结合使用壳聚糖和嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞促进周围神经再生在活的有机体内

文摘

周围神经损伤临床挑战仍然是一个有严重生理和功能的后果。尽管多个可能的治疗方法的存在,直到现在,没有共识关于每个选项的优点或最好的方法在促进神经再生。再生医学是一个承诺,克服这种医学的局限性,在这个工作,壳聚糖神经指导管道和嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞应用于不同的治疗组合neurotmesis损伤后促进坐骨神经的再生。在20周,干预动物受到常规功能评估(电动机性能测定、痛觉过敏和坐骨索引),在这段时间之后,他们评估动和坐骨神经和颅胫骨肌肉进行评估stereologically histomorphometrically,分别。获得的结果允许使用这些治疗方法确认的有利影响。使用壳聚糖ngc和细胞导致更好的机动性能,更好的坐骨索引,和更低的步态障碍后20周。使用只有NGGs展示更好的疼痛的复苏。坐骨神经的stereological评价显示相同的所有治疗组在不同的参数值。肌肉histomorphometric评估,治疗组ngc和细胞显示结果接近的组接受传统的缝合,有最好的最终值。治疗组合研究显示有前途的结果,应该是新的未来的目标努力克服一些违规行为中发现结果和建立的结合神经指导管道和嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞作为可行的选项后治疗周围神经损伤。

1。介绍

周围神经纤维结构极其脆弱,敏感,容易被压碎,容易损坏的压缩,或横断创伤1]。由于其高患病率,周围神经损伤(句)是最重要的一个创伤住院病人医疗问题。周围神经损伤的本质上影响电动机和感官活动,中断之间的连接中枢神经系统和各自的靶器官和肌肉的身体区域。从长远来看,这些伤害导致行为变化,流动困难,失去意识的变化和空间知觉,皮肤和关节敏感性和高潮在终身残疾2,3]。这些伤害是很难标准化和治疗本质上由于可能发生的巨大差异,关于类型、位置、严重性、复杂性。多年来,开发了不同的医疗和手术方法治疗句,但尽管如此,它可能尚未建立理想和横向治疗所有类型的伤害(4]。众所周知,句治疗的未来将涉及使用多因子的治疗促进感觉和运动恢复,神经肌肉和维护目标肌肉和器官的刺激神经移植后的时期去神经是主要的目标。

标准化句,神经损伤各级分类根据其严重性,功能的后果,和预后。这不仅分类方案促进的决心与损伤相关的病理生理现象,还建立理想的治疗。一般应用句分类是基于建立Seddon和桑德兰的共同努力下5,6]。Seddon建立3句基于水平程度的髓鞘脱失,轴突损伤的类型和程度的改变神经的结缔组织(神经内膜,神经束膜,神经外膜):neuropraxia、axonotmesis neurotmesis [5]。后,桑德兰扩展句严重程度度5,与第一学位相应neuropraxia,第五neurotmesis对应,和三个中间体源于axonotmesis,基于不同的参与结缔组织包(6]。尽管这种分类的创建方法,很难拟合所有类型的伤害到这些类别后导致麦金农引入额外的损伤程度,基本上一个混合受伤,可能最常见的临床情况(7,8]。

事件发生后句,连续两个神经变性和再生的发生(4,9],这个复杂的过程包括删除的炎症过程,生产和释放神经营养因子,刺激轴突再生,神经元的生存。雪旺细胞也扮演一个重要角色在沃勒变性的再生阶段,分裂和增殖形成Bungner乐队不仅产生神经营养和组织粘附因子也引导轴突再生,促进髓鞘再生(10]。然而,所有这些再生现象减缓由于其复杂性,导致过多长时间去神经会在靶器官和肌肉,这经常在功能损失和不可逆的神经源性高潮肌肉炎症和萎缩(11]。因此,如不及时干预和有效的外科治疗方法,句仍然是一个复杂的临床挑战。

neurotmesis伤害,最严重的,只要一个好的血管床是观察和一个近似的神经末梢不张力是可行的,应用程序的端到端(高频)缝合线仍然是最好的选择12]。当这种技术不能应用,自体神经移植,以避免拒绝收件人是黄金标准技术,虽然也与几个缺点:施主能级发病率和额外的损失函数,困难在寻找神经来源匹配的规模和特点,和性能的额外切口(13]。使用神经指导管道(ngc)已经开始探索作为一种引导轴突向远端神经再生,避免常见的发生在误导现象,严重的炎症反应和纤维化。不同类型的材料已经检测生产ngc,缝合时从可生物降解的材料。目前同意这些材料应该构成一个完全降解矩阵,再生现象的积极影响其生物降解过程无需负局部或全身性的影响(14]。尽管如此,材料尚未建立,所有的可取的特点和无疑有效促进神经再生。

