mir - 375促进胰腺分化在体外通过影响不同的目标基因在不同的阶段

文摘

人类胚胎干细胞(为其有能力分化成胰岛素生产细胞(ipc),可用于治疗1型糖尿病。mir - 375是一个重要的转录监管机构在胰腺的发育和成熟。在这项研究中,我们优化协议来区分为ipc和ipc获得成功。然后,我们执行超表达和抑制实验mir - 375的细胞在分化的不同阶段和RNA-seq执行。结果表明,mir - 375的表达波动在hESC分化和受到mir - 375模拟和抑制剂的影响。mir - 375影响全球基因表达和mir - 375的目标基因。mir - 375的过度表达可能导致多个信号通路在胰腺发育的变化。mir - 375是一个主要的参与者在胰腺的分化β通过不同的目标基因在不同阶段的肽。本研究为进一步研究提供新想法的小分子核糖核酸如何影响细胞命运和基因转录。

1。介绍

小分子核糖核酸(microrna)是小非编码rna通常绑定到3 - - - - - -未翻译区(3 - - - - - -utr)的目标基因和一般函数的负调控基因转录(1,2]。microrna控制许多基因的表达(3)和参与重要的生物过程,包括开发、分化、细胞凋亡、细胞增殖、和疾病(4- - - - - -8]。胰岛素分泌的精确控制β肽是重要的维持血糖稳定;胰岛素分泌障碍可能导致慢性高血糖和糖尿病(9]。microrna在胰岛素分泌发挥重要作用,以及胰岛的发展,β细胞分化、糖脂代谢,和许多其他糖尿病相关流程和并发症(10]。的监管影响miR-30和mir - 200 epithelial-to-mesenchymal过渡可能是一个有效的方法来控制胰岛细胞发展(11]。与控制样本相比,11个microrna的表达,包括miR-21-5p miR-24-3p, mir - 100 - 5 - p, mir - 146 a - 5 - p, mir - 148 - a - 3 - p, mir - 150 - 5 - p, mir - 181 a - 5 - p, mir - 210 - 5 - p, mir - 342 - 3 - p, mir - 375,和mir - 1275,在1型糖尿病(T1DM) [12]。Reg1可能的直接目标miR-7导致其影响胰腺癌β细胞功能(13]。microrna - 224可能作为指标β细胞死亡(14]。mir - 377和mir - 216——一个被认为是儿童1型糖尿病肾病的早期生物标志物(15]。

mir - 375中扮演一个重要的角色在复杂的网络调控胰腺癌发展,其中包括基因等NEUROD1,NGN3,PDX1,HNF6(16]。男性糖尿病患者过度造成的营养摄入量,特点是一个逐步增加胰岛素分泌,β细胞死亡,和mir - 375表达(17),mir - 375表达相关∆c -肽;反过来,这是与胰岛素的产生和分泌,这是一个重要的标志检测胰岛功能(18]。与此同时,mir - 375在胰腺癌发展起着重要的作用。据报道,mir - 375直接调节的基因信使rna表达和降低其蛋白质含量,减少葡萄糖刺激,引起胰岛素的表达和DNA合成β肽(19]。Myotrophin (Mtpn)预测的目标mir - 375 (20.]。的抑制作用Mtpnshort-interfering RNA (siRNA)分子生物学胰岛素分泌和胞外分泌的mir - 375是相似的。mir - 375由cAMP-protein转录抑制激酶(PKA)通路。这种抑制作用是通过阻断绑定的RNA聚合酶II mir - 375启动子(21]。此外,mir - 375对其功能通过胰腺发育相关基因的调控,细胞生长和增殖,胰岛素分泌。

干细胞能够自我更新和分化的潜力在多个血统。他们在不同条件下可以分化成不同类型的细胞。人类胚胎干细胞的分化为成胰岛素生产细胞(ipc)是当前研究的热门话题之一。近年来,据报道,人为多能干细胞(hiPSCs) [22和为其23)已经成功地诱导形成β例如细胞体外。然而,分化细胞的问题低胰岛素分泌和coexpression胰高血糖素和生长激素抑制素。mir - 375的分化调控许多重要的监管机构为ipc,等PDPK1(24),HNF1β(25),而切口2 (26]。尽管mir - 375及其目标基因的研究比较全面,但仍有必要来分析如何mir - 375参与的整个过程ESC分化成ipc。

