于人类医学组成人类血清(HS),血小板溶解产物(PL) [7),和血小板releasates (PR-SRGF) [8)单独或组合使用。与PL,这通常包含所有血小板的因素和组件,该PR-SRGF (releasate-supernatant富含血小板生长因子)只包含这些因素释放激活血小板(6,9,10]。的α血小板的颗粒,特别是富含各种粘附蛋白,细胞因子,趋化因子,生长因子和释放后的血小板活化、(11]。尽管他们批次变化,这些替代品解决大部分的边后卫的与应用程序相关的基本问题:他们是人类有机体,交通便利,和他们的收集是道德。此外,这些替代品的输入材料生产的大部分已经临床测试。尽管PL HS和PR-SRGF代表承诺补充由于本国和人类起源,需要进一步详细的分析和研究,和指导方针必须设置(3]。

而潜在的间充质基质细胞(msc)从根本上扩展选择再生医学是毋庸置疑的,尤其是对这些细胞的未分化状态(12,13定义方法培养的msc),仍然是一个关键因素,一个必要的先决条件的研究和实际应用这些细胞。确定最优培养条件包括自然属性的同时有效的扩张和维护细胞(自我更新,multipotency)的文化仍然是一个挑战的细胞生物学和再生医学领域。因此,我们集中在描述人类的msc种植在heat-modified和non-heat-modified的边后卫(虽然两个版本广泛应用,关注不足,到目前为止,被投入他们的区别)和备选方案等不同血统的人类血清(自体和同种异体)和血小板。所有这些文化条件比较中补充的边后卫,仍然是标准型MSC培养补充。

我们的研究结果建议的边后卫的重大影响,以各种方式的边后卫替代治疗对细胞行为的增长,新陈代谢,差异化路线,集落形成和细胞因子的生产。

2。材料和方法

2.1。msc和培养条件

人类从骨髓msc得到健康的捐赠者后签署知情同意和各自的伦理委员会的批准。骨髓单核细胞(BMMNCs)通过离心分离Ficoll-Histopaque介质(Sigma-Aldrich)和最初扩大alpha-MEM nonheat灭活的边后卫(non-iFBS)为10%。从最初的扩张是通过一次msc,然后冻结。根据实验的类型(见下文),贴壁细胞进一步培养75或25厘米²烧瓶,6 - 12 - 24 - 96 -孔板或(瑞士TPP)标准αmem培养基(生活技术,美国)和青霉素(20 U /毫升;美国Sigma-Aldrich)和链霉素(20毫克/毫升;美国Sigma-Aldrich)和选定的血清类型或选择(见表1)。热失活的边后卫在56°C的30分钟(从同一批次non-iFBS总是用作控制)。

一般来说,这些细胞被培养在37°C和5%的有限公司₂的气氛。健康的捐赠者的实验使用msc ( )通道的数量从2到4(细胞被播种在不同concentrations-7 000年,000年8和10 000细胞/厘米²)。患者骨髓吸入物也从各种血液学的诊断( )长期msc的增殖试验(图1 (b)签署知情同意后)。骨骨髓来源的单核细胞(BMMNCs)通过离心分离Ficoll-Histopaque介质的浓度(Sigma-Aldrich)和播种 细胞/厘米²在αmem (Sigma-Aldrich)包含谷酰胺(Gibco英杰公司)和青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich)补充non-iFBS PR-SRGF (7.5% )。这些细胞被孵化在37°C和5%的二氧化碳气氛。播种后的24小时不依从细胞被冲毁。贴壁细胞的初始扩张持续了14天,和随后的段落(最多6通道)总是表现在80 - 90%融合TrypLETM (Gibco表达载体)。重播的浓度是2 600个细胞/厘米²从第一个使。

2.2。人类血清制备

人类的血清,同种异体的人类血清(allo-HS;人血浆的混合物从未知的各种血型的捐助者),血清自体血清(auto-HS;血清的捐赠者msc),使用和血清来源于AB血型捐赠(AB-HS),签署知情同意后得到健康的捐赠者。血清是准备后血液的凝血和随后的离心(3 000转/ 10分钟)。人类血清没有热灭活。

2.3。制备PR-SRGF

两批PR-SRGF准备从不同的捐赠者。的化学活化血小板通过添加CaCl执行₂最终浓度为0.04米。后一个小时的潜伏期在40°C随后在2×200 g离心10分钟,使用0.22 PR-SRGF汇集,过滤μ米孔隙大小过滤器。能整除的是储存在-20°C等待使用。

2.4。CFU-F分析

与克隆形成关注unit-fibroblast (CFU-F)测定,1.5细胞/厘米²镀到60厘米吗²瑞士聚苯乙烯培养皿(TPP)和培养2周的交换中每3天。殖民地从而形成是通过结晶紫染色(甲醇Sigma-Aldrich, 0.5%解决方案)和统计的肉眼。这些细胞簇直径大于1毫米被认为是CFU-Fs。图表中的CFU-F效率代表比例的殖民地形成初始数量的种子细胞。

