沃顿商学院的两级分化过程Jelly-Derived间充质干细胞成Neuronal-like细胞

文摘

没有永久的治疗神经退行性疾病,症状出现后不久撤军的药物。更好的治疗结果可以预期如果部分取代受损的神经元功能神经元和/或它们修复使用营养因素。在这方面,安全的细胞疗法已被视为一个潜在的替代常规治疗。在这里,我们已经描述了一个两级文化过程区分沃顿果冻间充质干细胞(WJ-MSCs) neuronal-like在存在各种线索参与神经发生。细胞的命运的每一个阶段的形态学分析,转录和转译的水平。在既定的第一阶段启动,wingless-activated WJ-MSCs穿过边界支持neuroectodermal祖先,确定损失的间充质与相伴的表达特异性神经元标记基因,SOX1,PAX6,NTRK1,NEUROD2。Neuronal-like细胞形成在第二阶段表达了许多成熟的神经元蛋白质像Map2,轴突神经丝,Tuj1和拥有hillock-like结构。总之,大量neuronal-like细胞的分化nontumorigenic和营养因素分泌WJ-MSCs承诺开发治疗神经退行性疾病的治疗策略。

1。介绍

神经退行性疾病,占全球死亡的10%以上,由于损失或产生的神经元功能障碍和/或中枢神经系统的神经胶质细胞(1]。虽然在成人中,神经发生是活跃在subventricular (SV)侧脑室壁区和subgranular (SG)区海马齿状回的整个生命周期,这并不足以补偿失去的细胞变性(2- - - - - -5]。更换退化细胞可以通过诱导内源性神经干细胞(nsc);然而,目前,它是远离现实由于缺乏调节的分子机制的理解在活的有机体内神经发生在成人(6,7]。除了药物活性化合物的支持性疗法检查损伤区域的进一步恶化,已经探索过细胞疗法治疗神经退行性疾病(8]。报道了首次成功的尝试使用流产胎儿大脑的细胞组织,尽管现在厌恶由于缺乏可用性和潜在的有害影响的肿瘤形成和免疫排斥反应(9,10]。

最初,胚胎干细胞(ESCs)和后诱导多能干细胞(万能)被认为是理想的来源获得neuronal-like细胞由于多能自然。在诊所ESCs的使用限制由于道德的考虑和immunorejection的风险和tumorogenesis [11- - - - - -13]。然而,iPSC-derived细胞已被用于少数临床试验;结果现在在审查(14]。规避与上述相关的担忧干细胞,间充质干细胞(msc)的潜在细胞疗法是探索由于hypoimmunogenic,免疫调节,自导,nontumorogenic和分化转移属性(8,15]。除了这些,msc还会分泌各种营养因素表明凋亡antiscarring,血管生成和有丝分裂属性(16,17]。msc可以分离不同成人组织如骨髓,脂肪组织,骨骼肌,胰腺、肾、牙髓,包皮以及围产期组织如胎盘,羊膜,沃顿商学院的果冻18,19]。沃顿商学院的jelly-derived msc (WJ-MSCs)似乎更有前途与更高的免疫调节,hypoimmunogenic,和multilineage分化潜力,由于他们的原始来源20.]。此外,由于WJ-MSCs孤立于出生后丢弃的胚胎外的组织,但并不会导致伦理问题。在过去的十年里,许多报道显示,改善神经退行性疾病的动物模型中msc移植后(21- - - - - -24]。msc移植不仅改善存活率,减少发病机理,在认知功能也有了明显的改善。整体提高接受者被认为是由于msc的旁分泌作用[25- - - - - -27]。然而,警告潜在疗法的旁分泌作用就可能不是足够逆转神经退化的晚期病人和msc形成multilineage组织的能力在活的有机体内。相关的风险的maldifferentiation msc不容忽视(28,29日]。此外,在自然免疫调节,msc移植可能抑制宿主的免疫系统(30.]。为了克服这些问题,它总是安全的区分或' msc移植治疗前向神经元血统病人患有神经退化。

来源于msc neuronal-like细胞的分化骨已经有据可查的,主要是基于单层培养的生长因子的鸡尾酒有或没有小分子(31日- - - - - -33]。使用小分子核糖核酸在分化过程中也记录在文献[34,35]。甚至具体协议建立了msc分化为多巴胺分泌和乙酰胆碱(Ach)分泌neuronal-like细胞(36,37]。很少有研究显示功能恢复的实验小鼠模型,移植MSCs-derived neuronal-like细胞进入大脑(36,38,39]。目前还不清楚是否这些neuronal-like细胞的功能集成在现有的神经网络。暂时性的各种研究表明,msc分化成神经细胞,尤其是forskolin-like小分子的存在(33,40,41]。在这个连接,稳定和生存能力的细胞功能恢复的重要参数。在目前的研究中,我们提出一个两阶段协议派生neuronal-like细胞获得ESCs的线。在第一阶段,WJ-MSCs nsc对neuroectodermal命运相似。在随后的阶段,这些neuroectodermal细胞分化成neuronal-like细胞。