在这项研究中,我们优化的报道差异化协议为IPCs并成功获得胰岛素样细胞。mir - 375是过表达或抑制分化的不同阶段,并通过RNA-Seq细胞进行了分析。mir - 375在全球转录变化的影响在胰腺体外分化和网络pancreas-specific转录因子和mir - 375目标基因。此外,我们试图确定mir - 375为胰腺分化和胰岛素生产的影响。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

MEL1和H9细胞受到的胰腺差异化协议正如et al。21,23),用细微的修改。为被接种到Matrigel-coated 24-well板的密度 。分化生长因子和细胞直接分化的小分子,而模仿体内胰腺器官发生(23]。分化过程包含四个阶段:明确的内胚层(I期),原肠胚形成(第二阶段),内分泌前体(第三阶段),胰腺内分泌细胞(四期)(见图1(一))。为是原始内胚层分化使用STEMdiff基础培养基或RPMI 100 ng / mL的基本培养基补充激活素A和25 ng / mL Wnt3a。

2.2。转染mir - 375模拟和抑制剂

mir - 375模拟和mir - 375抑制剂Ambion买来,TX,美国。mir - 375的数量miRBase MIMAT0000728, UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA mir - 375序列和成熟。的Lipofectamine®RNAiMAX用于转染试剂(表达载体)。

在每一个阶段的开始分化,mir - 375模拟或抑制剂与脂质体转染,改变mir - 375的表达,D0, D3, D6, D10, D13, D17。在每个阶段,收集细胞进行分析。转染mir - 375模拟/抑制剂在24-well板块进行集中10 pmol / 3μ脂质体的L。mir - 375模拟转染样本贴上mir - 375 oe和mir - 375缓蚀剂转染样本贴上mir - 375 - ie。

2.3。RNA提取和实时PCR分析

总RNA分离使用试剂盒(转基因生物技术,中国)使用逆转录和reverse-transcribed cDNA工具包(豆类,大连,中国)。实时聚合酶链反应(rt - PCR)进行使用ABI棱镜7500序列检测系统(应用生物系统公司、钙、美国)。每个反应(20μL)包含2μL (cDNA模板,10μL SYBR绿色主人混合(豆类,大连,中国),0.4μ0.8 L的火箭参考染料二世μL的正向和反向引物,和6μL (RNase-free ddH₂o .补充表1显示了用于rt - pcr引物序列。反应进行的96孔板使用以下孵化协议:95°C 30年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 34 s。基因的表达是归一化的表达β肌动蛋白通过比较循环阈值(Ct)值。基因表达是决定的方法,然后分析了统计学意义。

2.4。样本收集和准备

RNA RNA退化和污染的量化和资格进行1%的琼脂糖凝胶。核糖核酸的纯度检查使用NanoPhotometer®分光光度计(IMPLEN、钙、美国),使用RNA, RNA的完整性评估纳米6000安捷伦2100年生物分析仪系统的分析工具(安捷伦科技、钙、美国)。

2.5。图书馆准备转录组测序

总的来说,1.5μg RNA /样本作为输入材料用于RNA样品制备。测序库生成使用NEBNext®超™RNA图书馆准备包Illumina公司®(美国内)按照制造商的建议,和索引代码添加到属性序列中每个样本。简单地说,信使RNA是使用poly-T-oligo-attached磁珠纯化总RNA。碎片进行了使用内布拉斯加州5×二价阳离子在高温下合成第一链反应缓冲区。使用一个随机的六聚体合成第一链cDNA底漆和M-MuLV逆转录酶(-)的前体。两样东西互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用DNA聚合酶和核糖核酸酶h .剩下的悬岩转化成钝结束通过核酸外切酶/聚合酶的活动。腺苷酸后3结束的DNA片段,NEBNext适配器发夹环结构的结扎准备杂交。实现优先选择的cDNA片段长度250 - 300 bp的图书馆片段被纯化使用AMPure XP系统(美国贝弗利贝克曼库尔特)。然后,3μL用户酶(美国内)是用于size-selected,在37°C adaptor-ligated cDNA 15分钟后跟5分钟前在95°C PCR。PCR使用Phusion高保真执行DNA聚合酶,普遍的PCR引物,和索引(X)底漆。最后,PCR产物纯化(AMPure XP系统),2100年安捷伦生物分析仪和图书馆质量评估系统。

