雷帕霉素治疗肌腱干细胞/祖细胞减少通过上调自噬细胞衰老

文摘

老年人人口容易病变是由于体内腱的变化,如细胞衰老和调节炎症的能力下降。老化可以渲染肌腱干细胞/祖细胞(tsc)过早衰老。我们调查了雷帕霉素的影响,特定mTOR抑制剂,tsc的衰老。我们第一次表明,博来霉素体外治疗后,大鼠膝tsc (PTSCs)接受衰老,特点是形态变化,senescence-associated的感应β牛乳糖(SA -β加)活动,增加p53、p21, p62蛋白表达。衰老PTSCs也以MMP-13和TNF的表达升高α基因,这两个分子特征的慢性病变。然后我们发现雷帕霉素治疗可以逆转上述衰老表型和增加衰老PTSCs自噬。自噬的激活和衰老救援,至少在一定程度上,由于HMGB1的易位细胞核的细胞溶质函数作为自噬促进剂。通过减少TSC衰老,雷帕霉素可以作为治疗抑制病变的发展促进自噬的老龄化。

1。介绍

病变是一种普遍的肌腱紊乱,影响数以百万计的美国人,每年数十亿美元的医疗费用。衰老被认为是病变的主要危险因素之一,特点是异常增厚,变性,钙化的肌腱组织(1,2]。老化减少肌腱保持结构完整性的能力,很大程度上是由于肌腱内的干细胞群的损失。肌腱干细胞/祖细胞(TSC)人口中起着重要作用在肌腱体内平衡和修复tenocytes代替失去的成熟。tsc也被认为有助于病变的发病机制(3]。最近的研究表明,tsc的频率和扩散率都降低,细胞周期进程和在年龄tsc延迟,这可能损害肌腱再生能力和腱子病变衰退导致老年性1,4]。尽管众所周知,TSC增殖和分化的潜力下降与衰老,调节TSC衰老的机制知之甚少。

干细胞数量和活动受到多种机制,包括增殖、分化、凋亡、衰老(5]。这些细胞机制的进步损失占干细胞的功能障碍。细胞进入衰老状态,当他们不能再划分存在的大量增长的因素。衰老细胞的关键特性是senescence-associated的表达分泌表型(SASP)。典型的细胞衰老的特征包括扩大细胞大小形态异常和抗细胞凋亡。此外,upregulation senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β加)活动和p21和/或p16^Ink4a介导的不可逆细胞循环逮捕是衰老的分子指标5]。重要的是,它已经表明,衰老细胞的数量与正常衰老呈正相关的各种器官和组织,包括肌腱(6- - - - - -9]。

衰老可以诱导的DNA损伤,支持促进衰老标记与端粒功能障碍,等典型的损伤诱导氧化应激,紫外线(10]。同样,研究发现,博来霉素导致DNA损伤的单、双链断裂,导致衰老在肺泡上皮细胞和成纤维细胞(11,12]。另一方面,衰老已被证明是阻止通过自噬,这反过来有助于维护细胞随着时间的推移“具备干细胞”(13,14]。自噬展品根本重要性在细胞内稳态和组织重构在正常发展,而且对干细胞的维护和自我更新是至关重要的。此外,自噬被牵涉进调节干细胞的分化和他们的后代15]。最近的研究强调了核心作用的自噬在平衡休眠,自我更新,和干细胞的可塑性,和自噬的活动可以定量监测通过测量自噬的水平标记,如microtubule-associated蛋白质1 a / b光链3 (LC3)和p62 / SQSTM1 [16]。

自噬是由一系列的信号转导途径,其中,一个紧,逆相关的自噬诱导和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)激活已经完善17- - - - - -19]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR是一个重要的调节多种细胞功能。在慢性炎症,mTOR控制免疫和多发地细胞的增殖,并促进细胞因子和趋化因子的表达来决定细胞命运,迁移和入侵。mTOR还可以促进细胞外基质的重构,导致纤维化的发生在发炎区(20.]。雷帕霉素,鉴于此类mTOR的功能意义,一个强有力的mTOR拮抗剂,据报道,抑制白介素2 -(2 -)刺激T细胞增殖和给予免疫抑制,为其开发的重要治疗前景。雷帕霉素在1999年首次批准的同种异体移植物保护肾移植受者,2002年批准为antirestenosis方面患者冠状动脉修复(21]。近年来,雷帕霉素的利益有被吸引到其潜在的抗癌药物,以及它的有利影响许多动物模型所示神经退行性病变和骨关节炎22,23]。此外,研究人员发现协会mTOR通路信号与老化细胞和有机体的活动(24]。mTOR的拮抗剂,雷帕霉素阻碍多个方面的老化小鼠和减慢衰老在正常和progeric人类细胞25- - - - - -27]。因此,mTOR通路互连细胞衰老,生物的衰老,疾病与衰老有关。