2.5。决心的代谢活动

细胞被播种在96孔板(瑞士TPP)浓度的8 000个细胞/厘米²和000细胞/厘米²培养基中(见msc和文化条件)补充与选定的血清类型或替代(PR-SRGF招标和non-iFBS 10%和7.5%)。代谢活性试验(细胞细胞增殖测定效价96水一个解决方案,MTS, Promega,美国)执行根据制造商的标准协议(MTS的还原试剂有色甲瓒产品引起的新陈代谢活跃的细胞)4后,24日,48 h。吸光度测量是直接在96孔板中使用multidetection标(LabSystem MultiSkan女士,芬兰)。表达的结果相对于控制细胞和正常计数细胞的数量或数量的DNA内容基于样品的荧光强度使用CyQUANT NF细胞增殖试验装备(表达载体)。

2.6。决心倍增时间

瑞士msc被播种在6-well板块(TPP)的浓度10 000个细胞/厘米²与选择标准培养基补充血清类型或选择。后4 h, 24 h,培养48 h,细胞收获(300μl使用胰蛋白酶)和统计的伯克室。细胞的倍增时间确定使用细胞网上计算器(http://www.doubling-time.com/compute.php?lang=en)。

2.7。msc在招标和Non-iFBS成骨分化

msc被播种在一个集中的8 000个细胞/厘米²瑞士在6-well板(TPP)标准的扩张αmem培养基(美国生活技术)与10% heat-inactivated的边后卫(PAA、奥地利),青霉素(20 U /毫升;美国Sigma-Aldrich)和链霉素(20毫克/毫升;美国Sigma-Aldrich)。confluency达到90%后,细胞治疗21天osteo-differentiation介质(标准αmem培养基(生活技术,美国))与10% heat-inactivated或noninactivated的边后卫(PAA、奥地利),青霉素(20 U /毫升;美国Sigma-Aldrich)和链霉素(20毫克/毫升;美国Sigma-Aldrich)与0.5毫米L-ascorbate钠补充,10毫米glycerol-phosphate, 0.1μM地塞米松与新鲜每3天更换一次补充的媒介。细胞被染色使用冯Kossa染色法和观想通过光学显微镜。

2.8。决心的新陈代谢

细胞的能量代谢(糖酵解和氧化磷酸化)分析了使用安捷伦海马XFp细胞外磁分析器(美国安捷伦)和XF实时ATP率分析(海马XFp实时ATP率试验装备,安捷伦,美国)。msc在标准培养介质补充招标为10%或7.5% PR-SRGF 25厘米的8天²水瓶(TPP,瑞士;播种在5 200个细胞/厘米²)。然后细胞收获和受移植者(7.000 c /)在8-well XFp细胞培养miniplates(美国安捷伦)在适当的介质为24小时。1小时前分析,种子细胞治疗新鲜海马XF DMEM培养基,pH值7.4,与10毫米海马XF补充葡萄糖,1毫米海马XF丙酮酸和2毫米海马XF谷酰胺和孵化37°C 1 h。分析使用水化XFp墨盒补充注射解决方案(寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A)。在分析海马分析器(总ATP产量,糖酵解或线粒体ATP产量,%的糖酵解或氧化磷酸化),这些细胞被固定为4%多聚甲醛在PBS 25°C 15分钟和通过DAPI染色15分钟37°C (1): 1 000;美国Sigma-Aldrich)。细胞核的图像被使用Eclipse Ti-S显微镜和DS-Qi1Mc数码相机(尼康、日本)和4 x镜头。细胞核是用细胞计数分析器软件(美国)。然后海马数据是正常的细胞数量。实验重复三次总(所有的实验进行了一式三份)。

2.9。流式细胞仪分析

选择下面的表面标记流式细胞仪分析的msc: CD14-FITC (Dako;迪勒。1:50),CD45-FITC (Dako;迪勒。1:50),CD73-PE (Biolegend克隆AD2;迪勒。1:50)和cd - 90 - fitc (Dako;迪勒。1:50)。培养72小时后,msc使胰蛋白酶化,resuspended标准媒介,于是30 000个细胞/样本进行分析。 The cells were incubated with the appropriate antibody for 30 min at 4°C, then washed and resuspended in 300 μPBS的l。章BD的流式细胞仪分析流式细胞仪设备。

2.10。光学显微镜

相衬的细胞图像是用一个Eclipse Ti-S显微镜获得DS-Qi1Mc数码相机(尼康、日本)。图像是用10倍镜头和调整使用ImageJ软件(Rasband,至此ImageJ,美国国家卫生研究院、美国马里兰州贝塞斯达)。