壳聚糖是一种材料,研究和特别有利,因为它自然起源(甲壳素壳的节肢动物和真菌的细胞膜,酵母,和其他微生物)(15),完全bioabsorbed而不产生有毒的代谢产物,影响再生过程。此外,壳聚糖促进细胞粘附和维护细胞和组织的生存能力,有抗菌特点,并且可以很容易地修改化学和酶释放细胞因子,抗生素,和细胞外基质(ECM)成分控制的方式(4]。临床使用这种材料的研究表明壳聚糖促进轴突再生,提高功能恢复,防止广泛瘢痕的发生和发展神经瘤(16]。使用的许多研究chitosan-based ngc很小,并且没有与他们的应用程序相关联的功能结果数据。一些研究使用chitosan-polyglycolic酸结合了良好的运动和感觉复苏ngc用于桥长途时缺陷的正中神经17,18]。在2014年,一个商业NGC推出市场,纯粹由壳聚糖组成,称为Reaxon®神经指南(Medovent GmbH(美因茨,德国))。开发符合国际标准DIN EN ISO 13485 (19],Reaxon®最初推出30毫米长ngc 5内直径选项,以适应不同的治疗需求。这些ngc的最重要的特征之一,其高灵活性和抗崩溃,不依从表面上看,延展性和透明度,促进神经的插入顶部和缝线突出的应用。此外,Reaxon®表面带正电的内部,可以与带负电荷的细胞和分子,让他们共同作用促进神经再生。这样,Reaxon®可以应用在tubulization技术neurotmesis病变后,桥接长之间的差距通过直接缝合神经上衣和生物材料,但也保护神经顶部连接部位的疾病通过张力缝合(20.,21]。

嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞(OM-MSCs)间充质干细胞(msc)的利基固有层的嗅觉粘膜。外胚层的起源,这些细胞表达神经闲暇的基因(22,23),充分识别和隔离在不同物种(22- - - - - -28]。研究关注OM-MSCs仍很少有但是已经表明,这些细胞所需的最小特征描述的msc (29日]:塑料坚持文化与fibroblastic-like殖民地的形成,tridifferentiation能力,表达特定的表面标记没有表达造血标记(22,23]。此外,这些细胞也能后肌原性的(30.和神经源性分化23,30.),他们的条件培养基可以促进髓鞘形成的胶质细胞的增殖和激活在体外(31日]。OM-MSCs最重要的特征是他们分布在多个领域的鼻腔促进收集在大型和小型动物模型,通过临死前的和后期协议,起源于神经嵴,通用性高,染色体稳定,能够长期维持自我更新能力的文化没有与供体的年龄相关的变化(23,32- - - - - -34]。在在活的有机体内研究,OM-MSCs大多应用于工作与脊髓损伤(35- - - - - -37),中枢神经系统的退化性疾病(38,39),蜗神经的病变(40- - - - - -42),和海马体的病变43,44]。这些细胞的研究应用于促进周围神经再生后句更加稀缺,但OM-MSCs结合的应用两相的层粘连蛋白和collagen-functionalized透明质酸NGC显示更好的结果比单独使用生物材料(45]。

ECM是细胞外的网络组件的功能是提供生化和结构支持细胞,主要是由酶等大分子糖蛋白,胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白(46]。ECM是一个基本组件的功能行为msc、在活的有机体内这些都包含在一个三维的微环境与邻近组织和对不同类型的信号,调节细胞吸附和迁移(47,48]。水凝胶可用于模仿ECM为了方便的函数在三维结构的形成和成熟组织,两者兼而有之在体外和在活的有机体内(49]。基底膜基质®是一种凝胶状的蛋白质的混合物,从基底膜蛋白提取的可溶性和无菌,源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤,可以用作msc(基底膜基质50]。它的主要组件是层粘连蛋白,也有胶原IV,蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素,entactin / nidogen宪法。此外,它还富含多种生长和proregenerative因素如表皮生长因子、胰岛素样生长因子、纤维母细胞生长因子、转化生长因子-β、组织纤溶酶原激活物(51,52]。在体温37°C,基底膜基质®三维ECM凝胶和形式结构相同,支持细胞粘附和分化和促进提供了理想的环境在活的有机体内不同组织的再生。有效地使用人工基底膜®促进依恋和分化的神经元53,54)和支持在活的有机体内周围神经再生(55- - - - - -58]。

结合使用msc与ngc [59)和msc与基底膜基质的结合®(57)是两种可能的方法来改变范式与句后刺激周围神经再生。在这项工作中,我们测试了假设的结合使用Reaxon®ngc和OM-MSCs悬浮在基底膜基质®可能提高histomorphometric和功能性neurotmesis后大鼠的坐骨神经的再生。

2。材料和方法

2.1。OM-MSCs的制备和表征

2.1.1。收获和细胞培养

OM-MSCs收获来自老鼠的嗅觉粘膜和维护在文化如前所述23,60]。简而言之,OM-MSCs收集从老鼠的嗅觉粘膜,鼻中隔,ethmoturbinates [60),通过混合酶消化法分离和外植体,扩大,在文化和维护标准条件(37°C, 5%有限公司₂使用基本培养基和湿润大气)组成的基础培养基(DMEM / F12 + GlutaMAX™补充,Gibco®)认证补充10%胎牛血清(一胎牛血清,Gibco®), 1.5% penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich®),和1.5%的两性霉素B (Sigma-Aldrich®)。细胞冻存使用基本培养基和10%二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich®)至少在cryovials 细胞。之前被用于不同的化验,细胞在水浴解冻(37°C),收集,离心机,resuspended在基本培养基,统计,在标准条件下培养,和维护。对于每个试验,培养基是消除,文化是用PBS和细胞分离使用0.25% Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich®)(3 - 5分钟在标准条件下孵化)。离心后(1600 rpm, 10分钟)和消除的上层清液,细胞的数量和他们的生存能力是由锥虫蓝(英杰公司™)排除细胞分析使用一个自动计数器(女伯爵二世FL自动细胞计数,热费希尔科学®)(23]。