2。材料和方法

2.1。沃顿商学院果冻文化派生的间充质干细胞

WJ-MSCs在完成培养MesenCult™介质(MesenCult™MSC基础培养基和MSC刺激补充)和1% antibiotic-antimycotic解决方案在缺氧条件下(5% O₂+ 5%股份有限公司₂)在聚苯乙烯,nonpyrogenic 组织培养皿。播种密度 细胞/厘米²保持50%的媒体变化对每一个交替的一天。沉淀保留沃顿jelly-derived msc的2 M / s Unistem地提供了生物科学,古尔加翁、哈里亚纳邦,印度。脐带是母亲的知情同意的基础上获得的。所有实验动物按程序批准的机构伦理委员会在全国免疫学研究所,新德里,印度。

2.2。流式细胞术分析

流式细胞仪分析细胞使胰蛋白酶化从培养皿或使用Accutase是从neurospheres分离成单个细胞。这些单个细胞后洗涤三次在PBS沾fluorochrome-conjugated主要抗体稀释30分钟在4°C 2次洗PBS紧随其后。分析了细胞流式细胞分析仪(BD流式细胞仪咏叹调三世,圣地亚哥,CA)。抗体用于流式细胞仪分析补充表所示1。

2.3。免疫细胞化学

细胞生长在poly-L-lysine涂盖玻片固定在4%多聚甲醛在室温下15分钟。Neurospheres播种在poly-L-ornithine、纤连蛋白和laminin-coated盖玻片和10%的中性缓冲福尔马林固定30分钟接着用冰冷的甲醇1 h在-20°C。WJ-MSCs SH-SY5Y(人类神经母细胞瘤细胞株)和neuronal-like细胞permeabilized使用0.5% PBS-Tween 20为胞质抗原和0.5% PBS-Triton x - 100核抗原。Neurospheres被处理permeabilized TEGG(胰蛋白酶与EDTA补充葡萄糖、谷酰胺)治疗5分钟紧随其后的是有1% tritonx - 100对1 h。阻塞的msc和SH-SY5Y细胞是使用含有5% BSA和0.1%的PBS叠氮化钠,而阻断缓冲区neurospheres PBS包含5% BSA,特里同x - 100 0.1%, 0.1%的叠氮化钠。细胞和neurospheres孵化了初级抗体在一夜之间在4°C。Postincubation各自主要抗体,细胞/ neurospheres洗了三次与含有0.5% BSA的PBS,叠氮化钠Tween-20 0.05%,和0.1%。细胞/ neurospheres各自的二次抗体孵育1小时在室温下,之后,他们又洗了三次相同的洗涤缓冲。抗体用于这项研究补充表所示2。彻底清洗后,样本与10复染色μ4 g / ml ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 5分钟然后安装长期钻石不变色,在显微镜下检查。应用细胞奥林巴斯荧光显微镜下观察(模型IX51)和图像DP70数码相机获得的(日本东京)。Z-stack neurospheres收购在蔡司的图像AxioImager Z1荧光显微镜,Axiovision释放4.8.2软件被用来捕获和处理图像。

2.4。Trilineage分化WJ-MSCs

对于成骨分化,MesenCult™中取代了MesenCult™成骨的刺激中(没有β甘油磷酸盐)和培养观察直到多层增长。细胞被诱导新鲜完整MesenCult™成骨的刺激中β甘油磷酸盐。24天的感应被媒体改变每3 50%^{理查德·道金斯}的一天。感应后,媒体被和PBS的细胞被洗。细胞被固定在10%中性缓冲福尔马林在室温下15分钟在黑暗条件下。固定细胞用Milli-Q水清洗两次。Postwashing,细胞染色茜素红S染色40分钟在黑暗条件下在室温下,之后额外的染色与Milli-Q细胞被洗四次水。奥林巴斯荧光显微镜下观察细胞(模型IX51)和图像DP70数码相机获得的(日本东京)。