2.11。荧光染色的细胞和共焦显微镜

细胞被播种在幻灯片4室(热科学™Nunc™Lab-Tek™II室和贸易下滑,美国),培养48 h。对线粒体染色,细胞被孵化MitoTracker红色CMX Ros(美国表达载体)37°C和5%的公司₂大气30分钟。他们然后通过4%多聚甲醛固定在PBS RT 15分钟,permeabilised使用0.1% Triton x - 100在PBS(美国Sigma-Aldrich) RT对20分钟,并使用DAPI染色在15分钟37°C (1): 1 000;美国Sigma-Aldrich)。的共焦图像细胞获得使用徕卡SP8X显微镜(德国徕卡微系统)配备了共焦扫描头,莱卡DFC365 FX单色数字CCD相机,一个HC PL APO CS2 63 x / 1.40石油目标,405 nm激发激光器和白光激光器(你;前579 / EM 599;混合检测器)(德国徕卡微系统)。使用LasX软件呈现图像(德国徕卡微系统)。

2.12。细胞因子分析

细胞的细胞因子含量分析了媒体用人类细胞因子抗体阵列42目标(英国Abcam)。7 000细胞/厘米²preseeded在标准中(招标αMEM补充10%)12小时37°C和5%的公司吗₂气氛,于是新鲜αMEM补充招标为10%或7.5% PR-SRGF添加为一个额外的72 h的细胞。只有那些媒体(没有细胞培养)在同等条件下孵化的细胞被用作控制。随后,文化媒体收集和储存在-20°C。条件培养基中的总蛋白浓度是决定使用皮尔斯™BCA蛋白质分析工具包(美国热费希尔科学);媒体被稀释至最后一个体积为1毫升。最后,每个培养基1毫升的每一个细胞因子应用膜。分析重复两次,根据制造商的建议执行协议。世行数码影像(ChemiDoc MP, BioRad)和图像实验室软件(捷克BioRad)被用于最终的细胞因子的确定内容。

2.13。毛细管ELFO分析

的毛细管ELFO分析nondiluted补充剂,招标(两个不同批次),PR-SRGF(两个不同批次),人类所提供的AB血清Sigma-Aldrich (AB-HS(σ)),和AB-HS (home-prepared),都使用了CAPILARYS 2 Flex-Piercing 1型227设备(Sebia、法国)根据标准和标准协议应用于临床生物化学的认可的实验室。分析的结果相比,血清参考值范围(通常应用人类血清标准:白蛋白,alpha-1-globulins(α1),alpha-2-globulins(α2),beta-1-globulins(β1),beta-2-globulins(β2),和gamma-globulins(γ))。

2.14。统计分析

统计结果从两个到四个独立实验至少重复执行。数据统计分析的一个因素方差分析有或没有LSD事后费舍尔测试。获得的值进行统计学上显著差异在一个α水平为0.05。统计评估了使用Statistica软件(StatSoft CR、信息)。

3所示。结果

3.1。Heat-Inactivated与Noninactivated的边后卫的影响细胞代谢和增殖

的影响heat-inactivated(招标)和noninactivated的边后卫(non-iFBS)代谢活动和msc扩散进行了研究。那些msc培养48 h招标的10%或10%的non-iFBS代谢活动(图表现出显著差异2(一个))。在non-iFBS面前,msc表现更高的代谢活动比iFBS-supplemented介质。他们的倍增时间的差异(图2 (b))患者之间差异不显著;然而,增加MSC增殖示iFBS-supplemented介质,和细胞的倍增时间培养的比例在招标non-iFBS-supplemented中是1.2。

msc的能力,形成殖民地(CFU-F)被发现在招标中non-iFBS相比显著降低(图2 (c))。的显著差异是通过测定证实CFU-F效率比为2.6。此外,MSC殖民地种植超过14天non-iFBS被认为更细胞密度和比殖民地iFBS-supplemented长大的媒介。

此外,骨髓间充质osteo-differentiate的能力明显降低,在招标的存在明显比在存在non-iFBS(图2 (d))。

3.2。影响的各种类型的血清代谢活动的msc

下一阶段关注的影响不同类型的血清代谢活动的msc。媒体补充成人noninactivated(我)同种异体人类血清(allo-HS;人血浆的血清从未知的捐赠者不同血型),(2)自体人类血清(auto-HS、血清来自同一个捐赠者msc)的起源,和(3)血清来源于AB血型的捐赠(AB-HS)测试中补充与non-iFBS(控制其代谢活动被认为是100%)(图3(一个))。non-iFBS相比,代谢活动的所有的检测细胞培养的边后卫成人的替代品被发现显著降低,除了AB-HS 5%,就相当于non-iFBS控制在24小时和48小时后显著提高。allo-HS的显著的抑制效应的msc与AB-HS和auto-HS明显为整个培养期间,与细胞的代谢活动培养allo-HS获得只有60 - 70%的控制。减少代谢活动的75%以下控制通常被认为是一个“抑制或细胞毒性”水平(14]。另一方面,代谢活动的msc栽培介质auto-HS最初也发现有减少,最终走向控制的水平。此外,数据显示,AB-HS和auto-HS支持的新陈代谢allo-HS msc更比,和msc的代谢活动被视为提升AB-HS整个细胞的培养与auto-HS的时期。