2.6。聚类和排序

集群Novogene index-coded样本进行的实验部门(中国,北京)cBot集群生成系统使用TruSeq PE集群装备v3-cBot-HS (Illumina公司)按照制造商的指示。集群生成后,图书馆准备被测序的Illumina公司Hi-seq平台和paired-end读取生成。

2.7。mir - 375目标基因的预测

mir - 375的目标基因是探索使用一个在线数据库:TargetScan [27]。TargetScan microrna的靶基因预测是一个数据库,主要搜索保存8 mer和7 mer站点匹配每个microrna的种子区域预测目标基因。一个信使rna被认为是一个可能的mir - 375目标如果TargetScan的交互支持。为了确保结果的准确性,我们也使用在线数据库母星(28)来验证结果的十字路口,从两个数据库获得目标基因mir - 375的最终目标基因。

2.8。数据处理

统计数据处理后TMM使用磨边机进行差异分析,差异表达mRNA。所有统计学意义的值是纠正多个测试使用错误发现率(罗斯福)。褶皱变化值(绝对log2)≥1和罗斯福调整 被认为是具有统计学意义,ClusterProfiler用于去(基因本体)和KEGG(京都基因和基因组的百科全书)富集分析差异表达基因。FPKM(每千碱基片段每百万)微分基因信息被转换成TPM信息进行后续分析。

2.9。时间序列分析

短时间序列表达矿工(STEM)版本1.3.12被用来进行时间序列分析的mir - 375目标基因的相对表达mir - 375 oe组和对照组(使用干细胞聚类方法的算法, )。相对表达式是一个对数函数处理。这些基因的表达模式在不同时期是集群,集群和基因分为0到9。

2.10。蛋白质相互作用网络

字符串数据库(https://string-db.org/)被用来获得蛋白质交互网络胰腺分化相关的基因,然后,Cytoscape 3.7.0被用来显示PPI(蛋白质交互)网络(Avg)。邻居的数量是15.738。大圆圈和深色显示更大程度的连通性的基因网络和网络中的核心作用,分别。

2.11。西方墨点法

样本细胞细胞溶解使用里帕蛋白质提取试剂(Beyotime,北京)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(瑞士罗氏公司,Rotkreuz)和phenylmethylsulfonyl氟化物(罗氏、Rotkreuz、瑞士)。一个50μg提取的蛋白质样本通过15% sds - page分离,转移到一个止动剂®- p转移膜(美国微孔),和孵化与特定的抗体。放射自显影图是量化使用微(量一个软件;Bio-Rad)。蛋白质含量测定后,免疫印迹。特定的抗体和稀释如下:anti-PDX1(1: 1000)和anti-INSULIN (1: 800)。所有抗体都来自Abcam(美国AB)。目标蛋白质水平正常化anti-GAPDH(1: 1000)从Abcam(美国AB)。第二抗体是辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 10000)和山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 5000)从Abcam(美国AB)。

2.12。统计分析

qPCR实验获得的Ct值的计算方法,每个基因的相对表达。组间的波动是由方差分析。在方差分析中,值> 0.05 < 0.05,< 0.01被认为没有明显不同,明显不同,和极显著不同,分别。减少错误并获得统计上显著的实验数据,三个独立复制的所有实验进行研究。

3所示。结果

3.1。为被分化IPCs四级协议

四级差异化协议(见图1(一)从以前的出版物(采用)21,23]。的表达FOXA2,趋化因子受体CXCR4,NGN3,PDX1,胰岛素,胰高血糖素,生长激素抑制素在分化的不同阶段,由rt - pcr检测。FOXA2和趋化因子受体CXCR4从D4表达和维护所有的分化阶段。的相对表达FOXA2在II期更高。的表达NGN3和PDX1内分泌前体细胞的标志,从D8增加,相对表达式是最高的在这里的区别。胰岛素,胰高血糖素,生长激素抑制素胰腺内分泌细胞的标记,表示高度的分化。mir - 375的表达增加后的第一阶段分化,分化期间保持在一个非常高的水平,但波动发生(见图1 (b))。成功制备了类胰岛素分泌细胞分化和H9 MEL1为,,PDX1和胰岛素被免疫荧光染色检测(见图1 (c))。