脂肪形成的差异化,MesenCult™中被替换为一个完整的MesenCult™脂肪形成的分化培养基后达到90 - 100%的交汇处。24天的感应了介质改变每3 50%^{理查德·道金斯}的一天。感应后,媒体被和PBS的细胞被洗。细胞被固定在10%中性缓冲福尔马林在室温下黑暗条件下60分钟。Postfixation细胞被洗一次PBS和孵化propan-2-ol 60% 5分钟。细胞与PBS再洗一次,然后孵化与油红O工作方案(3部分油红O原液+ 2部分2型水)在室温下在黑暗条件下10分钟。染色后,细胞用自来水洗了三次。奥林巴斯荧光显微镜下观察细胞(模型IX51)和图像DP70数码相机获得的(日本东京)。

chondrogenic分化, WJ-MSCs resuspended在0.5毫升的完整MesenCult™acf chondrogenic 14毫升丙烯管分化培养基。管离心机在室温下3000 g×10分钟。管帽的保持放松,培养3天。在3^{理查德·道金斯}天,当WJ-MSCs假定球体形态、0.5毫升的完整MesenCult™acf chondrogenic分化培养基添加到最后一卷1毫升。管再次转移到孵化器。第六天开始,50%的媒介改变了每隔一天18天。生成的chondrogenic颗粒固定在10%中性缓冲福尔马林1 h,它是石蜡切片加工。固定chondrogenic球体被放置30分钟在脱水propan-2-ol分数的增加(50%,70%,90%,100%)。然后chondrogenic球体是沉浸在二甲苯和异丙醇的混合物(1:1)为30分钟接着浸泡在二甲苯3 h和变化。当时chondrogenic球体置于石蜡60°C 3 h后嵌入到石蜡在一个合适的模具,和5μ在切片机切米部分。的部分被浸泡deparaffinized幻灯片在一系列paraffinization试剂按照相反的顺序。幻灯片是二甲苯各保持5分钟,二甲苯和propan-2-ol (1: 1), 100%, 90%, 70%, 50% propan-2-ol。幻灯片终于在双重蒸馏水冲洗。双蒸馏水冲洗后,deparaffinized chondrogenic球体部分与阿尔新蓝染色剂染色45分钟在黑暗条件下室温。Poststaining,部分与PBS清洗三次。部分奥林巴斯荧光显微镜下观察(模型IX51)和图像DP70数码相机获得的(日本东京)。

2.5。免疫印迹的WJ-MSCs

WJ-MSCs孤立使用的核和胞质蛋白NE-PER核和胞质提取试剂(热科学)。细胞质和核提取物(60μ每克蛋白质)分别解决12% sds - page凝胶。解析后的蛋白质转移到硝酸纤维素。与5%脱脂奶/ PBS-T屏蔽膜后,它孵化主要抗体β连环蛋白和Lamin-A / C 1%脱脂奶/ PBS-T一夜之间在4°C。Postincubation,膜清洗三次PBS-T和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭anti-rabbit免疫球蛋白在室温下1 h。膜被暴露在一个x射线胶片的SuperSignal®西方Pico化学发光底物。

2.6。RNA隔离和cDNA准备

在300×g细胞颗粒状5分钟在4°C,上层清液被免职,颗粒在1毫升的试剂盒resuspended®试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。手工添加了二百微升氯仿和混合大力摇晃15秒。样本在室温下孵化2到3分钟,然后离心机在12000 g×15分钟在4°C。离心后,降低红phenol-chloroform阶段和间期被丢弃,和无色的上层水相保留转移到新的管;,10μ克RNase-free添加了糖原和孵化-20°C 1 h。RNA被沉淀的0.5毫升的异丙醇/毫升的试剂盒®试剂,在室温下孵化10分钟,离心机在12000 g×10分钟在4°C。上层清液被免职,RNA颗粒被洗的每毫升1毫升乙醇(75%)试剂盒®试剂,其次是混合在一个漩涡,然后在7500×g离心5分钟在4°C。RNA颗粒一度干和溶解在RNase-free TE缓冲(pH值7.0)。RNA的解决方案是用一个单位的DNase 1 x DNase缓冲区为20分钟37°C去除污染基因组DNA。提供的DNase灭活试剂DNase工具包用于灭活。最后,RNA是量化使用NanoDrop分光光度计nd - 1000(美国威明顿热科学)。RNA准备OD_260年/ OD_280年值≥1.8只考虑互补脱氧核糖核酸的合成。

互补脱氧核糖核酸合成的高容量应用生物系统公司的互补脱氧核糖核酸逆转录工具包。20μl反应混合物是由2μl 10 x RT缓冲区,2μ0.8 l 10 x RT随机引物μ25 l×核苷酸混合(100毫米),1μl (Multiscribe™逆转录酶,和RNA,剩下的体积是nuclease-free超纯蒸馏水。反应条件是25°C 10分钟,其次是37°C 120分钟,85°C 5分钟灭活酶。