2.1.2。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)

识别特定基因的表达,OM-MSCs未分化神经源性分化之后,rt - pcr。

(1)RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成。RNA进行隔离OM-MSCs诱导后的未分化状态和神经源性分化。神经源性分化实现如前所述[23]。总RNA RNA隔离,兰姆™迷你包(Bio-Rad实验室®),遵循制造商的指示。简单地说,一个 细胞颗粒的P6分化(72 h(分化)和未分化OM-MSCs细胞溶解,溶解的解决方案,其次是DNA切除DNAase我酶和洗脱80μl洗脱的解决方案。RNA是维持在-80°C。

互补脱氧核糖核酸合成之前,孤立的核糖核酸的纯度和数量使用紫外分光光度法测定技术和测量_260年/一个_280年(识别蛋白质污染)和一个_260年/一个_230年(确定酚、多糖和/或离液序列高的盐污染)吸光度在NanoDrop™一Microvolume紫外可见分光光度计(热科学™)。纯度值被认为是足够的包括间隔2 - 2.2_260年/一个_280年-2.2和1.8_260年/一个_230年(61年]。

第一个互补脱氧核糖核酸链合成了4μ20 l的总RNAμl最后体积,制造商的指令后iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad实验室®)。完整的热循环仪反应混合然后孵化(T100™热周期计,Bio-Rad实验室®)使用时间和温度的指导方针表明制造商的指示。

(2)定量rt - pcr检测。rt - PCR试验进行了使用CFX96触摸™实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室®)标准PCR条件和使用iTaq™普遍SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室®)根据制造商的指示。22神经胶质的表达的基因与标记相关的搜索,包括特定标记的不成熟和成熟的神经元和神经胶质细胞的标记不同的成熟阶段。标记与胶质细胞包括Aldh1l1、CD40 Cdh2, Cspg4, GAP43, GFAP、合成,NCAM, Nes, Ocln, Olig3, Sox10, Sox2;neuron-associated标记包括Ascl1、克莱斯勒、MAP2 NueroD1, Rbfox3, Syn, Cdk5r1,图书馆,Tubb3,再次GAP43。β肌动蛋白是用作看家基因。96孔板(PrimePCR定制板96,Bio-Rad实验室®)准备22预先设计的引物基因的识别,以允许他们的基因表达(表的识别S1显示了与各自的扩增子上下文列表下的基因研究序列,合奏基因ID和PCR产品长度)。盘子被读入一个实时PCR检测系统。两对引物针对基因用于分析他们在未分化和分化OM-MSCs表达式。板包含混合针对22基因暴露在温度循环由制造商表示。rt - pcr竣工后,基因表达进行了分析和解释。确认产品的特异性,融化曲线进行了分析。

阈值的周期(Ct)是解释如下: 显示强阳性反应,丰富目标核酸样本, 表明目标核酸的积极反应和适量,和 出现在弱反应与最低目标核酸值或环境污染。

两组细胞的值的计算公式 。折叠两组间的差异都使用标准的计算通过这个公式 。②相对量化是由公式 。基因与 被认为是表达下调,那些 被认为是调节。

2.1.3。免疫组织化学分析

早期的通道(P6) OM-MSCs提交免疫组织化学分析检测特定抗原与神经源性分化有关。在一个盘子,OM-MSCs保持未分化状态,在另一个;在相同的通道,受到神经源性分化的细胞如前所述[23]。在未分化的细胞中,文化是保持,直到70 - 80%的融合;提交给分化细胞在神经源性分化维持72小时的媒介。对于这两种情况下,细胞分离使用0.25% Trypsin-EDTA解决方案和保存在一个石蜡cytoblock (Surein®®保护电池解决方案,Cytoglobe GmbH®)。随后,部分被削减时2μm,受到deparaffinization,脱水,紧随其后的是免疫组织化学分析用Novolink™聚合物检测系统(徕卡生物系统®)装备,根据制造商的指示。初级抗体和抗原的信息检索方法中描述表1。抗体的选择识别标记的存在神经元(NeuN和GAP43)和胶质(GFAP)起源、rt - pcr技术获得的结果的补充。

细胞immunoexpression评估使用Eclipse E600显微镜(尼康®)和软件成像软件NIS-Elements F Ver4.30.01(实验室成像®),与各自的解释和照相记录。为不同的标记,immunoexpression标记强度得分(0,-;+,弱;+ +,温和;和+ + +,强)。当不同的细胞质和核染色是在至少5%的总细胞群,免疫反应性被认为是积极的。