进一步,对不同来源的血清测试,我们比较msc的代谢活动相比,胎牛血清培养的成年牛血清(BS)(图3 (b))。减少成年牛血清的细胞代谢被观察到在几乎所有情况下显著。此外,血清热失活的类似的效果(减少肠易激综合症的代谢活动相比,non-iBS)是明显的,如图2。重要的是要注意,由于本研究使用不同批次的实验,一般的边后卫的批次变异现象及其替代品也应该牢记(15,16]。

3.3。在msc PR-SRGF血清替代的影响

下一阶段测试的影响涉及到的“releasate-supernatant富含血小板生长因子”(PR-SRGF,目前被认为是一个有价值的替代的边后卫)msc的行为。

比较代谢活动的msc治疗各种non-iFBS替代品(招标、AB-HS PR-SRGF两个浓度,5%和7.5%)在图提供3 (c)。早期阶段的培养(4小时),msc的代谢活动在所有测试补充剂被观察到显著低于对照组。然而,随着时间的推移,细胞的代谢活动培养媒体补充AB-HS和两种浓度的PR-SRGF(浓度越高被认为更支持)达到的水平控制(24小时),甚至超过它依赖于浓度(48小时)。

然后,我们专注于PR-SRGF倍增时间(图的影响1(一)(图)和长期扩散1 (b))细胞相比的边后卫的栽培介质。而倍增时间分析48 h后表示招标和PR-SRGF之间没有显著差异(图1(一)),显著增加细胞增殖明显在42天关注PR-SRGF-supplemented中的细胞培养介质。更高收益率的msc /数字媒介与PR-SRGF观察最早开始培养(12天),在实验的最后,细胞培养的数量在PR-SRGF视为45 000倍(导致6通道在42天的细胞)的细胞培养在non-iFBS(导致只有2通道在42天的细胞)。

分析CFU-F msc在两个条件下培养的14天显示,尽管CFU-F细胞的PR-SRGF高于招标中的细胞培养(PR-SRGF /招标比率为1.1);差异没有统计学意义(图1 (c))。有趣的是,在CFU-F效率相比,殖民地的大小明显不同(见图的图像1 (c))。殖民地的招标相比,那些PR-SRGF中等大,密集得多。

性能的研究还包括流式细胞仪分析表面标记的msc养殖在招标和PR-SRGF(增刊。1)。而CD73和CD90(典型的MSC表面标记)测定细胞培养在这些媒体,没有迹象表明CD14和CD45 [17]。PR-SRGF的存在并没有从根本上改变所选标记的表达相比iFBS-the阳性标记的存在表现超过95%积极性而负面标记表现积极的不到1%。

形态学的分析也表现的msc培养媒体补充PR-SRGF相比,媒体的补充招标;差异明显,甚至培养48 h后(图4)。招标时,细胞中观察到被奉承和纺锤状形态(图4(一)),msc种植在PR-SRGF介质(图4 (b))更凸核地区和薄。此外,共焦显微镜的线粒体网络msc培养两种条件下(数据显示额外的明显差异4 (c)和4 (d))。虽然线粒体网络msc在iFBS-supplemented培养基培养(图4 (c))似乎是传播与厚,长,单纤维密集位于细胞核周围星形模式( ),的线粒体网络msc在PR-SRGF-supplemented培养基培养(图4 (d))与萎缩更紧凑的球状结构均匀分布在细胞( )。不同的线粒体形态模式因此建议的不同影响PR-SRGF新陈代谢的msc比招标;这是支持的分析msc(图的代谢活动3 (c)),即。,的cells incubated in the PR-SRGF-supplemented medium evinced an approximately 30% higher metabolic activity than the cells incubated in the iFBS-supplemented medium.