2.7。通过rt - pcr基因表达分析

总RNA的互补脱氧核糖核酸合成受到PCR扩增使用内Taq2x主结构,针对不同目标基因引物选择性。引物列表中提供了补充表3。rt - pcr的产品运行在2%琼脂糖凝胶(TAE)和可视化使用Syngene ChemiGenius²bioimaging系统。

2.8。神经元的分化WJ-MSCs

分化是在两个阶段(补充图进行的2)。在第一阶段,msc通道6被诱导到neuroectodermal沿袭使用Neurobasal媒介与1 x n补充补充,1 x B-27补充,和1 x GlutaMAX™, 200μ抗坏血酸和20 ng / ml antibiotic-antimycotic FGF2 EGF和1%的解决方案。感应也进行了补充完整的媒介与10 ng / ml神经生长因子或5 ng / ml PDGF-BB。感应是持续了10天的超低附着菜肴在缺氧条件下媒体对每天交替变化的50%。

Neurospheres形成在第一阶段被用于第二阶段分化成成熟的神经元。Neurospheres被分离成单个细胞使用StemPro™Accutase™和镀poly-L-ornithine,纤连蛋白,laminin-coated盖玻片的感应介质。第二阶段的感应在Neurobasal介质进行补充1 x n补充,1 x GlutaMAX™, 200μ50 M抗坏血酸,1毫米dbcAMP, ng / ml神经生长因子,和20 ng / ml BDNF antibiotic-antimycotic 1%。细胞在缺氧条件下诱导了28天以50%的媒体变化对每一个第三天。

2.9。细胞生存能力分析

凋亡细胞的检测使用PE-Annexin V凋亡工具包(BD Pharmigen™)。细胞颗粒在绑定resuspended缓冲区,5μl膜联蛋白V和7-AAD补充道。混合物是孵化20分钟在室温下在黑暗中。Post-incubation 400μl(绑定缓冲被添加到每个管和分析BD-FACS咏叹调III。

2.10。通过透射电镜超微结构分析

WJ-MSCs neurospheres来自这个细胞被固定在Karnovsky固定剂的缓冲(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.2)一夜之间在4°C。随后,WJ-MSCs和WJ-MSCs影射neurospheres洗在0.1磷酸盐缓冲剂和固定在1% OsO4 1 h在4°C紧随其后的是一个提升等级的丙酮脱水。脱水后,细胞渗透和嵌入在环氧树脂CY 212(英国TAAB)。厚的部分(1μ米)被削减超微切片机,安装在玻璃幻灯片,并与水甲苯胺蓝染色。光学显微镜下观察的部分总观察的面积和组织固定的质量。电子显微镜检查,薄片grey-silver颜色干扰(70 - 80 nm)被切割和安装到300目铜网格。他们染色使用酒精醋酸双氧铀和碱性柠檬酸铅。温柔的洗后蒸馏水,Morgagni 268 d透射电子显微镜下观察(范公司,荷兰)。图像数字化获得工作电压80 kV通过使用CCD相机(Megaview三世,范公司)连接到显微镜在精密的分析仪器设备,全印度新德里。

2.11。通过流式细胞仪分析细胞周期

一百万WJ-MSCs和单个细胞分离后得到neurospheres分别固定在2毫升的冰冷的70%乙醇在4°C为24小时。Postfixation,乙醇被离心法去除细胞在1200 rpm 5分钟。五百微升FxCycleπ/核糖核酸酶的解决方案是添加到细胞颗粒轻轻和混合。在室温下孵化是在黑暗中进行了30分钟。细胞对BD流式细胞仪分析咏叹调三世使用波长488纳米的激光和585/42的带通滤波器。

2.12。通过RT-qPCR基因表达分析

RT-qPCR是由SYBR绿色技术(Takyon低火箭SYBR混合,Eurogentec)和Stratagene MxPro 3000仪器(美国安捷伦科技)。PCR反应进行了控制看家基因(香港)为每个模板。PCR反应参数如下:(1)反应mix-cDNA获得125 ng的总RNA和5μl 2×SYBR大师混合和100海里的每个引物在最后一卷10μl和(2)PCR周期:10分钟在95°C, 40放大周期(95°C,持续30秒,60°C,持续20秒,和68°C 45秒),后跟一个分裂周期获得熔化曲线。相对褶皱感兴趣的基因的表达变化(GOI)样本的校准器计算如下:

所有反应进行了一式三份,这些反应与Ct值的标准偏差超过0.5不考虑。

2.13。神经突的长度分析

神经突的长度决定使用图像J软件(NIH,贝塞斯达)不重叠的图像。为此,规模是通过跟踪整个神经突的长度。总共有40个不同的细胞在每组实验中被用于计算长度。

2.14。统计分析

多种实验结果/报告样本 。学生的 - - - - - -测试进行了计算的两组之间的意义,和 被认为是重要的。使用Graph-Pad棱镜进行了分析软件(版本6.01)。

3所示。结果

3.1。WJ-MSCs表达多能干细胞标记

除了各种集群分化的分析(CD)标记为国际社会制定的细胞治疗(ISCT) 2006年(补充数据1和1 b)[42),WJ-derived msc还分析多能CD标记的表达。可以设想分化的倾向WJ-MSCs到其他细菌层由于多能标记物的表达。CD146 /黑素瘤细胞粘附分子(MCAM),充当层粘连蛋白受体的表达中被发现 WJ-MSCs的,而不像BM-MSCs, WJ-MSCs没有显示CD271的表达(图1(一))。进一步分析,显示 WJ-MSCs表示SSEA-4多能性的标记(图1(一))。CD49f通常被称为整合素α6,其表达受直接绑定OCT4和SOX2启动子,这是众所周知的,调节msc的增殖和分化潜能(43]。分析时, 的WJ-MSCs CD49f的表达(图1(一))。正如所料,发现细胞表达Oct4和Sox2蛋白质(图1 (b))。核易位Oct4 Sox2被发现 和 的细胞,分别对传授多能性(图至关重要1 (b))。CD146的表达、CD49f SSEA-4、Oct4、和Sox2 CD44, CD73, CD90、CD105, HLA-I表示原始和多能细胞的性质。

要理解WJ-MSCs的分化潜能,他们诱导分化成成骨,脂肪形成的,chondrogenic血统。分化的程度进行了分析通过与茜素红S染色,油红O,分别和阿尔新蓝8 gx污点(补充图1 c)。结果证实WJ-MSCs分化到各自的血统。

3.2。在WJ-MSCs规范Wnt信号持续活跃

由于神经发生是策划的一个很好的平衡支持的规范Wnt和FGF信号之间的生存信号EGF (44,45),我们检查了几个相关信号组件的存在的细胞。规范Wnt信号易位后执行β连环蛋白在细胞核,连同TCF / LEF协调各种基因的转录。核和胞质蛋白提取的msc与抗体分别探测β连环蛋白,而核纤层蛋白A / C被用作核控制。结果表明一个重要的积累β连环蛋白在核提取物、指示规范Wnt信号在这些细胞的活动状态(图2(一个))。此外,基因的表达FGFR1和表皮生长因子受体分别和bFGF和表皮生长因子受体,通过rt - pcr分析。结果表明,这些受体的基因高表达的细胞(图2 (b))。

3.3。启动的WJ-MSCs Neuroectodermal血统

线索的在活的有机体内神经发生适应' WJ-MSCs进neuroectodermal命运。在胚胎发育过程中,神经发生是由规范之间的微调Wnt策划bFGF和表皮生长因子信号。先前的实验表明,规范化Wnt通路持续活跃同时FGFR1和EGFR受体的表达。因此,在细胞命运改变计划,我们准备WJ-MSCs中层血统的neuroectodermal命运通过激活bFGF和表皮生长因子信号通路使用鸡尾酒bFGF和EGF的体内。在2天的治疗,细长的msc开始形成自由浮动球体的大小从100年到600年μ米,其中大部分超过400的规模μm(图2 (c))。球体的大小没有增加超越文化的第五天。在不同的实验中,两个条件之后,神经生长因子或PDGF-BB包括连同bFGF + EGF鸡尾酒(补充图2)。神经生长因子和PDGF-BB被包含在协议由于其参与神经发生(46,47]。无显著差异的大小和数量的球体的一代在上面的三个观察培养条件(数据没有显示)。

的氧气供应更大领域的核心将是有限的,有可能是核心内的细胞暴露于低氧压力,最终死亡。确定可行的细胞比例在这些领域中,他们使用Accutase仔细分离成单个细胞,这是与膜联蛋白V和7-AAD co-staining紧随其后。膜联蛋白V结合早期凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸。而7-AAD, DNA结合染料认识到坏死细胞。从流式细胞仪结果明显, 细胞球体仍然可行的缺席,在为期10天的文化标记 在preapoptotic阶段和 细胞凋亡的阶段(图2 (d))。随着极端缺氧条件的核心领域,Accutase不容忽视的危害对细胞凋亡的细胞为其贡献。