等衰老诱导的DNA损伤和活性氧(ROS)已被证明诱导细胞应激反应。可以感觉到这些“危险”信号由一群fast-reacting内生有关分子模式(潮湿)分子,这将导致时空调控的信号转导,将决定细胞命运的28]。高机动组框1 (HMGB1)守恒的核内蛋白,可以扮演亚细胞localization-dependent角色在压力(29日]。我们的兴趣,胞质HMGB1报道诱导自噬(30.]。因此,本研究旨在研究衰老之间的关系和自噬在老鼠tsc,通过评估博来霉素和雷帕霉素治疗的效果和处理相关的分子机制。我们的数据表明,雷帕霉素可以减少TSC衰老,可能通过upregulation自噬。

2。材料和方法

2.1。髌肌腱干细胞(PTSC)隔离和文化

PTSCs髌腱的孤立的女性Sprague-Dawley (SD)大鼠(5个月)基于以前公布的协议(31日]。老鼠的协议使用的是匹兹堡大学的IACUC批准。短暂,肌腱鞘髌肌腱被获得的核心部分肌腱。腱样本然后剁碎成小块,每100毫克湿组织样本消化1毫升磷酸缓冲盐(PBS)包含3毫克胶原酶I型(GIBCO)和4毫克dispase (GIBCO) 37°C 2 h。在3500转/分钟离心后15分钟把酶,细胞培养的生长介质组成的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Lonza)补充20%胎牛血清(的边后卫;双子座生物制品),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(热科学)在37°C公司为5%₂。每3天中被改变,细胞分裂时融合了90%以上。在所有文化进一步实验,PTSCs通道2。

2.2。博来霉素tsc和雷帕霉素治疗

所有治疗,老鼠PTSCs镀的密度 细胞/在常规增长12-well细胞培养板的媒体。细胞被完全连接后,科汉解释说媒体取代含药增长与减少的边后卫媒体(10%)。具体来说,博来霉素治疗,细胞治疗10μ50 g / ml或μg / ml博来霉素(微孔)在37°C公司为5%₂5天,增长与减少的边后卫媒体(10%)被用作控制。雷帕霉素治疗,细胞与不同浓度的雷帕霉素治疗(0.1 nM, 1纳米,10 nM, 25 nM, 50 nM,和100 nM,σ)在37°C公司为5%₂3天,DMSO作为控制。博来霉素和雷帕霉素治疗,细胞治疗50μg / ml博来霉素和25 nM雷帕霉素在37°C公司为5%₂5天,DMSO控制。

2.3。Senescence-Associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色

β-Galactosidase-positive细胞衰老细胞组织化学染色法检测到的装备(Sigma-Aldrich)。简单,洗两次了PBS的单层细胞固定6到7分钟之前,紧随其后的是另一个洗PBS的三倍。然后,染色混合添加,细胞被孵化一夜之间在37°C。孵化后,细胞被拍到在倒置显微镜(尼康Eclipse, TE2000-U)。

2.4。免疫印迹分析

细胞细胞溶解使用里帕裂解缓冲(σ)与1毫米PMSF(σ),根据制造商的建议的过程。所有的样本进行总蛋白浓度测定用BCA蛋白质化验设备(热科学),以确保平等的加载。加载缓冲区添加到30μg蛋白和10% sds - page凝胶分离之前转移到PVDF膜(Bio-Rad)。这些墨迹被封锁使用5%脱脂奶粉(Bio-Rad)在室温下1 h与一夜之间轻轻摇晃,然后孵化主要抗体LC3A / B(细胞信号,1:1000),SQSTM1 / p62(细胞信号,1:1000),p-S6(细胞信号,1:1000),S6(细胞信号,1:1000),p53(细胞信号,1:1000),p21 (Abcam, 1: 1000), HMGB1 (Abcam, 1: 1000),组蛋白H3(细胞信号,1:2000)β肌动蛋白(Abcam 1: 10000)。相应的二次抗体(LI-COR生物科学,1:15000)孵化第二天进行1 h在室温下,与三个洗中间孵化项目PBS-T缓冲区。然后,乐队的蛋白质被LiCoR可视化奥德赛成像仪(LI-COR生物科学)。Semiquantification用NIH ImageJ执行软件。