2.2。在体外Cytocompatibility评估

确定OM-MSCs之间的兼容性和Reaxon®ngc和基底膜基质®中使用在活的有机体内化验,PrestoBlue™可行性进行了分析。建立了四组:(1)OM-MSCs播种接触Reaxon®管基础培养基,(2)OM-MSCs播种在基底膜基质®(康宁®)和基础培养基,(3)OM-MSCs播种与基础培养基(积极的控制),和(4)OM-MSCs播种基础培养基补充10% DMSO(负控制)而不是10%的边后卫。在第一组,Reaxon®ngc被横着一个合适的长度,然后放在一排水井24-well板。在第二组,基底膜基质®稀释在DMEM / F12(1: 1)应用于一排水井24-well板覆盖它的底部,在制造商的指示。在所有组的井,OM-MSCs被播种密度的6000细胞/厘米²,除了中考虑。细胞代谢活动评估在24小时,72小时,120小时,168 h和216 h,总是在每个时间点为每个组一式四份。在每个时间点,文化媒体取代新鲜的完全培养基,添加10% (/)的10倍PrestoBlue™细胞生存能力试剂(表达载体,A13262)。不结果实的控制井作为空白组。然后,板块在标准条件下孵化了1小时。这一时期后,确定浮在表面的颜色反映细胞生存能力差异,每个好收集的上清液转移到96孔板,其次是吸光度读数为570 nm(激发波长)和595 nm(发射波长)分光光度法使用微型板块光度计(热科学™Multiskan™FC)。吸光度读数从每个是规范化的发射波长,和修正后的吸光度值获得的减法不结果实的控制每个实验井的平均水平。收集上清液进行分析后,井与PBS洗去除的遗骸和残余物PrestoBlue™染料,添加了一个新的新鲜培养基。评估,板块之间保持在标准条件。

2.3。扫描电子显微镜分析

后确定cytocompatibility OM-MSCs与Reaxon®,扫描电子显微镜(SEM)分析和能量色散x射线能谱(EDS)考试进行,使用高分辨率(肖特基)环境扫描电子显微镜和x射线微量分析和电子背散射衍射分析:广达400 FEG整体/ EDAX创世纪X4M操作在一个高真空模式下的加速电压15千伏SEM。

Reaxon®ngc被横向适合在24-well盘的直径,然后减少纵向。每个half-NGC被放置在一个。OM-MSCs被播种密度的6000 /厘米²与基本培养基的内部表面切ngc,留在文化216小时,每2 - 3天与介质的变化。这段时间后,井与0.1洗了三次消息灵通的缓冲区(默克®,PHG0001)。细胞内表面的ngc和缓冲2%戊二醛固定(默克®,G7651)和保存在一夜之间这个解决方案。然后,三个周期的细胞被洗5分钟与0.1消息灵通的缓冲区,和温柔的风潮。样本然后在一系列分级脱水乙醇(50% -70% -90% -99%),其次是化学干燥与hexamethyldisilazane (HMDS)(默克®,440191)在乙醇仅15分钟,HMDS的孵化15分钟。最后,把hdm从所有井后,板了一夜之间在层流室总蒸发。SEM和EDS之前,样品收集的井被溅射涂上金/钯,使用SPI模块溅射涂布机设备。

2.4。在活的有机体内化验

2.4.1。动物

批准的所有步骤涉及动物有机体负责动物福利(ORBEA)的阿贝尔萨拉萨尔生物医学科学研究所(ICBAS)大学的波尔图()项目(209/2017)和葡萄牙兽医当局(DGAV)(项目DGAV: 2018-07-11014510),总是符合欧盟指令2010/63 /欧洲议会和葡萄牙DL的113/2013,在经合组织指导文档识别、评估和使用临床体征作为实验动物用于人道的端点安全评价(2000)。此外,所有措施避免疼痛和不适,保证动物福利,考虑所有人道的端点动物痛苦和痛苦。

三十大鼠(鼠形),Sasco Sprague-Dawley品种,8 - 9周大,和250 - 300 g BW(查尔斯河,巴塞罗那,西班牙),被用于这项工作。只有男性使用,避免造成荷尔蒙影响女性的不同生育阶段观察到。动物被安置在房间温度和湿度控制,每2至3动物笼子,12-12 h光/暗周期。笼子里配备环境浓缩,和正常的生理活动,在标准实验室的条件。食物和水总是可用的随意。接收后,动物被驯化了两个星期。

2.4.2。实验设计

老鼠提交的neurotmesis损伤坐骨神经被分成六个实验治疗组(图1):集团1-uninjured控制(加州大学)( ),组2-EtE ( ),组神经末端的3-suture Reaxon®NGC (R) ( ),集团4-EtE和包装Reaxon®NGC(一特)( ),组神经末端的5-suture Reaxon®NGC和管理OM-MSCs悬浮在基底膜基质®( 细胞悬浮在300μl(基底膜基质®稀释在基本培养基(1:1))(ROM) ( ),和组6-EtE,包装Reaxon®NGC,和管理OM-MSCs悬浮在基底膜基质®(EtEROM) ( 细胞悬浮在300μl(基底膜基质®稀释在基本培养基(1:1))( )。Reaxon®ngc内部直径2.1毫米和15毫米的长度。神经横断和维修进行正确的后肢,使用和对侧肢体的控制。评估的主要结果包括电动机、疼痛的和行为功能和运动学评价;二次结果包括颅胫骨肌肉的质量的测定(m .胫cranialis)及其histomorphometric评价以及stereological评估收集后坐骨神经。