获得更好的分化的结果,我们检查了Wnt3a浓度对细胞分化的影响。首先,0 ng / mL, 25 ng / mL,添加了50 ng / mL Wnt3a开始分化。细胞的形态没有明显差异在I期和II期。分化成三期时,死亡细胞的数量明显高于0 ng / mL Wnt3a组。细胞生长在25 ng / mL Wnt3a较低比例的死细胞和清晰多层增长。与50 ng / mL和0 ng / mL Wnt3a组,25 ng / mL组高FOXA2和PDX1表达式,以及更高的胰岛素和胰高血糖素分泌水平;因此,25 ng / mL Wnt3a用于我们的差异化协议(见图S1)。

3.2。mir - 375参与IPC的分化形成通过不同目标基因在不同的阶段

mir - 375模拟和mir - 375抑制剂在24-well转染到细胞板的过度(OE)和抑制(IE)实验(见图2(一个))。mir - 375模拟的转染和mir - 375抑制剂并不影响生长,形态,密度在分化的细胞。在每个阶段的开始分化,细胞转染;在结束的阶段,这些细胞被收集并用于基因表达分析。mir - 375的表达在细胞转染mir - 375模拟显著高于untransfected细胞,而其表达与细胞转染mir - 375缓蚀剂是类似于untransfected细胞。

利用rt - pcr检测的相对表现FOXA2,趋化因子受体CXCR4,NGN3,PDX1,胰岛素,胰高血糖素,生长激素抑制素转染后mir - 375模拟和抑制剂。mir - 375的转染模仿阶段我的表达减少趋化因子受体CXCR4但增加趋化因子受体CXCR4表达式在II期和III期。mir - 375的转染模仿的表达增加FOXA2在所有阶段和增加的表达NGN3和PDX1。的表达胰岛素,胰高血糖素,生长激素抑制素增加了mir - 375模拟早在四期,但这个阶段结束时下降。mir - 375的抑制是通过mir - 375抑制剂。mir - 375增加的抑制作用趋化因子受体CXCR4表达在II期和III期但下降趋化因子受体CXCR4表达在另一阶段。mir - 375抑制剂也减少的表达FOXA2,PDX1,NGN3,除了略微upregulationFOXA2阶段i的表达胰岛素,胰高血糖素,生长激素抑制素也下调了mir - 375抑制;然而,总的来说,mir - 375抑制的影响明显不如增强了mir - 375模拟(见图2 (b))。免疫印迹分析用于检测PDX1蛋白的表达在D21 D13和胰岛素。结果表明,蛋白表达的PDX1和胰岛素细胞转染和mir - 375模拟高于与mir - 375细胞转染抑制剂。因此,瞬态超表达mir - 375 D10的分化可以促进PDX1蛋白质的合成,和mir - 375瞬态超表达D17的区别可以促进胰岛素合成D21(见图2 (c))。

进一步调查mir - 375如何影响胰腺分化,rt - pcr分析用于检测其他pancreatic-related转录因子(参见图的变化S2)。结果表明,超表达mir - 375的减少造成的CAMD1基因表达在D3, D6 D10, D13, D17 D21,HNF1β减少在D6 D10。mir - 375的过度表达在第四阶段II的分化的表达减少NOTCH2(D10 D17和D21)PAX6(D13和D17)。这些结果表明,mir - 375参加了ipc通过不同的目标基因的分化不同阶段。

3.3。mir - 375全球影响基因表达在分化为ipc

RNA-seq数据的综合分析,揭示了执行转录组变化期间为其分化成胰岛细胞。我们进行了聚类分析在总共21051个基因mir - 375 oe mir - 375 - ie, mir - 375对照组在不同阶段和注释的潜在标记每个阶段(见图3(一个))。我们的研究结果表明,随着分化的进行,整个细胞的转录水平经历了明显的变化,和舞台,终端内胚层分化,不同于其他阶段。这表明干细胞分化过程中,早期的成功是至关重要的差异化。转录组比较相似的表达模式在第四阶段II (D13-D17)。值得注意的是,细胞的转录水平的分化(D17-D21)显著改变。随后,高表达基因的表达显著减少。这些基因可能的表达有关胰岛素和胰腺祖细胞的分化成胰腺胰岛分泌细胞。