3.4。细胞WJ-MSCs致敏Neuroectodermal细胞的变化

命运的变化,如果有的话,在WJ-MSCs影射neuroectodermal细胞在超微结构水平通过透射电子显微镜分析。虽然比较,msc被发现有著名的常染色质核溶酶体降解的痕迹。早期的存在在这些细胞吞噬身体意味着细胞压力(补充数据3和3 b)。另一方面,球被发现是一个紧凑的结构由许多单个细胞(补充图的聚类3 c)。Intraspheral细胞出现与细长突出的原子核(补充图3 c)和扩张的粗面内质网(补充图3 d),建议增加领域内的代谢活动。细胞外基质在球体的存在表明,他们不仅仅是集群的细胞,但更有可能的形式组织(补充图3 e)。常染色质细胞核,细胞外基质的分泌以及线粒体的存在一个活跃的状态见显微照片(补充图3 f)表明intraspheral细胞的新陈代谢活动状态。

了解细胞和分子的变化WJ-MSCs影射neuroectodermal细胞,我们分析了盘CD的标记的表达msc (CD73, CD90、CD105)。这些CD标记的表达式检查通过流式细胞仪在移动领域使用Accutase成单个细胞。CD73和CD105的表达显著降低 和 来 和 ,分别为(补充数据4和4 b)。没有减少CD90表达式中观察到这些细胞(补充数据4和4 b)。CD73和CD105表达的衰落表明msc的基本性质的损失的细胞球。启动细胞稳定表达CD90可能归因于这样一个事实,它也表达了neuroectodermal细胞(48]。

细胞周期分析以确定其增殖状态。DNA内容分析的结果表明,有一个S, G细胞的显著减少₂有丝分裂期( , 与 , ,分别 )在WJ-MSCs影射neuroectodermal细胞WJ-MSCs相比(图3(一个))。这表明,细胞的启动导致细胞增殖减少。此外,细胞类型都沾染了ki - 67抗体。结果显示ki - 67表达的完全没有WJ-MSCs neuroectodermal细胞(图3 (b))。有可能是这些细胞停止表达ki - 67表达蛋白质或低于检测水平。在一起,这些观察结论支持细胞的变化WJ-MSCs neuroectodermal细胞相比,msc。

3.5。WJ-MSCs致敏Neuroectodermal细胞的分子分析

如上所示,msc的启动向neuroectodermal命运不仅改变了表型,也抑制了扩散CD73的衰落和CD105的表达。因此,我们研究的后果mesenchymal-specific基因的表达和神经元基因的起义,如果任何。的表达αSMA和纤连蛋白是相当拒绝WJ-MSCs相比大约10倍(图4(一))。波形蛋白的表达,另一个重要的间充质细胞的标志,也减少了启动细胞,尽管在一个较低的程度。这可能是因为波形蛋白表达的也是神经祖细胞(49]。有趣的是,nucleostemin具备干细胞的标志msc、在细胞周期进程中扮演着重要角色,被发现表达下调(图10倍的程度4(一))。

SOX1关键neuroectodermal特定转录因子,不仅起着至关重要的作用在神经发生通过激活β连环蛋白介导下游基因neurogenin 1的同时抑制anti-neurogenic基因HES1但还能抑制细胞增殖,瞄准CyclinD1 (50]。当检查时,没有在WJ-MSCs观察Ct值,而一个相当高级的表达SOX1基因在细胞(图4 (b))。虽然SOX1表达式被认为在所有三个诱导条件下,最高表达是细胞诱导时bFGF和EGF。因为没有Ct值观察msc、结果是三角洲的形式Ct所示。除了SOX1,的表达SOX2和PAX6也进行了分析。而SOX2显示出下降的趋势(神经生长因子补充文化除外),后者的表达增加了两个折叠(图4 (c))。

有趣的是,upregulation巢蛋白和Musashi-1两个神经干细胞标记,也看到在neuroectodermal细胞(图4 (d))。除了上述基因,其他神经元受体基因,NTRK1和NTRK3和特异性神经元转录因子NEUROD1,NEUROD2,NEUROG2也高表达(数据吗4 (e)和4 (f))。略微减少的表达NEUROD1被当神经生长因子或PDGF-BB添加FGF2和EGF诱导媒体。总的来说,这些结果强烈表明,启动msc的msc导致基因改变,从而导致增加neuroectodermal的命运。bFGF和EGF补充介质足够等诱导msc的变化,随后的实验只使用这两个因素。