因此,msc的新陈代谢的更详细的分析培养PR-SRGF和执行的边后卫(图1 (d))。glycolysis-formed的比例和氧化phosphorylation-formed ATP, ATP形成率相比,这些细胞是通过海马设备。

在招标中的细胞孵化24小时保持类似的氧化磷酸化和糖酵解,产生的细胞培养在PR-SRGF ATP的大约16%通过氧化磷酸化程度大于通过糖酵解。此外,PR-SRGF总细胞ATP形成率增加了大约20%相比招标(47 pmol ATP /分钟在招标和56 pmol PR-SRGF ATP /分钟)。

最后,细胞因子的分析内容在媒体上补充招标10%和7.5% PR-SRGF 72 h后培养的细胞( , )和没有细胞控制(招标,PR-SRGF)。总数的42检测细胞因子,最明显的差异是发现下列细胞因子(图的水平5(一个)):GRO(增长调控癌基因),il - 6(白介素6),引发(白介素8),MCP-1(单核细胞化学引诱物蛋白1),咆哮(调节激活后,正常T细胞表达和分泌;CCL5)、表皮生长因子(表皮生长因子),血管生成素,VEGF (血管内皮生长因子),PDGF-BB(血小板源生长factor-BB)。发现总的来说,整个细胞因子水平明显低于iFBS-supplemented介质和无细胞比PR-SRGF-supplemented媒介,只有两个例外GRO PDGF-BB。PR-SRGF-supplemented介质本身含有更高水平的咆哮和EGF和稍微升高VEGF和血管生成素水平比与招标中补充。相反,il - 6、引发和MCP-1无疑是由细胞产生自水平升高只有在那些包含细胞样本。有趣的是,某些细胞因子减少细胞的存在,即,血管生成素GRO和VEGF(补充);EGF和咆哮(PR-SRGF);和PDGF-BB(招标),因此建议通过细胞退化消费。

3.4。血清蛋白质含量分析和补充

目的是调查不同的血清和补充剂可能造成的影响从临床的角度来看,我们执行nondiluted样本分析的边后卫,PR-SRGF和人类血清通过毛细管电泳(图5 (b)),这是标准的程序申请人类血清的蛋白分析在临床实践中。所有测试的补充与参考人类血清诊断实验室的标准集。结果表明,虽然两批PR-SRGF和AB-HS类似于人类的血清参考标准,两批的边后卫不同于人类的参考。有趣的是,白蛋白分数显著降低的边后卫相比,人类的样本。另一方面,显著提高分数的α2球蛋白测定在两个批次的边后卫与所有人类的样本。此外,我们还将在胎儿和成人牛血清蛋白(的边后卫与ABS)和蛋白质含量发现,不同于人类的标准在这两种情况下;然而,高水平的γ球蛋白明显ABS(也高于成年人样本)与增强的各种抗体的存在,并不存在于胎儿血清。

4所示。讨论

4.1。Heat-Inactivated与Noninactivated的边后卫的影响细胞代谢和增殖

中给出的结果数据2(一个)- - - - - -2 (c)表示,倍增时间减少,骨骨髓来源的细胞代谢活动,CFU-F效率hMSCs在中补充了heat-inactivated的边后卫noninactivated的边后卫的细胞培养。明显降低骨骨髓来源的细胞增殖msc在招标后14天也记录了宇宙et al。18];然而,non-iFBS相比,滑膜msc在同一研究并不受招标。因此,宇宙的业绩表现差异不仅血清的修改,而且关于msc在相同条件下的组织起源。此外,他质疑对MSC的增强的变化相关的同源不同MSC捐赠者,这是,在许多情况下,也明显的呈现结果和高标准差。相反,然而,Bruinink等人观察到类似的来源于msc的增殖率骨种植存在的边后卫无论热改性。然而,他做演示的边后卫变更相关的其它细胞类型的影响(主骨细胞)19]。总之,这些结果表明,热失活的边后卫能够显著影响细胞的行为,其影响可能会影响细胞的起源和细胞供体可变性(20.,21)和细胞收集方法,细胞通道,细胞培养时间22),而血清的质量。

此外,msc的观察能力显著降低osteo-differentiate heat-inactivated的边后卫(图的存在2 (d))。这些结果支持的其他研究表明血清热不稳定因素的作用(例如,补充化合物和各种促有丝分裂的因素如生长因子)(19,23]。这一事实本身也解释了不同反应的各种细胞类型(对细胞周期的活动和新陈代谢)的可变性的边后卫批次。之前已经证明,蛋白质的灭活和noninactivated血清表现出显著的定性和定量的差异(24]。这种分析似乎表明,血清条件应符合不同细胞类型的具体要求和它们的用法18,24,25]。

总之,具备干细胞的non-iFBS加强某些参数(标记和维护)骨骨髓来源msc的增强等殖民地的形成(更多的细胞能够形成菌落,扩散的速度高于non-iFBS补充介质)中、在扩张,同时,增强成骨的msc的osteo-differentiation潜在的媒介。尽管测定的具体影响的热失活的边后卫在各种细胞,需要更详细的关于这一主题的研究。我们的研究结果表明热失活的重要影响的边后卫的msc的行为和事实可以高度误导比较来自实验结果表现的情况下在不同的培养条件下的热失活血清不考虑。