的表达胰岛素和生长激素抑制素在D21细胞显著增加,表明成熟的类胰岛素分泌细胞的形成。进一步说明了mir - 375对胰岛细胞的分化过程,我们关注~ 9000个基因。后mir - 375的过度表达,6191个基因中有显著影响的过度mir - 375在舞台上我(D0-D6), 4656个基因(大约75%)在这个阶段独特的影响。抑制mir - 375后,3591年,2904个基因表达明显变化阶段我(约80%)在这个阶段独特的影响。后基因的比例是影响独特mir - 375超表达是47.5%在第二阶段中,47.5%在第三阶段,在四期和53.7%。独特的基因的比例影响mir - 375抑制50%后在第二阶段中,60%在第三阶段,67.2%在第四阶段(见图3 (b)和3 (c))。这些数据表明,基因影响mir - 375在不同的阶段是明显不同的。

无论超表达或抑制mir - 375,超过40%的基因影响是那个阶段所特有的。在这些基因中,mir - 375的最显著的影响发生在舞台上我(D0-D6)。然后我们去执行功能和KEGG通路富集分析差异表达基因。去浓缩的主要功能分析表明,浓缩与pancreas-related基因mRNA coexpressed在骨骼系统开发中,collagen-containing细胞外基质、细胞外基质和阳离子跨膜运输活动(见图3 (b))。KEGG路径分析表明,信使rna coexpressed mir - 375参与PI3K-Akt刺激神经组织的配体相互作用的信号通路和MAPK信号通路(见图3 (c))。虽然我们没有观察到浓缩有关胰腺癌发展途径,我们的研究结果表明,mir - 375有一个广泛的影响在ESCs的分化为胰岛素生产细胞转录。

3.4。mir - 375目标基因广泛参与分化的过程

确定mir - 375对胰腺分化基因的影响,我们选择272 mir - 375目标基因构建的热图和分类这些基因(见图4(一))。在干细胞分化,mir - 375目标基因的表达模式显著改变。大多数mir - 375目标高度表达的基因主要集中在第二阶段我的分化。的分化,mir - 375目标基因的表达被普遍低。mir - 375超表达后,大多数基因并没有显著改变。只有一小部分基因显著增加或减少过度mir - 375后,但这种变化通常只专注于一个或几个阶段的区别。

我们还分析了函数浓缩mir - 375的目标基因(见图4 (b))。我们专注于最丰富胰腺发育相关的基因集。在272年选择mir - 375目标基因,基因有关腺发展(20/272)和细胞命运的承诺(14/272)功能占最大的比例。上皮细胞分化(6/272)和胰腺癌发展(9/272)在胰腺癌发展高度相关。后功能富集分析,mir - 375目标基因在胰腺癌高纯度分化和细胞命运的功能。这些基因集包括重要的转录因子在胰腺细胞的体外分化,如HNF1βB,PAX6,INSM1,GATA6,PDPK1,INSR。这一结果表明,mir - 375可能影响胚胎干细胞的体外胰腺癌发展通过其对目标基因的影响。

我们还研究了集群mir - 375目标基因的表达模式在控制细胞的分化,以及基因分为0到9的集群。上的数字图的左上角4(c)代表聚类,左下角的数字代表基因在不同的集群,集群的数量和颜色的模块的指示意义 (见图4(c))。聚合中10基因,基因的表达水平9(包含40个基因)继续增加,基因的表达水平设置0(包含19个基因)继续减少。数9包括胰腺发育,细胞命运的承诺,胰腺β细胞分化,和其他功能相关的转录因子,如FOXF1,PAX6,INSM1,GATA6,PDPK1,NR5A2,INSR。数0包括腺发育,细胞命运的决心,腺上皮细胞分化,和其他功能相关的转录因子,如HOXA5,LRP5,CCDC39,KLF4,ASCL1,RBPJ,JAK2。虽然这些基因是mir - 375的目标基因和它们的功能有关胰腺分化,细胞的命运,和其他相关的功能,在分化明显不同的表达模式。结合其他八集,这是表明,mir - 375的目标基因在胰腺癌发展遵循各种各样的表达模式,涉及到整个细胞分化的过程。这些结果还表明,mir - 375可能影响多个目标基因的表达在分化的不同阶段,它会影响在同一阶段不同的目标。

3.5。超表达mir - 375会导致多个信号通路在胰腺发育的变化

确定mir - 375如何影响胰腺癌发展,我们构建了一个独特的基因影响的地图在分化的不同阶段(见图5(一个))。随着独特的基因数量的影响在舞台上我显著大于其他阶段的细胞分化,有相对更独特的基因之间的十字路口D3和D6, D10, D13 D17, D21。然而,对于其他阶段,无论两个或三个阶段被认为,独特的基因交叉的数量没有明显大于其他阶段,这表明基因表达过程中胰腺的ESCs显然stage-specific分化。这也表明,一些独特的基因继续存在,并更清楚地表达。例如,FRG1和KCNK15更有高度表达了D13 D10和D17但是下降。DUS4L只有D10和D13更高。