除了基因表达,一些特定的neuroectodermal蛋白质标记也分析了免疫染色。msc没有表达Sox1蛋白质而neurospheres突出表达了相同的(图5(a))。Sox2被发现在msc和neurospheres(图表示5(b))。虽然PAX6转录是msc(图中观察到4 (c)),其蛋白表达缺失。感应,在neurospheres Pax6的表达明显(图5(c))。此外,我们证实,巢蛋白和Musashi1蛋白质表达neuroectodermal血统非常高而msc(数据5(d)和5(e))。总的来说,基因和蛋白质表达的结果证实,启动msc bFGF和EGF导致命运的改变对neuroectodermal血统。

3.6。WJ-MSCs影射Neuronal-Like细胞的形态学分析

后取出这些neuroectodermal致敏细胞成单个细胞,他们培养了25天的抗坏血酸,dbcAMP,脑源性神经营养因子、神经生长因子(补充图2)。WJ-MSCs派生neuronal-like细胞,所以形成了多极化。形态,细胞假定neuronal-like结构与一个典型的胞体伸出的轴突(图6(一))。轴突hillock-like结构也被观察到。比较神经突的长度,视黄段SH-SY5Y细胞是人类起源与选择,因为它含有儿茶酚胺的性质有可能生成胆碱能、肾上腺素、多巴胺神经元(51,52]。当使用ImageJ软件分析神经突的长度,平均长度被发现 ,而同样在RA-induced SH-SY5Y (图6 (b))。

3.7。WJ-MSCs影射Neuronal-Like细胞的分子分析

我们还进行了基因表达分析后的第二阶段分化。以确保这些细胞完全失去了表达间充质签名,基因的表达αSMA,波形蛋白、纤连蛋白和nucleostemin进行了分析。有趣的是,这些基因广泛表达下调之外的初始阶段neuroectodermal血统(数字4(一)和7(一))。分析证实,间充质属性的改变并不是暂时的。令我们吃惊的是,有一个强大的巢蛋白的表达增加这些细胞,即使Musashi1基因表达下降(图7 (b))。巢蛋白神经干细胞标记,这种增强表明具备干细胞的细胞并没有丢失。虽然巢蛋白表达是维护细胞的表达就会完全消失SOX2基因(图7 (c))。保留神经针对受体基因的表达NTRK1和NTRK3与成熟神经元标记物的表达MAP2神经丝,TUJ1证实这些细胞的神经元命运(数字7 (d)和7 (e))。作为不增殖分化神经元,我们检查增殖细胞核抗原的基因表达(PCNA在这些细胞)。结果进一步证实,细胞的增殖潜力非常减少(图7 (f))。

这些neuronal-like细胞组织化学染色进行确认不仅基因,成熟的神经元标记在这些细胞也表达蛋白。发现大部分的细胞表达Map2, Tuj1,神经丝(图8)。这些标记物的表达建立了神经细胞的命运。

4所示。讨论

退化的神经元是几个神经障碍的主要原因53]。由于缺乏有效的治疗神经退行性疾病,症状缓解和/或延迟疾病的进展仍然选择使用药物治疗。当前药物无法抵消变性处于高级阶段的发展。此外,正如有一个固有的局限性神经发生在成年人的大脑,许多团体都参与探索细胞疗法在基础以及在转化研究。在这项研究中,我们解释一个高尚的骨髓间充质neuronal-like WJ-derived细胞的分化策略并行的ESCs之后。

大部分的报告神经元分化是基于来自骨髓msc。在这项研究中,我们使用WJ-derived msc,不仅由于其简单的隔离程序的原因与之相关,但也因为他们的原始本性。有趣的是,这些细胞不表达CD271,低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)高度表达的msc来源于组织如骨髓,脂肪组织,和真皮54- - - - - -56]。缺乏CD271 WJ-MSCs是符合早期报告中表达,这表明WJ-MSCs有别于那些隔绝BM或脂肪组织57]。它已经表明,WJ-MSCs显示的ESCs的几个特性,干细胞标记物的表达和潜在的广泛的中胚层血统以外的分化。

规范Wnt信号被发现生存不可或缺的神经祖细胞和分化成神经元在成人齿状回58]。规范Wnt信号是在WJ-MSCs持续活跃,这是无效的为神经元分化诱导相同的体内。在这项研究中,我们采用3 d neurosphere文化导致神经祖细胞(npc)被认为是更具有代表性的空间生物中的细胞外环境。信息交互在细胞外基质的存在更紧密地模仿体内条件(59]。NeuroD1是一个颈板基本helix-loop-helix (bHLH)重要转录因子在中枢神经系统的发展以及在成年神经发生(60,61年]。转录激活NeuroD1取决于正则Wnt信号激活在成年小鼠海马nsc Wnt3a配体。在这项研究中,增加NeuroD1基因表达只在FGF2 + EGF的存在表明,其他两个组合的培养基是可有可无的。