4.2。各种类型的血清的影响细胞的代谢活动

正如前面所示(18,19,25),细胞之间的显著区别行为曾被观察到在人类血清和的边后卫之间。因此,我们随后关注各类serum-allogenic人类血清的影响(allo-HS),人类自体血清(auto-HS)和血清来源于AB血型的捐赠(AB-HS)——msc(图的代谢活动3(一个))。

我们的研究结果表明,不同类型的血清对msc的影响时间,和细胞的反应显然是明显的早期培养时间点(4小时)。明显积极作用的AB-HS MSC种植并不奇怪因为患者AB血型被认为是普遍的血清捐助者,此外,这种效应也已被其他研究关心骨骨髓来源MSC (10)和脂肪tissue-derived msc (26]。的边后卫和HS的可比影响人类宫颈癌细胞系的增殖和迁移已经观察到,和细胞入侵和球体形成发现显著增强的HS (27]。因此,商品似乎细胞特定类型的影响。

相反,我们观察到显著的抑制效应上的所有人类的血清代谢的msc与non-iFBS早期时间点(4和24小时)。这有点令人惊讶的现象是由于不同的血清的质量(生长因子和免疫的内容元素)从成人获得捐助者(免疫系统对各种刺激的暴露在寿命)和血清中提取的胎儿动物(更天真的免疫系统),曾被提出在其他研究[4,15]。结果呈现在图3 (b)代谢活动的减少,这说明了msc相比,成年牛serum-supplemented培养基培养胎牛血清(图3 (b)),支持这一假设。进一步解释allo-HS的抑制作用与血清的理想成分来自不同捐赠者的血液中提取的混合物(不同的血型,年龄,和免疫条件)。

总之,AB-HS似乎是一个有效的补充和支持对msc的新陈代谢,类似于或超过使用异种的non-iFBS。因此,AB-HS应该被认为是一种很有前途的,原则上更安全、伦理上更容易接受non-iFBS对替代品在体外实验。研究结果强调了不断的冲突和差异在体外和在活的有机体内细胞的行为;的在体外结果(没有任何接触免疫系统)表明AB-HS是更有效的比auto-HS细胞代谢活动提供商,反过来,似乎是一个明显不如non-iFBS有效的补充。相反,然而,通常下在活的有机体内条件下,auto-HS代表最兼容的补充剂,因此只暗示我们的结果应该参考在体外细胞培养。

4.3。血清替代品的影响(PR-SRGF)在msc

血小板衍生品被认为提供有价值的替代的边后卫,尤其是关于他们的潜力提高的有效性在体外扩张的msc (3,28]。因此,招标的效果比较(尽管我们先前表明,这不是一样的non-iFBS)与血小板衍生的一种特殊形式的标准,即:“releasate-supernatant富含血小板生长因子”(PR-SRGF)骨髓derived-MSCs的行为。

尽管观察PR-SRGF轻微的抑制作用的代谢活动的msc在早期的时间点(4小时),重要(但有限)增强后观察。此外,细胞数量的显著增强明显在这些细胞的长期培养与PR-SRGF(图中1 (b))。这些发现从而加强PR-SRGF的潜力作为一个适当的替代的边后卫在未来;而补充支持某些MSC的表现(具备干细胞)标记,PR-SRGF提高MSC扩张(有利的要求培养的MSC)在更大程度上比的边后卫。PR-SRGF的同类或者增强效果在某些MSC细胞属性(MSC来源于骨髓或脂肪组织)与招标也被描述的其他研究[10,26]。此外,流式细胞仪分析表面标记的msc种植在招标和PR-SRGF透露(增刊。1)PR-SRGF倾向于保持选中的类似表达对msc的表面标记和招标,一个事实中也发现了其他的研究(10,26]。尽管所有这些研究显示的各种优势PR-SRGF MSC文化的存在,他们也证明的必要性,强调的关键作用制备方法包括血小板衍生品和编译的紧迫性的精确定义的发布标准至关重要的质量和增强可比性platelet-based替代品用于未来的研究(3,15,28- - - - - -30.]。墨菲已经证明,即使是很小的差别的制备血小板源产品(如血小板的起源)可能会影响的内容,性质,因此其细胞行为(26]。然而,本机可变性的msc与不同细胞捐献者和组织起源的批次差异PR-SRGF应该被考虑。

而我们的研究结果揭示了相当程度的msc效率形成的殖民地(此句所需的细胞能够形成殖民地)的招标和PR-SRGF殖民地被发现显著差异的大小(见图的图像1 (c))。而殖民地PR-SRGF中被观察到的是大型和密集,这些在招标中更小和更少的细胞组成,因此支持关于增加扩散后的结果长期培养。类似的结果也被描述为骨骨髓来源msc (10)和脂肪tissue-derived msc (26]。

