Semaphorin3B促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化High-Glucose微环境

文摘

骨髓间充质干细胞(bmsc)起着关键作用在骨和骨代谢和已经被公认为最受欢迎的骨组织工程种子细胞对骨骼疾病。然而,high-glucose (HG)条件在2型糖尿病(T2DM)病人体内产生有害对BMSC增殖和成骨分化的影响。Semaphorin 3 b (Sema3B)增加成骨细胞分化骨代谢。在这里,我们确定的角色Sema3B增殖和成骨分化的bmsc HG微环境。HG微环境降低了Sema3B bmsc的表达式。此外,HG抑制BMSC扩散。此外,汞抑制成骨分化bmsc通过减少骨形成标志物的表达,碱性磷酸酶(ALP)的活动,和矿化。然而,政府重组Sema3B逆转这些影响。此外,我们的研究发现Sema3B可以激活bmsc Akt通路。Sema3B救援缺陷在HG BMSC增殖和成骨分化微环境通过激活Akt通路。 These effects were significantly reduced by treatment with an Akt inhibitor. Together, these findings demonstrate that Sema3B promotes the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs via the Akt pathway under HG conditions. Our study provides new insights into the potential ability of Sema3B to ameliorate BMSC proliferation and osteogenic differentiation in an HG microenvironment.

1。介绍

骨髓间充质干细胞(bmsc)具有分化成各种类型的细胞,如成骨细胞、软骨细胞和其他细胞类型(1- - - - - -3]。bmsc发挥重要作用在骨和骨代谢1- - - - - -6]。抑制增殖和成骨分化的bmsc诱发骨代谢障碍和产生多个骨质流失的疾病,包括骨质疏松、牙周炎,牙齿植入失败(2,7,8]。此外,bmsc已经成为一个有吸引力的选择种子细胞成骨细胞的疾病的治疗(6- - - - - -8]。然而,许多致病因素抑制bmsc的增殖和成骨分化,导致增加骨质疏松(9- - - - - -12]。例如,high-glucose条件在2型糖尿病(T2DM)病人体内产生有害对BMSC增殖和成骨分化的影响9,13- - - - - -15]。

2型糖尿病是一个非常普遍的全球代谢性疾病,特点是过度的血糖,胰岛素抵抗,胰岛素相对缺乏16]。2型糖尿病与骨重建受损有关,骨量减少,骨质疏松症和其他糖尿病引起的骨骼疾病17- - - - - -19]。糖尿病影响骨代谢,抑制骨形成,阻碍骨折愈合(20.,21]。越来越多的证据表明,high-glucose环境抑制BMSC增殖和成骨分化,诱导糖尿病骨病(9,13,15,22- - - - - -24]。代理可以促进成骨的分化和增殖的bmsc可能代表有前途的候选人改善糖尿病骨病bmsc的障碍。

分泌糖蛋白在细胞表面,semaphorins能够调节细胞生长,细胞分化,细胞迁移在不同组织(25,26]。一些研究表明,一些semaphorin家族蛋白质是骨骼的重要的调节体内平衡(25- - - - - -27]。以前的研究已经表明,semaphorin 3 b (Sema3B)与骨代谢过程(28- - - - - -30.]。1,25 (OH)₂D₃建议增加转录Sema3B的成骨细胞(28]。成骨细胞来源于转基因老鼠Sema3B的过度表达可能促进BMSC体外成骨分化,而损耗的Sema3B受损BMSC成骨细胞的分化(29日,30.]。此外,肿瘤坏死因子-α减少Sema3B表达式通过抑制Wnt信号,但Sema3B过度扭转bmsc的成骨的缺陷处理TNF -α(29日]。Wnt信号是参与这个过程29日]。然而,Sema3B BMSC增殖和成骨分化的作用在high-glucose微环境仍未阐明。因此,本研究旨在调查的影响高葡萄糖bmsc的增殖和成骨分化,在这个过程中澄清Sema3B的作用。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

鼠标bmsc从六个雄性C57BL / 6小鼠被孤立。简而言之,股骨和胫骨骨无菌移除。骨髓冲洗了培养基组成的αmem(美国表达载体)补充20%的边后卫(HyClone,罗克福德)和1%的青霉素和链霉素。然后,细胞被允许公司37°C和5%的速度增长₂。伴着被微分粘附文化塑料分离。附加的细胞生长在培养基,用于进一步的实验。所有程序老鼠通过中山大学动物伦理和福利委员会,中国。

high-glucose治疗(HG)组,bmsc受到高葡萄糖通过孵化中葡萄糖25毫米。正常葡萄糖(NG)治疗组治疗5.5毫米葡萄糖。一种蛋白激酶信号通路的抑制,细胞用Akt抑制剂预处理(MK2206)浓度的10μM(谢立克,中国)。