2.4.3。外科手术

这项工作中使用的外科技术是基于使用的协议和前面描述的62年- - - - - -64年),具体程序如下:

(1)坐骨神经修复模型。动物麻醉与甲苯噻嗪/氯胺酮(Rompun®/ 1000®Imalgene;1.25毫克/ 9毫克/ BW) 100克、腹腔内管理。麻醉后,老鼠被放置在左侧卧位,正确的肢体(三分法和无菌)准备手术。手术进行了一个m - 650操作显微镜下(徕卡微系统公司,位于德国)。神经是通过皮肤切口发起访问的大转子和远侧地延伸到大腿的midhalf。小心皮下清创后,分离的股外侧肌和股二头肌肌肉进行暴露坐骨神经。与肌肉软组织牵开器保持分开,坐骨神经是仔细分离邻近组织和固定化,紧随其后的是一个完整的横断面(neurotmesis)直接显微外科剪刀立即在分支站点之前常见的腓骨和胫骨的神经。

与对侧的神经被认为是控制和被加州大学集团的一部分,干预神经受到的治疗方法。于高频组神经上衣coaptized,确保解剖定位和取向和维持一个最低神经末梢之间的差距。确保这个位置,避免失调和旋转,简单的中断epineural microsutures两国紧张上衣(2 - 4缝合线)使用单丝尼龙7/0被应用。在R组,大约3毫米的神经顶部插入到Reaxon®ngc和固定在生物材料尽可能一致,面向通过epineural microsutures,使用单丝尼龙7/0(2 - 4缝合线)和离开大约10毫米的差距之间的两个神经末梢。一特集团,张力缝合应用所述。然后,Reaxon®NGC,纵切口,被包装的神经缝合部位,神经和NGC被妥善安置在肌肉避免生物材料的位移。罗组神经顶部插入Reaxon®NGC和缝合。然后,OM-MSCs悬浮在培养基和基底膜基质®是注射在NGC填补其内部直径。最后,EtEROM组,应用张力缝合和包装Reaxon®NGC进行描述,其次是灌装的内部直径NGC OM-MSCs悬浮在培养基和基底膜基质®。手术治疗后,肌肉、皮下和皮肤层被关闭使用简单的中断与4 - 0可吸收缝合线材料。 To avoid autotomy, all animals received a deterrent substance on the right paw. Anesthetic recovery was monitored in all animals, and the cages were returned to the housing facilities after all animals had awakened and returned to their normal behavior. After surgery, and for five consecutive days, the animals were medicated with carprofen (2-5 mg/kg SC QD). Throughout the study period, animals were frequently monitored and evaluated for signs of autotomy, contractures, and the development of wounds or infections.

2.4.4。功能评估

手术后的性能标准neurotmesis伤害和治疗方法的应用,一个周期函数进行评估以确定神经再生过程的进展。所有的动物手术前进行评估(周0)建立健康行为的基线。neurotmesis后,动物1和2周后进行评估,之后每两周直到20周。所有测试的功能评估会议由同一运营商的经验应用技术来避免个人间差异,并努力确保冷静和轻松的环境,以免病情观察的结果。

(1)电动机性能。扩展的姿势推力(EPT)测试是用来评估发动机性能,如前所述[62年,65年]。执行这个测试,老鼠的身体裹着软布,保持头部和后肢暴露出来。然后,动物是悬在数字秤(模型TM 560;Gibertini、意大利米兰)和降低慢慢地向它。重要的是,老鼠能够维持视觉接触秤为了能够预测接触和自愿延长后肢。接触秤必须与远端蹠骨和数字(图2(一个))。接触过程中施加的力的称重机是用克来衡量和记录的健康(NEPT)和(EEPT)四肢受伤。注册完成后一式三份,最后的价值被认为是三个重值的平均值。EEPT和NEPT值然后集成到下列方程(66年),为了确定电动机的百分比功能赤字:

(2)疼痛的功能。撤军反射潜伏期(WRL)测试是用来评估疼痛的功能的完整性67年]。在之前的测试中,动物是裹着软布和暂停加热板在56°C(模型35-D IITC生命科学仪器,林地,CA)。老鼠的爪子应放置在加热板的表面,确保外侧坐骨神经支配的爪子的干预是接触板(65年]。WRL的定义是,在几秒钟内,收回其需要的动物后肢接触后相应的爪子在板的表面。这一次是由平均三个测量对于每个肢体,等待两分钟之间测量,以避免敏感现象。动物在健康的情况下神经,将收回肢体4.3秒或更少。12个年代被认为是最大限度的爪子和加热板之间的接触,如果动物不收回肢体在这段时期,操作员应该搬走它,避免损伤和烧伤组织(68年]。动物的爪子轻轻应放置在盘子里,因为手动压缩可以激活机械,导致四肢缩回没有疼痛的激活(69年)(图2 (b))。同样,重要的是要记住,足底内侧方面的爪子表面由坐骨神经的支配,股神经的分支,因此隐神经抵押品萌芽在去除神经支配区是可能的。因此,重要的是要确保接触的爪子对加热表面的横向方面保证真实的结果(65年]。