关注细胞形态、出版研究关注CFU-F,殖民地的大小,形态更大量的详细研究单个细胞形态学的变化在各种媒体培养后补充(10,18,19,29日,31日]。我们注意到细微的差异通过光学显微镜在细胞形态(平面细胞在招标和凹PR-SFGF)细胞和线粒体明显差异网络在细胞培养PR-SRGF招标,从而显示不同的细胞的代谢状态。弗尼等人证明了线粒体网络是动态的,其模式根据不同MSC分化的不同阶段(nondifferentiated,骨的、细粒和adipo-differentiated) (32]。这意味着线粒体的形态网络能够指示状态的细胞和它的潜在倾向分化成某一方向。尽管毫无疑问要求更详细的研究这一主题,我们的假设条件表明不同的细胞状态的改变线粒体模式支持的升高程度的代谢活动(图3 (c)上面),氧化磷酸化增强糖酵解(约16%),和ATP总产量增加率(约20%)(图1 (d))的msc PR-SRGF相比在招标。趋势是截然不同的,尽管高标准差不同捐赠者的使用造成的。倾向升高ATP形成PR-SRGF的存在可以解释增加的长期扩散PR-SRGF(图1 (b))。招标和PR-SRGF影响msc对氧化磷酸化水平的代谢而不是糖酵解水平,既保持类似的关于补充剂。这一发现与先前的研究一致,提到了糖酵解代谢msc与关键环节的灵活性和葡萄糖代谢33- - - - - -35]。根据一项研究的结果Mylotte et al .,在msc ATP的形成是减少压力的条件下(如缺氧、缺血或葡萄糖剥夺),此外,糖酵解已被证明为msc (ATP的重要来源34]。因此,msc的相似的糖酵解率的存在两个补充糖酵解的基本性和支持,因此,它比这更高的稳定细胞的氧化磷酸化。此外,ATP形成率表明PR-SRGF补充能够温和提升细胞的氧化磷酸化(即。,it is capable of increasing the oxidative phosphorylation to glycolysis ratio in favour of oxidative phosphorylation) and may, thus, be less stressful and more proliferation-inducing for the cells. It has been demonstrated repeatedly that cell proliferation is dependent (to a certain extent) on oxidative phosphorylation and mitochondrial electron transport. While the need for oxidative phosphorylation at a certain level has also been observed with respect to cancer cells, the role of glycolysis remains indispensable and crucial for such cells [36- - - - - -38];由于糖酵解,逐渐升高的趋势,msc的长期存在的氧化磷酸化PR-SRGF能够参与增强细胞扩散。

最后,我们分析了细胞因子的生产的msc培养招标和PR-SRGF-supplemented媒体,发现整个细胞因子水平在中与招标(有或没有细胞)明显低于PR-SRGF-supplemented媒介。虽然非常高水平的咆哮和PR-SRGF EGF在媒体上被发现,细胞培养在媒体服务整体水平略低。此外,减少观察GRO水平,血管生成素,VEGF(补充);EGF和咆哮(PR-SRGF);和PDGF-BB(招标)后细胞因子的细胞培养显示消费或退化msc、在协议与以前的研究结果(10]。有趣的是,il - 6、引发和MCP-1成为主流媒体在细胞培养后,从而表明其生产的细胞。引发、MCP-1和咆哮已知引发炎症反应。相反,il - 6细胞培养(在类似水平的补充剂)自然是与炎症反应受损局部组织损伤或急性期蛋白的诱导受损。此外,它曾被称“IL-6-producing细胞”包括骨髓基质细胞、成纤维细胞和T细胞(39),支持我们的发现的类似水平的il - 6的形成由msc培养在招标和PR-SRGF-supplemented媒体。问题是,因此,特定的水平是否赞成和抗炎分子由体外培养(定义)或不发挥作用(il - 6水平高出一个数量级的水平引发,MCP-1,和咆哮)预测的平衡的免疫反应。如果我们假设,PR-SRGF似乎存在一个风险高于招标对可能引发炎症的表现型。另一方面,它也曾被证明引发与细胞的有丝分裂和血管生成(40- - - - - -42)引发,GRO, MCP-1是由癌细胞为了提高骨骨髓来源msc的迁移功能,能够支持癌症细胞的msc的趋化现象的能力(43]。相反,这些因素有助于预测的优势PR-SRGF诱导获得理学硕士学位的支持组织再生的表型,尽管它可能会引起担忧这样的MSC可以促进肿瘤的生长。进一步结果,支持使用PR-SRGF担忧其高水平的其他细胞因子,测定细胞增殖的重要方面。例如,血管生成素和VEGF作为电梯的msc的血管生成和细胞生存能力44),而EGF曾被证明是一种有效的辅助MSC增殖的45]。所有这些因素都支持和联系我们的发现这些细胞因子的高水平的高度的增殖细胞PR-SRGF的存在。总之,很明显,PR-SRGF提供了一个广泛的细胞因子,其中一些确实是连接到一个促炎反应;然而,其他人则与抗炎作用有关,细胞增殖,细胞生存,与招标。因此,尽管PR-SRGF似乎携带促炎反应的风险(可诱导人类有机体的异种的招标),高潜力仍PR-SRGF支持msc的增殖和再生能力的文化,因此,要增强的制备和激活这些细胞生物体为目的的政府根据临床实践。然而,仍然需要进行进一步的详细分析,旨在验证PR-SRGF的安全应用。