2.2。流式细胞术

标记BMSC表面表达评估使用FACSCalibur(美国BD生物科学)。简而言之,bmsc通道3使胰蛋白酶化,洗,resuspended PBS。然后, 细胞孵化与PE -或FITC-labeled老鼠细胞表面标记抗体CD29、CD44、CD34、CD45和(BD生物科学),以及同形像控制抗体在4°C为30分钟。然后,使用FACSCalibur样品进行了分析。

2.3。实时聚合酶链反应

总RNA是孤立的,反转录进行使用Omniscript逆转录工具包(试剂盒,德国)。目标使用的引物序列表中列出1。实时PCR是由QuantiTect SYBR®绿色PCR试剂盒(试剂盒)。相对目标基因的信使rna表达水平相比,量化的表达β肌动蛋白使用2^{- - - - - -ΔΔ}CT方法。实时PCR结果呈现的 。

2.4。西方墨点法

总蛋白制备了以m /蛋白分离试剂(热科学)。蛋白质浓度测定用BCA测定试剂(皮尔斯)。短暂,30毫克的样本受到10% sds - page和electrotransferred到PVDF膜。以下主要抗体被用于免疫印迹:Sema3B (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),phospho-Akt (Ser473) (p-Akt)(1: 1000年,细胞信号技术,美国),一种蛋白激酶(1:1000年,细胞信号技术)β肌动蛋白(1:4000)(美国圣克鲁斯生物技术)。PVDF膜被潜伏在一个适当的辣根peroxide-conjugated抗体(圣克鲁斯生物技术)。信号是使用化学发光试剂可视化工具包(皮尔斯)。乐队相对密度计算(J 1.8.0形象,NIH)。

2.5。高山的活动

bmsc ( 细胞/厘米²)处理100 ng / ml Sema3B (ng研发系统、美国)或HG介质长达14天。总蛋白从细胞中提取冰天7和14使用m /蛋白质提取试剂(热科学)。蛋白质浓度评估使用BCA测定试剂(皮尔斯)。高山活动检测使用一个高山活动检测设备(Sigma-Aldrich)。

2.6。矿化分析

综合治疗在成骨分化与重组100 ng / ml Sema3B媒体ng和HG 14天。培养基是每三天更新。矿化了茜素红染色如前所述[14天31日]。然后,细胞接受ethylpyridium氯和量化为550 nm。

2.7。成骨、脂肪形成的bmsc的分化

脂肪形成,伴着( 细胞/厘米²)包含0.1在脂肪形成的分化培养基培养μM地塞米松,1μ胰岛素,200μM domethacin, 250μMisobutylmethylxanthine (Sigma-Aldrich)。媒介是每三天更换一次。21天后,细胞与福尔马林固定,受到0.5% ( )油红O染色(Sigma-Aldrich)。

成骨分化,bmsc ( 细胞/厘米²在成骨分化培养基培养)包含αmem含有10%的边后卫,10毫米β甘油磷酸盐和50毫克/毫升抗坏血酸(Sigma-Aldrich)。21天后,细胞被固定和染色茜素红(Sigma-Aldrich)。

2.8。细胞增殖实验

短暂,bmsc被播种在和孵化实验化合物24、48和72 h。然后,10μl CCK-8解决方案(Dojindo分子技术,日本)被添加到每个实验结束时。吸光度测量在450 nm 2 h后。

2.9。统计分析

所有的数据都显示为 。统计比较是由单向方差分析或双向方差分析。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述鼠标bmsc

bmsc的表型特征被流式细胞术分析,证明这些细胞被CD29 +, CD44 +、CD45和CD34 -。结果如图所示1(一)。

多能干细胞,bmsc分化为成骨细胞的能力评估使用使用油红O染色茜素红肉和脂肪细胞。结果显示阳性染色,证明数据1 (b)和1 (c)。

3.2。HG抑制Sema3B bmsc的表达式

评估影响的HG Sema3B表达式,Sema3B mRNA和蛋白水平的综合测量,实时聚合酶链反应和免疫印迹。实时PCR表明HG显著降低Sema3B bmsc的mRNA水平( )(图2(一个))。蛋白质免疫印迹显示HG显著降低Sema3B表达式( )(数据2 (b)和2 (c))。

3.3。上Sema3B BMSC HG条件下扩散的影响

检测上Sema3B BMSC扩散的影响,我们测量使用CCK-8化验BMSC HG条件下扩散。HG显著降低BMSC扩散比任何其他组在每个时间点。此外,重组Sema3B逆转细胞增殖减少( )(图3(a))。

3.4。Sema3B缓解抑制成骨分化标记

调查的bmsc Sema3B HG微环境的影响,我们评估特定的表达骨生成实时PCR标记。结果表明,骨钙素(OCN), Runx2, I型胶原蛋白α1 (COL1A1),高山bmsc的mRNA水平明显降低治疗HG。此外,Sema3B明显救了OCN减少,Runx2, COL1A1,高山mRNA表达水平HG组(数字4(一)- - - - - -4 (d))。