(3)走跟踪分析。步行模式的评估可以通过确定坐骨函数索引(SFI)。在这项工作中,视频采集技术应用,适应技术用于其他组织使用墨水足迹记录(65年]。动物被放置在一个透明的丙烯酸走廊,下面的图像捕捉系统。在走廊的尽头,一个住所安装鼓励动物走在那个方向。老鼠被放置在隧道和刺激的开始走向避难所,允许注册脚接触地面的走廊时,通过录音系统(图2 (c))。对于每一个动物,被认为是三个记录对应三个有效的步骤,和一个有效的步骤是一个苍白的爪子限制和支持点观察,造成其对走廊的地板上的压力。获得的图像使用图像处理软件进行分析(Image-Pro +®6、媒体控制论,Inc .),考虑到相对应的校准走廊的地板之间的距离和视频捕捉设备,允许获得的三个措施考虑健康和实验爪子:打印长度(PL),脚趾脚趾之间传播距离1和5 (TS)和脚趾脚趾2和4之间传播(其)(图2 (d))。所得的平均值,然后使用以下公式(N代表“正常”和E代表“实验”):

收集到的值然后介绍以下公式:

SFI值0在健康动物和动物近-100的一个完整的损伤坐骨神经(70年]。

静态坐骨指数(SSI)来源于SFI,但站在动物的特殊性决定,不考虑PL值(71年]。对于这个测量,老鼠被放置在一个透明的压克力盒,进而被放置在走廊。因此,动物是静止的,与肢体接触地板,让摄影捕捉通过下面的设备放置立即(图2 (e))。健康的TS和它的值和实验四肢仔细测量一式三份(如前所述),平均值是集成到以下公式:

SSI值由公式:

SSI值大约在健康动物和动物约-90完成坐骨神经病变(70年]。

(4)运动学分析。脚踝运动学在步态周期结束时记录20周的治疗组和建立与UC组的步态周期模式相比,其值之前获得的感应neurotmesis病变。动作捕捉收集的光电系统6相机(OptiTrack Flex 3模型、NaturalPoint Inc .)和软件的动机(NaturalPoint Inc .)操作在一个120 Hz的帧速率。动物走在丙烯酸与长度,宽度,高度,分别120、12和15厘米(图3(一个))。三分法后,三个反光标记与2毫米直径在3骨日珥的右后肢鼠:第五跖骨,外踝,外侧上髁。所有标记都放在同样的操作,以避免个人间的变化。两个身体部分(脚和小腿)使用视觉三维重建软件,和老鼠的脚踝角( )确定使用的标量积向量代表的脚和向量代表柄(图3 (b)在立场阶段)和swing在老鼠步态周期的阶段被认为是(72年]。在这个模型中,积极的和消极的值的位置踝关节背屈和plantarflexion,分别。步态变量都是规范化的100%步态周期,每个周期,初步接触和脚趾头瞬间被确定。归一化时间参数是所有记录试验长度的平均值。

2.4.5。Stereological和Histomorphometric分析

(1)神经Stereological分析。研究建立了20周后,使用全身麻醉动物安乐死其次是致命的过量与Eutasil®(200毫克/毫升,200毫克/公斤合著。腹腔内)。安乐死被确认后,受伤的坐骨神经远端(10毫米长样本到病变部位)收集和未受伤害的控制(图4(一))和充分固定为进一步stereological评价通过光和电子显微镜。进入神经收集执行相同的方式访问手术干预。暴露坐骨神经后固定解决方案覆盖(2.5%纯化戊二醛和0.5%蔗糖在0.1 M索伦森磷酸盐缓冲剂(pH值7.4,4°C))为了促进其硬化和便于处理和收集。切除后,10毫米长段的近端部分是正确的识别是沉浸在同一个固定解决方案和面向正确对齐和5分钟,防止神经缠绕。然后,段是一直沉浸在固定解决方案6 - 8小时,之后,他们彻底清洗和浸在1.5%蔗糖清洗液在0.1 M索伦森磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)6 - 12 h。执行的组织学制备和histomorphometric评价后根据前面描述的协议(73年),参数的纤维(总数 ),纤维密度(N /毫米²)、轴突直径( ),纤维直径( ),髓鞘厚度( , ),和横截面积(毫米²)被认为是,除了比率/(g比率)。系统随机抽样和D-dissector采用(74年- - - - - -77年]。

(2)Histomorphometric肌肉分析。并行收集的坐骨神经,颅胫骨肌肉也收集(图4 (b))为进一步histomorphometric评估和神经性萎缩程度的确定。收集到的肌肉受伤和健康的四肢重然后用4%缓冲福尔马林固定,常规组织病理学分析处理(苏木精和伊红()))。midbelly区域的肌肉,连续部分(3μ米厚),准备,和染色,低放大率图像(100 x)是用尼康®显微镜获得连接到一个尼康®数码相机DXM1200。获得的图像处理使用ImageJ©软件(NIH),通过一个公正的抽样程序。个别纤维测量得到,和肌肉纤维区和Feret最小的直径(最小距离的平行切线在反对边境的肌肉纤维)计算。测量是盲目和随机获得至少800纤维为每个组,由2个独立和经验丰富的操作符。

2.4.6。统计分析

统计分析了使用软件GraphPad Prism 6.00版本Windows(美国加州La Jolla GraphPad软件)。在适当的时候,数据被表示为 。对比组通过一个参数测试与分析。的值 被认为是具有统计学意义。结果根据显示的重要性值的符号 : 对应于 , 来 , 来 ,和来 。