4.4。血清蛋白质含量分析和补充

研究还涉及分析的蛋白质含量的边后卫,PR-SRGF, HS和ABS通过毛细管电泳(图5 (b))(临床实践中使用的标准技术)和水平的比较内容的各种球蛋白和清蛋白。异种的条件由两批的边后卫(来自不同提供者),生理条件由人类血清AB-HS孤立在我们的实验室和商业获得HS (AB-HSσ),和临床条件由两批PR-SRGF表示。

分析显示三个显著差异。首先,测量蛋白质中的值两批PR-SRGF和AB-HS分数非常接近人类血清参考标准。令人惊讶的是,获得的商业AB-HS不同的测量球蛋白,也提供一个警告它的用法。其次,显著降低数量的白蛋白分数的边后卫PR-SRGF和人类相比血清检测标准。白蛋白的作用在细胞粘附过程之前的一项研究中描述魏et al .,显示的主要吸附白蛋白在疏水表面之间的竞争导致这种蛋白质和细胞表面存在;因此,增强白蛋白含量导致减少细胞粘附[46]。这种现象是明显的在我们的代谢活动结果4 h(图3 (c)),细胞之间的差异的边后卫和观察PR-SRGF意义重大。除了不同的起源(牛和人类)和不同性质的两个补充(血清和releasate),捐赠者的年龄和性别因素可能也扮演了重要角色在结果血清白蛋白浓度(47]。从临床的角度来看,人类血清白蛋白降低分数通常观察到在炎症条件下(48),从而表明PR-SRGF补充更接近人类血清的各种影响。然而,这个结论不一致的细胞因子分析结果,为进一步强化的必要性PR-SRGF的详细规范,在实践中验证其安全应用程序。第三,而α2显著提高分数的球蛋白在两个批次的边后卫和ABS PR-SRGF相比,AB-HS和人类血清标准可以与异种的牛血清的起源,从临床的角度来看这个分数的海拔也可以与炎症过程,因此,要等急性期反应物的存在α2-macroglobulin和结合珠蛋白和血浆铜蓝蛋白含量49]。因此,这表明PR-SRGF比的边后卫的高潜力的细胞培养和后续在临床实践中的应用。

总之,我们所有的在体外结果表明了优先的积极影响PR-SRGF msc相当或更高的应用潜力比的边后卫在体外条件下对其调节细胞新陈代谢的能力。然而,其属性的进一步详细调查是必要的,以验证其安全在临床实践中的应用。

5。结论

这项研究的目的是比较常见和heat-inactivated形式的边后卫和几个方便的替代品,目前被认为是有前途的对在体外,在活的有机体内临床应用:人类血清(AB,同种异体和自体)和PR-SRGF血小板releasate我们也使用毛细管电泳的特点。我们的研究结果揭示了重大影响的热失活的边后卫的MSC新陈代谢和CFU-F效率,从而表明需要的精确识别的边后卫出版物。我们还证实骨髓间充质各种人类血清的敏感性的差异和他们的选择。我们的数据证实,AB血清和PR-SRGF提供高效、方便的替代品的边后卫MSC栽培目的(分析表明,它们可比或比的边后卫更有效)。此外,PR-SRGF被证明是一个很好的补充msc的长期有效的扩张,提供高收益率的细胞,同时保持他们的个性。我们也详细描述了各种形态的变化,代谢,细胞和细胞因子生产栽培的PR-SRGF相比的边后卫。总之,我们的结果表明血清的类型的程度(作为细胞培养的主要成分)和它的修改能够影响细胞行为,在实验之前,以及转型的紧迫程度的应用异种的的边后卫,未来的人类血清替代常规实践和生物材料和再生医学的研究。我们也强调的重要性不是俯瞰常见栽培条件如血清及其修改的类型。

数据可用性

可用数据可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

特别感谢Blanka Bilkova先进的技术援助。本研究支持的项目:NV 19-08-00144卫生部颁发的捷克共和国和普洛古莱Q26和UNCE /地中海/ 016查尔斯大学提供的。看法是支持的项目没有。CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000787“传染病”,获得最大经济产量CR,从EFRR资助。

补充材料

补充1:流式细胞仪分析表面在PE-A markers-CD73信道CD90、CD14,和CD45 FITC频道,CTRL-appropriate同形像控制。(补充材料)

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