2.5。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)。合成第一链cDNA 20μ从1 l反应体积μ与上标2 g总RNA,反转录表达载体。互补脱氧核糖核酸合成的条件是65°C, 5分钟冷却1分钟在4°C,然后42°C 50分钟,72°C,持续15分钟。存在是用试剂盒QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)。Rat-specific引物用于rt - pcr是TNF -α:5 - - - - - -AAA TGG GCT CCC TCT猫CAG TTC-3(向前),5 - - - - - -TCT GCT TGG TGG TTT GCT ACG AC-3(反向);il - 6: 5 - - - - - -太极拳TAC CCC AAC TTC CAA TGC TC-3(向前),5 - - - - - -TTG手枪GGT CTT GGT CC-3有条件现金转移支付标签(反向),MMP-13: 5 - - - - - -CTG ACC TGG手枪TTC CAA AA-3(向前),5 - - - - - -ACA CGT GGT CTG AGA AG-3移行细胞癌(反向)32,33]。GAPDH是作为内部控制。所有的引物合成表达载体。最初的变性后10分钟在95°C, PCR进行30周期GAPDH和TNF - 40周期α、il - 6和MMP-13,变性为50秒95°C在每个周期和退火30秒58°C。每个基因的相对表达水平检测独立至少三次。2数据进行了分析^−ΔΔCt方法。

2.6。免疫荧光分析HMGB1易位

细胞被播种在幻灯片4室(热科学),治疗25 nM雷帕霉素或DMSO 12 h,独自或与哈佛商学院刺激(热科学)对3 h,并且每组与降低的边后卫,恢复增长媒体(10%)12 h。然后,这些细胞被洗两次PBS和4%多聚甲醛固定在室温下15分钟。固定细胞处理0.1%的海神x - 100 15分钟,然后用PBS洗了三次。阻塞后2%牛血清白蛋白(BSA) 1小时在室温下,这些细胞被孵化与兔子anti-rat HMGB1抗体(Abcam, 1: 250)在一夜之间在4°C。与PBS洗细胞后,Cy3-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(1:500年,表达载体分子探针)申请1小时在室温下。细胞也复染色H33342染色(σ)。染色细胞成像使用尼康A1共焦显微镜(尼康)。

2.7。细胞增殖实验

细胞增殖是由细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析根据制造商的指令(σ)。简单地说,100年μl培养基(DMEM + 10%的边后卫)包含 细胞被播种在96孔板在37°C和孵化24小时允许附件。然后,用新鲜培养基中取代了含雷帕霉素(微孔)浓度表示。72 h后文化中被移除,10μl与100年CCK-8解决方案μl培养基添加到每个37°C,孵化出了另一个2小时。吸光度是记录在450 nm使用微型板块读者(SpectraMax M5、分子设备)。此外,细胞增殖与血细胞计数器是由标准评估细胞计数。

2.8。统计分析

单向方差分析(方差分析),紧随其后的是费舍尔LSD事后考验的多重比较。所有统计测试是通过使用GraphPad棱镜7 (GraphPad软件)。差异与值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。博来霉素诱导PTSC衰老

当老鼠PTSCs各种浓度的博来霉素治疗,疗程5天,他们开始表现出细胞衰老的典型形态,表明细胞形状的变化不同,放大,平坦的表现型(图1(a))。这种形态变化是伴随着senescence-associated增加β加(SA -β加活动(图)1(b))和剂量依赖性的方式(图1(c))。具体地说,超过80%的老鼠,PTSCs演示了一个获得SA -β加活动后接触到50μ博来霉素5天的g / ml(数字1(b)和1(c))。当我们从年轻的肌腱组织相比(2.5个月)和年龄(18个月)的老鼠,我们发现类似的SA -β加活动,观察PTSCs体外染色的。同时,享年肌腱与年轻人相比表现出明显的组织变性肌腱(图1(d))。这些结果表明,博来霉素治疗诱发细胞衰老大鼠PTSCs;因此,博来霉素治疗PTSCs可以作为调查TSC衰老体外实验模型。