运动学分析,以客观量化的差异步态分析,统计参数映射(SPM),一个统计方法,允许假设检验在运动学和动力学波形不需要先验数据减少。SPM分析步态的脚踝平面角度试验,在一大群老鼠neurotmesis之后。SPM未配对 - - - - - -进行测试,比较每个模式的平均运动角各自意味着运动对照组(角 )。所有分析进行回顾性收集数据,使用开源SPM1d版本M.0.4.7 (2019.11.27;http://www.spm1D.org在MATLAB1)。

3所示。结果

3.1。rt - pcr

Ct值平均为每一个基因, , ,和RQ值表中可以看到2。纯度级别使用紫外分光光度法测定技术显示所有RNA样本纯净,让他们在接下来的阶段使用。融化曲线的分析揭示了存在一个峰值曲线的每一个基因,从而确认一个扩增子的放大。在未分化的细胞,图书馆和Cspg4基因显示 。所有其他基因,扣除Olig3, Ct值在29岁至39岁之间,表明积极的反应和目标核酸的存在适量的样品。Rbfox3,克莱斯勒和Syp基因并不确定在这些细胞,以及不确定的合成基因的细胞群体。在分化的细胞,只有图书馆 ,克莱斯勒,GAP43 Ascl1 和所有其他基因与积极的反应和适量的样品。Ocln Olig3基因,确定的未分化的细胞,没有发现有区别的。相反,克莱斯勒,Rbfox3 Syp基因识别神经源性诱导后的细胞只。

比较这两个段落,褶皱的变化表达的基因被观察到。基因识别的两种类型的细胞,观察upregulation在几乎所有的神经分化细胞和未分化的相比,扣除Cspg4 GAP43 Neurod1,维护正常的表达。基因表达下调的基因没有被观察到,在没有确定在两个细胞类型,它是不可能确定的相对表达。统计上显著的差异之间被确定值的基因Aldh1l1, Cd40、Cdh2 Cdk5r1, Map2, Ncam Sox2, Tubb3(图5)。

3.2。免疫组织化学分析

免疫组织化学结果可以分析评价图6。神经源性分化后,OM-MSCs显示GFAP免疫反应性(+ + +),NeuN(+),和GAP43 (+ +)。在未分化的细胞,只有对GFAP免疫反应性(+)被观察到。

3.3。在体外Cytocompatibility评估

cytocompatibility化验的结果在图描述7。获得的值在表S2和描述的统计差异确认表S3。

在24 h, OM-MSCs播种只有基础培养基(积极控制)显示明显更高的生存能力,与统计差异组( )。补充和DMSO,正如所料,最低的一个生存在这个时间点,它在所有时间点的位置,直到试验结束。在72小时,OM-MSCs的团体被播种接触Reaxon®ngc和基底膜基质®显示代谢活动优于阳性对照,两组之间没有统计学差异,但随着组与基底膜基质®显示统计差异与积极的控制( )。从这个时间点,剩下的三组有非常亲密的生存能力值,虽然在120 h,仍有积极的控制和统计差异组与基底膜基质®( )在168年和216 h,不再有差异。总的来说,积极控制,良好的生存能力是早在24小时,观察到随着时间逐渐增加;在测试组,似乎有一个初始延迟代谢活动率相关生物材料和人工基底膜的存在®,延迟与进步增加迅速克服生存能力在不同的时间点。对于这些三组,高原似乎已经达到了120 h,降低增量。正如所料,补充和DMSO被证明是有害的细胞从最初的时间点。

3.4。扫描电子显微镜分析

样本的评价通过SEM观察的外部和内部架构允许Reaxon®ngc(数字8(一个)- - - - - -8 (c)),OM-MSCs的形态学数据8 (d)- - - - - -8 (f)),同时该生物材料是否适合细胞粘附和增殖,可以单独使用,也可以均匀的细胞层(图9(一个))。EDS分析允许确认细胞的存在和均匀的细胞层,即,通过氮(数字的识别9 (b)- - - - - -9 (d))。

3.5。功能评估

3.5.1。电机的性能

功能性缺陷的百分比(%)记录直到如图20周10。完整的功能性赤字可以在表中找到的值S4和T20中观察到的统计差异表S5。

neurotmesis受伤后,后肢的显著损失强度和派生的百分比电动机赤字被观察到在所有干预组。在受伤后第1周高赤字比例被观察到在所有组相比,加州大学集团( )。周赤字逐渐下降,与集团的位置的变化在每个时间点更好的结果。从14周开始,显著降低发动机赤字在几乎所有的组织,除了疾病组,到研究结束的时期变化不太明显。20周后,罗组显示电动机赤字的比例最低,只有高频组呈现统计上显著差异( )。于高频组电动机性能最差的是学习时间结束时,显示显著差异和其他组:R ( ),一特( ),和EtEROM ( )。在这两种情况下,电动机赤字比例仍严重在20周后所有干预组,统计学上显著差异的群体相比UC组( 罗, EtEROM, 对于所有其他组)。