我们选择SOX1,SOX2,PAX6、巢蛋白和Musashi1进一步分化细胞的特点。SOX1在神经细胞中扮演着关键角色命运的决心;过度的SOX1在神经细胞株激活颈板的Neurogenin 1基因的表达,促进退出细胞周期和神经元分化50]。在另一项研究中,SOX1据报道,调节大脑皮层神经祖细胞在小鼠的数量62年]。PAX6是一个关键的转录因子表达在人类胎儿的早期神经外胚层细胞和神经祖细胞分化从人类的ESCs [63年]。在鼠标的ESCs,SOX1提高neuroectodermal承诺,而PAX6参与的发展neuroectodermal神经元(64年]。其他神经元标记,如SOX2、巢蛋白和Musashi1,广泛表达于npc在老鼠和npc来源于人类的发展则(65年]。有趣的是,我们的研究结果显示出强大的基因和蛋白质表达的主要,已被视为人大标记。这表明neurosphere聚合来自WJ-MSCs neurospheres一样获得多能干细胞。

此外,细胞neurospheres描绘的大幅减少CD73和CD105表达几乎没有CD90的表达状态的变化。CD73的衰落和CD105表达与波形蛋白缺失的情况下,αSMA,neuroectodermal细胞纤连蛋白基因也许表明间充质表型的损失。的分子变化WJ-MSCs派生neuroectodermal细胞超微结构的分析支持。的基础上突出的核的形成,线粒体嵴的形态学特征,和粗面内质网,一个可以想象的活跃的代谢状态intraspheral细胞。此外,相邻细胞之间的细胞外基质的存在范围内解释了信息交互的可能性。

在随后的成熟成neuronal-like细胞,在第二阶段的分化,neuroectodermal细胞获得明显的形态特征:细胞的细胞核转向边缘,并且每个neuronal-like细胞具有细胞的身体和多发性神经炎。独特的和长轴突也发现从轴丘,类似发现在典型的神经元。成熟过程中neuritogenesis axonogenesis,涉及多个细胞骨架蛋白,包括中间丝状神经丝、微管β微管蛋白和肌动蛋白丝。有趣的是,在neuronal-like细胞,我们观察到强大的神经丝的表达,Map2,Tuj1基因和蛋白质。除了细胞骨架蛋白,标记神经元受体的表达NTRK1和NTRK3表明,分化的细胞达到neuronal-like属性。

总而言之,WJ-MSCs多能干细胞标记和展示形式neurospheres文化。三个media-combination测试,只有FGF2和EGF组合产生更好的从WJ-MSCs neuroectodermal细胞基因的表达和蛋白质的特定于npc。第二阶段的区别后,neuronal-like细胞成为接近主要神经元;然而,进一步描述的稳定性和膜电位是必要的。这些neuronal-like细胞移植可能是一个候选人在再生医学和神经发生的研究由于其简单的可用性。有必要提到移植WJ-MSCs和neuronal-like细胞比前者将涉及免疫调制和后者将取代退化细胞。此外,这项研究在临床前需要验证移植模型的安全性和有效性检查细胞。

5。结论

我们的研究结果表明,WJ持有承诺的间充质干细胞生成neuronal-like细胞来源。这些WJ-MSCs预计将免费从道德和法律问题的隔离包括非侵入性程序丢弃的脐带。该细胞类型预计将有额外的好处据报道,随着细胞分泌营养因素,尽管它还没有覆盖在这个研究。这些分泌物可能进一步提高神经发生和维持免疫调制。有可能的组合使用与WJ-MSCs neuronal-like细胞,细胞疗法后会分泌神经发生和免疫调制的营养因素。然而,它需要验证这些neuronal-like细胞移植在临床前神经退化模型的逆转疾病的发病机理。

数据可用性

所有生成的数据在这个调查中包括的主要和补充文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Vikash Kumar博士提供技术援助流cytometry-based研究和博士Surbhi贾斯瓦尔帮助在蔡司AxioImager Z1荧光显微镜在获取图像。最后作者感谢导演,免疫学研究所提供金融支持工作。免疫学研究所的主任,印度,支持本研究。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

补充材料

表S1:抗体流式细胞术,列表目录号码和来源。表S2:抗体免疫细胞化学,列表目录号码和来源。表S3:引物,序列,扩增子大小。(补充材料)

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