进一步研究如何mir - 375规范ESCs胰腺分化的过程中,我们选择不同的途径从早期胰腺癌发展到后期胰岛素secretion-related通路,如WNT信号通路(hsa04310)(157个基因),切口信号通路(hsa04330)(52个基因),刺猬信号通路(hsa04340)基因(50),年轻人成熟发病型糖尿病(hsa04950)(包括26个基因)进行进一步分析。我们构建的热图显示基因在这些途径的重大变化(见图5 (b))。虽然分化的过程为模拟体内胰腺的发展,关键信号通路在细胞分化的影响有所不同胚胎发育。诺和WNT信号通路主要富集在胰岛细胞分化的早期阶段。刺猬信号通路的影响对胰岛细胞的分化是反映在早期和晚期分化。此外,基因在成熟的发病糖尿病的年轻人(hsa04950)途径(如HES1,GCK,FOXA3,MAFA,HNF4A,HHEX,PDX1在第四阶段II)增加;这些基因与胰岛素分泌和胰腺的成熟β肽(见图5(c))。

理解特定基因的变化从每个通路过度mir - 375后,我们构建了一个热图从选定的基因(见图5(c))。后发现mir - 375的过度表达,一些基因显著增加或减少。例如,在早期分化后mir - 375的过度表达,表达的NOTCH2和DLL3基因在切口和WNT信号通路减少增加。CXNK1EWNT信号通路中的表达,PAX4hsa04950通路的表达。提供一个更准确的说明的影响mir - 375 pancreatic-related途径关键基因,我们利用转录组数据来创建一个地图后关键基因的表达水平过度mir - 375(见图S3)。NOTCH信号通路,mir - 375的超表达的表达减少NOTCH2D3、D10 D17, D21和减少MAML1D10和D13。mir - 375的超表达D10的表达减少DLL4D13后,mir - 375的超表达的表达增加DLL4。WNT信号通路,mir - 375的超表达的表达增加SMURF1在分化的早期阶段(D3-D10)。刺猬信号通路,mir - 375的超表达也增加了的表情SFRP1在舞台上我的区别(D3-D10)。hsa0495信号通路,mir - 375的超表达的表达减少HNF1β和NEUROG3在第二阶段的区别。这些结果表明,mir - 375广泛受到胰腺癌发展途径的影响,而这些影响是通过改变基因在这些通路。

目标基因的超表达后的变化mir - 375确定RNA-seq数据如图6(一)。尽管结果不同于那些通过rt - pcr,目标基因的表达变化引起的mir - 375的超表达mir - 375与此相仿。例如,rt - pcr和RNA-seq过度后的数据显示,mir - 375,HNF1β减少在D6, D10, D21和NOTCH2减少D17和D21。GATA6减少在D3,PAX-6降低D13,ISNM1在D17和D21下降。mir - 375的目标基因PAX6,HNF1β,INSM1,GATA6,NEUROG3胰腺癌发展转录因子,如INS,POU5F1,GATA4,PDX-1胰腺分化过程中,占据重要的核心位置(见图6 (b));在分化为成ipc, mir - 375控制pancreatic-related转录因子通过不同的目标基因,而这些目标基因在每个阶段不同。

4所示。讨论

作为一个最丰富的小分子核糖核酸在胰腺的增长和发展,mir - 375是专门表达胰岛细胞和胰岛的调节胚胎发育;反过来,成熟的过程和功能胰岛β肽影响胰岛素的合成和分泌16]。在老鼠身上,mir - 375是高度表达的小岛和正常葡萄糖体内平衡是至关重要的。老鼠缺乏mir - 375 (375 ko),高血糖的更多的α肽,高血浆胰高血糖素水平,增加糖质新生和肝葡萄糖输出(29日]。研究表明,在人类糖尿病2型糖尿病和其他啮齿动物模型,细胞外水平mir - 375 - 3 - p的影响。然而,在人类与1型糖尿病(近年来)和小鼠模型,近年来,mir - 375 - 3 - p是一贯发现调节血浆样品中(30.]。mir - 375的循环水平可能反映的变化β肽和可能改变病人的血最近诊断为近年来(12,31日]。简而言之,mir - 375是复杂与胰腺的形成和胰岛素的分泌。研究已经证实,没有添加各种细胞因子和小分子化合物,mir - 375的超表达可用于区分万能或的ESCs IPCs后21天的离体培养,但分化效率和成熟度仍不令人满意32,33];mir - 375的超表达后脂肪干细胞,诱导表达胰岛素也可以产生更多的ipc和Pdx134]。