3.2。雷帕霉素降低PTSC衰老

我们调查是否bleomycin-induced自噬细胞衰老是可以预防的。我们首先测试了PTSC各种剂量的雷帕霉素的敏感性,经典的自噬激活。我们发现存在剂量依赖的相关性减少干细胞生长(图2(一个))。尽管如此,雷帕霉素被PTSCs耐受性良好。当他们接受25 nM雷帕霉素结合衰老诱导物博来霉素,细胞形态保存下来,否则被博来霉素改变(图2 (b))。同时,雷帕霉素显著降低了SA -β加活动,与细胞衰老相关的另一个特点(图2 (b))。虽然它不是一个完整的救援相对于参与控制,semiquantification分析证实,雷帕霉素可以显著降低TSC衰老博来霉素所致(图2 (c))。

3.3。通过上调自噬雷帕霉素降低PTSC衰老

进一步研究自噬的作用在调节PTSC衰老的潜在机制,我们研究了自噬标记和SASP标记的蛋白表达水平与博来霉素和雷帕霉素治疗。首先,我们发现p62的表达,与自噬呈负相关,增加了bleomycin-treated PTSCs(图3(一个))。雷帕霉素的逆转p62表达式的基础水平在对照组(数字3(一个)和3 (b))。与此同时,作为自噬激活的指标(19],LC3 II / LC3我表达率明显降低PTSCs博来霉素治疗,但雷帕霉素引起了这种减少(数据3(一个)和3 (c))。此外,我们发现雷帕霉素剂量的25 nM完全抑制下游响应者S6磷酸化,指示的抑制mTOR信号通路(图3(一个))。

当我们检查了SASP标记,我们发现p53的表达是由博来霉素诱导治疗,表明DNA损害升高。这是伴随着p21表达略有增加,确认博来霉素带来的激活细胞衰老。最后,雷帕霉素降低p53、p21表达在这些PTSCs(图3(一个))。综上所述,抑制PTSC衰老的雷帕霉素,至少部分,通过自噬的upregulation标记。

3.4。雷帕霉素促进易位的HMGB1核胞质

接下来,我们研究了HMGB1的亚细胞表达,这是一种抑制响应DNA损伤应力和自噬的关键调节器28]。当PTSCs培养标准自噬诱导物哈佛商学院,或与雷帕霉素治疗,HMGB1显然从细胞核转移到胞质,如免疫染色结果(图所示4(一))。此外,细胞间的免疫印迹显示细胞核HMGB-1蛋白水平的降低,同时增加HMGB1表达的雷帕霉素治疗后细胞溶质(数字4 (b)和4 (c))。类似的结果从哈佛商学院和雷帕霉素治疗表明HMGB1的相关性与自噬激活nucleus-to-cytosol易位。

3.5。雷帕霉素降低降解反应和炎症

我们之前的研究表明,HMGB1被释放到细胞外基质时跟腱受到过度的机械应力,导致肌腱炎症(34]。鉴于HMGB1的活跃的亚细胞易位引起自噬在TSC,如上所示,我们下一个调查博来霉素和雷帕霉素治疗的影响肌腱炎症反应基因的表达。老鼠PTSCs博来霉素处理显示的重要upregulation分解代谢的基因MMP-13,大大减少了与雷帕霉素治疗,而未经处理的控制(图5(一个))。但是没有显著差异的il - 6基因表达与博来霉素或雷帕霉素治疗(图5 (b))。此外,雷帕霉素显著降低炎症标记TNF -α基因表达是高架PTSCs接触时(图博来霉素治疗5 (c))。综上所述,这些结果表明,博来霉素治疗可能诱发炎症/ PTSCs分解反应,等消极反应可能逆转,至少部分,雷帕霉素治疗。

4所示。讨论

肌腱干细胞的数量和他们的自我更新潜能腱子病变衰退降低老年患者与年轻患者相比,导致受损的可能角色干细胞分化潜能,在肌腱结构老化(35]。细胞衰老和与年龄有关的组织功能障碍的相关性一直假设[36]。tsc岁/堕落人类跟腱活检展览扩散和clonogenicity赤字伴随着过早进入细胞衰老upregulation p16^Ink4a。干细胞变得疲惫在肌腱衰老和退化,大小和功能性。足够健康的干细胞是必不可少的肌腱组织再生(37]。我们的研究联系肌腱干细胞衰老雷帕霉素的逆转,可能通过诱导的自噬。这项研究可能对预防细胞衰老有重要意义和aging-induced病变,以及小说的选择治疗慢性肌腱疾病的目标。