3.5。Sema3B改善HG-Induced抑制成骨分化

调查Sema3B在成骨分化的作用,我们测量高山活动和矿化与没有Sema3B bmsc (100 ng / ml)治疗。

HG显著降低高山bmsc的活动在7天(1.50 IU /μ(2.01 IU / g)和14天μg) ( )。Sema3B管理显著逆转减少高山活动在指定的时间点(3.10 IU /μ在7天,4.05 IU / gμg(14天)( )(图5(一个))。

矿化明显减少了HG治疗。管理Sema3B显著获救HG-induced bmsc抑制矿化( )(数据5 (b)和5 (c))。

3.6。Sema3B救援HG-Induced Akt通路的抑制

在这个实验中,我们研究了一种蛋白激酶信号之间的关系和Sema3B bmsc增殖和成骨分化在HG微环境。HG显著减少一种蛋白激酶磷酸化而NG组。然而,细胞治疗与Sema3B恢复HG条件下观察到的一种蛋白激酶磷酸化水平降低( )(数据6(一)和6 (b))。

此外,Sema3B高架高山bmsc的活动和扩散。Akt通路抑制废除了Sema3B-mediated诱导bmsc的高山活动和扩散( )(数据6 (c)和6 (d))。

此外,bmsc与MK2206孵化前Sema3B管理。结果表明,Sema3B恢复HG-mediated抑制高山活动和扩散。然而,抑制了Sema3B预处理的保护作用与Akt抑制剂( )(数据6 (e)和6 (f))。结果表明Sema3B改善BMSC的抑制增殖和成骨HG微环境下通过Akt通路。

4所示。讨论

bmsc来源于骨髓基质或结缔组织很容易隔离并进行多能分化;因此,这些细胞被认为是有用的应用程序在各种临床治疗(8,32- - - - - -35]。近年来,积累研究已经证明,bmsc可用于骨缺损修复由于其成骨分化能力(3,4,6,8]。然而,许多病理因素减少增殖和成骨分化,如炎症、high-glucose环境中,和其他因素9,11- - - - - -13]。高血糖的主要原因是一系列的糖尿病并发症,包括糖尿病骨病(15,20.]。据报道,高葡萄糖抑制增殖和成骨分化的bmsc BMP信号通路(36]。此外,最佳的血糖控制已成功确认与vt .骨结合牙科植入在糖尿病患者37]。在我们的研究中,汞减少BMSC扩散。此外,HG的表达减少骨标记bmsc成骨分化。结果与之前的研究一致。然而,成骨分化的bmsc HG条件下并不完全理解。确定因素可能促进HG的BMSC增殖和成骨分化微环境可能揭示有前途的候选人,可以改善伴高血糖诱导骨疾病的功能。

Sema3B参与骨代谢已经在先前的研究报告(28- - - - - -30.]。Sema3B证实提高成骨分化的bmsc [29日,30.]。此外,Sema3B被发现参与雌激素deficiency-induced骨质疏松症(29日]。HG的影响由CCK-8 BMSC扩散进行了分析测定。基于这些结果,HG显著抑制BMSC扩散而引起的的NG组。此外,Sema3B治疗显著逆转HG-induced BMSC增殖的抑制作用。

我们的数据也表明,Sema3B逆转HG-induced OCN减少,Runx2,高山,COL1A1 bmsc mRNA的表达。此外,Sema3B减毒HG-induced减少高山bmsc的活动和矿化。因此,这些观察结果可能表明Sema3B是一种很有前途的候选人为促进骨生成的bmsc HG微环境。

Akt通路在骨骼发育和骨重建中扮演着重要的角色(38,39]。最近,大量的研究表明,高葡萄糖抑制增殖和成骨分化通过灭活PI3K / Akt信号通路在成骨细胞(22,40,41]。在这个实验中,我们观察到Sema3B显著增加一种蛋白激酶磷酸化。然而,用一种Akt抑制剂预处理消除了扩散和高山活动增加HG bmsc的微环境,表明Sema3B促进成骨分化的bmsc HG条件下通过调节Akt通路。

因此,我们发现HG受损bmsc的增殖和成骨分化。此外,我们的研究表明,Sema3B可以防止HG-mediated BMSC Akt通路的障碍通过调制。Sema3B可能代表一个有前途的代理来改善bmsc的HG增殖和成骨分化的微环境。因此,我们的研究可能会导致新见解更有效的临床干预hyperglycemia-related骨骼疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

不存在任何利益冲突的关于提交的手稿,和所有作者批准出版的手稿。

作者的贡献

关丽珍邢和精益冯本研究同样起到了推波助澜的作用。关丽珍邢和精益冯co-first作者。

确认

本研究是国家自然科学基金(批准号81300874)。

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