在这项研究中,我们转染脂质体mir - 375模拟和抑制剂在细胞分化过程中过表达和抑制mir - 375,分别。rt - pcr、免疫荧光染色和免疫印迹被用来观察mir - 375细胞分化的影响。3 - 4天的每个阶段,mir - 375的高表达可以有效地维护。然而,在抑制实验,mir - 375的表达并不是发生了重大的变化,这可能与mir - 375的表达。RNA-seq数据显示,mir - 375的影响主要集中在内胚层形成(I期)。受影响的基因总数和基因改变的程度明显高于其他阶段。mir - 375可能影响ESCs的分化成内皮细胞。这也表明,转型为内皮细胞获得分泌细胞的关键一步。

在II期四期的分化,基因的数量受到mir - 375的超表达是小,但mir - 375的超表达显著影响胰腺differentiation-related重要转录因子的表达,如NGN3和PDX1。这表明基因受到mir - 375的数量减少随着分化的发展,但影响将更具体的,此外,影响细胞命运和胰岛素分泌通过特定的转录因子。的许多目标基因mir - 375与胰腺癌相关开发和干细胞命运观念,这证实,mir - 375的方式影响的ESCs的转换成分泌细胞是其目标基因密切相关。

解释mir - 375如何影响胰腺的发展,我们分析了mir - 375的影响在其靶基因和胰腺癌发展基因超表达,如PDPK1,INSM1,HNF1B,GATA6,NOTCH2,PAX6,CADM1。mir - 375的超表达减少在一个特定的阶段目标基因的表达。的表达NGN3阻遏蛋白,HES1,受到跨膜蛋白切口(35]。我们推测,mir - 375减少的表达HES1通过抑制NOTCH-HES1通路的表达,进一步增加NGN3。的增加NGN3表达式是更有利于ESCs的分化成胰岛细胞和胰岛素的分泌。此外,mir - 375的目标基因PAX6和CADM1是与胰岛素分泌有关。

据报道,mir - 375能促进的沉默PAX6和胰岛素分泌减少36,37]。PAX6抑制的可行性、迁移和入侵人类乳腺癌MCF-7细胞,而CADM1在INS-1抑制胰岛素分泌细胞和主细胞(38]。有趣的是,这两个PAX6和CADM1目标基因mir - 375和mir - 375的超表达阶段II, III的分化减少的表达吗PAX6和CADM1;然而,研究表明,两种PAX6和CADM1胰岛素分泌相关但产生相反的效果。我们推测,在为其分泌到ipc, mir - 375同时影响CADM1和PAX6基因改变胰岛素的水平。

在我们的实验中,的表达胰岛素增加mir - 375中后,建议mir - 375可能有助于稳定的胰岛素,mir - 375水平目标基因CADM1在这一过程中可能发挥重要作用。总之,mir - 375的表达变化在hESC分化,影响mir - 375模拟和mir - 375抑制剂。mir - 375影响全球基因表达和mir - 375的目标基因。mir - 375诱导的超表达多个信号通路在胰腺发育的变化。mir - 375广泛参与胰腺癌的分化β通过不同的目标基因在不同阶段的肽。本研究为进一步的研究提供了一个基础为小分子核糖核酸如何影响细胞命运和基因转录。

数据可用性

转录组测序数据用于支持本研究的发现是可用的https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA715080。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

宇,徐Wang Jing Wang判断,永丽悦,Yajuan夏,和李Xueling同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是财政支持的重大项目的内蒙古自然科学基金(2020号zd10)、科技重大项目中国内蒙古自治区(zdzx2018065和2020 zd0007),以及中国的国家自然科学基金(81471001)。

补充材料

补充表1:rt - pcr引物。图S1: Wnt3a不同浓度对细胞分化的影响,mir - 375的表情。图S2: pancreatic-related目标基因的表达水平的检测通过rt - pcr后不同阶段过度mir - 375。图S3:过度的影响mir - 375在不同阶段的转录因子的表达水平在不同的信号通路。(补充材料)

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