我们的结果表明,博来霉素的治疗,DNA损伤剂,诱导鼠PTSC细胞衰老。衰老是提高senescence-associated的特征β牛乳糖活动以及senescence-associated细胞形态学的变化。博来霉素诱导的衰老表型在PTSCs也是一致的,在肺泡上皮细胞(11]。另一方面,雷帕霉素可以延长寿命在多个物种,包括酵母、果蝇和老鼠,减速,DNA损伤积累和细胞衰老38,39]。作为mTOR的抑制剂,雷帕霉素是一种老化的药理复兴的前景干细胞(40]。我们的研究结果表明,雷帕霉素部分减少senescence-associatedβ加活动和形态学改变,这表明,雷帕霉素逆转衰老的老鼠PTSCs在分子和细胞水平。

自噬是一个主要通过自噬细胞死亡机制维持细胞内稳态。研究表明,自噬的活动由高间叶细胞,观察造血,真皮,表皮干细胞(13,41]。自噬在控制中扮演着重要角色具备干细胞的自我更新和干细胞,且不断增长的证据与自噬和mTOR信号通路(42,43]。雷帕霉素底层抗衰老的机制提出的包括翻译,使之抑制自噬增加,压力增加,新陈代谢,改变电阻(44]。在这项研究中,我们已经表明,博来霉素治疗增加了p62表达式,同时减少LC3 II / LC3我比,和雷帕霉素治疗逆转这些博来霉素引起的分子变化,因此将衰老tsc的路由到自噬信号。这些发现支持这一观点的有利影响雷帕霉素的TSC衰老可能通过自噬诱导的机制。

HMGB1一守恒的核内蛋白亚细胞自噬的调节localization-dependent角色。人们已经发现,HMGB1基因敲除小鼠出生后不久死亡,和增加HMGB1表达抑制细胞凋亡在各种类型的癌细胞30.,45]。HMGB1在人体病变的显示,它可以调节炎性细胞因子和矩阵的变化(46]。然而,HMGB1的表达细胞溶质中它的作用诱导自噬的先决条件。在这项研究中,我们发现雷帕霉素提升HMGB1易位的核胞质,这是直接参与积极的促进和维护细胞自噬的强调。PTSCs HMGB1的分泌到细胞外环境中无法(数据未显示),这表明一个特定的协会HMGB1自噬的激活而不是炎症。

最近的证据表明,持续的DNA损伤会引起炎性细胞因子的释放,生长因子、蛋白酶与细胞外环境(47]。在这项研究中,我们发现,博来霉素可以促进促炎细胞因子的重要upregulation TNF -α和蛋白酶MMP-13而不影响il - 6基因表达。这是符合先前的调查结果,衰老细胞过度分泌分子的表达增加与炎症有关,和TNF水平上升α和MMP-13可以加速体内肌腱变性48,49]。因此,tsc进入衰老可能获得SASP加速肌腱变性。在这里,我们表明,雷帕霉素显著降低TNF的表达α与MMP-13高架与博来霉素治疗,建议一个抑制SASP在转录水平。以前的研究已经表明MMP-13增加人体病变,并增加在大鼠肌腱MMP-13可能发挥主导作用矩阵退化后疲劳损伤(50,51]。因此,我们的数据可能会揭示在肌腱潜在生理效益矩阵完整性带来的雷帕霉素。

一个潜在的本研究的限制是,我们只使用一个senescence-inducing刺激,博来霉素诱导TSC衰老。然而,在生物的衰老的过程中,单个细胞经历多个细胞压力,包括各种各样的基因毒性、proteotoxic,有丝分裂压力(52]。这些刺激信号通过各种途径,最终导致衰老的机制也可能随细胞类型和条件。因此,它将必须检查mTOR通路的影响各种senescence-promoting压力。未来的研究还应该地址是否雷帕霉素诱导衰老的tsc肌腱形态学和分子变化。

5。结论

这项研究显示,雷帕霉素治疗减缓可能代表小说发展的腱子病变衰退aging-associated通过促进自噬通过抑制TSC衰老。进一步的研究在活的有机体内需要确认mTOR信号的参与和相应的机制和自噬的预防aging-induced病变。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

DN和生理改变进行了实验和分析数据。DN和WW起草了手稿。JW生理实验设计和修订后的手稿。DN、JS和生理分析和解释数据。YZ导致统计分析。所有作者进行审核和批准的最终版本的手稿。

确认

我们感谢Bhavani P Thampatty博士的协助准备手稿。

这项工作的部分支持由美国国立卫生研究院(AR061395),匹兹堡胡椒中心试点研究资金(P30AG024827) (JHW)和重庆市教委科学技术研究项目(KJQN201900450) (DN)。

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