3.5.2。疼痛的功能

WRL值,在几秒钟内,获得20周图所示11。可以在表中找到完整的WRL值S6和T20中观察到的统计差异表S7。

neurotmesis受伤后,增加WRL时间观察干预组。在受伤后第1周实验组显示WRL倍等于最大值(12秒),需要删除的爪子从接触加热板,以避免热烧伤。在这一点上,之间没有统计学差异观察实验群体,但这些与UC组( )。从第2周开始,减少WRL时间开始对所有实验观察组。高频组下降更明显WRL时报,和在20周,它结束了一个更高的价值比UC组( )和其他实验组( )。在20周,最低的组WRL价值是一特,但没有显著的统计学差异与其他实验小组。此外,排除疾病组,其余的没有显示统计差异与UC组。

3.5.3。行走轨迹分析

观察到SFI值如图12。可以在表中找到完整的SFI值S8和T20中观察到的统计差异表S9。

neurotmesis损伤后,观察后肢严重障碍的干预组。在损伤后1周,尽管赤字所有组中观察到,高频组显示最坏的结果,一个位置,直到研究结束的时期。在这一点上,所有治疗组之间的显著差异观察和加州大学集团( )并于高频和一特( ),罗( ),和EtEROM ( )。从周2 - 4,SFI值的增加开始观察,改进,一直持续在整个20周的研究。罗集团20周记录最好的你的价值,但没有统计学差异与其他治疗组。高频(UC组显示统计差异 ),R ( ),和一特( )但与团体ROM和EtEROM无统计差异。

SSI记录值在图所示13。可以在表中找到完整的SFI值S10和T20中观察到的统计差异表S11。

如所预期地,关于SSI SFI相同图形演变,确认视频和照片记录的有效性方法捕捉动物行走的性能跟踪分析。在20周,高频组也是最严重的功能结果,与统计差异罗集团( )。罗集团是最好的结果,只有与高频组统计差异。UC组显示与高频统计差异( ),R ( ),和一特( )但没有差异EtEROM和罗。

3.5.4。运动分析

运动评价的结果如图所示14。

步态模式的踝关节在矢状平面四个干预组和加州大学之间的显著不同。4组显示增加至少在整个立场阶段( 由加州大学)。治疗组和加州大学波形之间的主要差异被发现在摇摆的阶段。swing后期阶段,4组与UC组呈现显著差异( 与R, 一特, 罗, EtEROM)。组一特和EtEROM没有区别与UC组在中间摆动阶段的步态周期(75 - 95%),而团体R和罗明显不同于UC组在这同一时期( 和 ,),分别揭示明显plantarflexed关节位置。关于步态的时空参数,所有组提出了更长的周期,增加立场阶段( , , , ,和 )和swing阶段( , , , ,和 )。

表3包含的定性表示治疗组的性能在不同的论文和测试执行在活的有机体内。一般来说,可以看到组收到OM-MSCs ngc和更好的整体性能,具有良好的结果基本上所有参数。然而,结果是不定期,在一些测试中,R或一特组显示相同或更好的性能。

3.6。Stereological和Histomorphometric分析

3.6.1。神经Stereological分析

stereological评估的结果如图所示15。图中可以看到相应的stereological图像16。总stereological结果可以在表中找到S12,和观察到的统计差异表向。

所有的治疗选项考虑证明stereological神经纤维再生的证据。控制相比,20周后,提交给不同的治疗选项显示神经microfasciculation现象与轴突和纤维直径小,薄更高的密度和数量的神经纤维,髓鞘。治疗组从未在任何参数显示它们之间的统计学差异。参数的密度和数量的纤维,高频组提供最高的价值( 纤维/毫米²和 纤维,分别)。在密度和轴突直径,有统计上显著的差异加州大学和其他组织( );在纤维的总数,有加州大学和疾病之间的差异( )。

神经纤维的最高价值和观察轴突直径一特集团( 和 ,分别),加州大学提出了差异与所有治疗组( )。在髓鞘的厚度,最高价值是一特集团( )再一次加州大学已经与所有其他群体(统计差异 )。最大的横截面积是达到EtEROM集团( ),和加州大学提出的统计差异与所有组( 的疾病, 与R, 一特, 罗)除了EtEROM(数据没有显示)。对于g比,该集团价值最高的是高频( )。

操作。Histomorphometric肌肉分析

所有颅胫骨肌肉与坐骨神经损伤比相应的最终权重较低侧肌肉集合的时候,平均损失 。观察最高比例的损失在R(组 ),和最小的罗集团( )。

纤维面积的值和最小Feret直径的颅胫骨肌肉的评估数据所示(17日)和17 (b)的组织学图像,图中可以看到不同的组18。观察发现在表的统计差异S14系列。

关于纤维区,与最好的结果的疾病治疗组( )和罗( )。疾病组与UC组没有显著差异( ),不像罗( )。于高频组显示统计差异与R组( )和一特( ),以及罗(R ( )和一特( ))。最糟糕的结果是观察一特集团( ),它只显示与R组没有明显的统计学差异( ),第二个最坏的结果( EtEROM)。R组与EtEROM组没有统计学差异( )。排除疾病组、加州大学组呈现统计上显著差异与所有其他治疗组(R,一特( );EtEROM ( ))。

最低Feret的角度而言,最好的价值观也观察到疾病( )和罗( )组,但在这种情况下,加州大学( )组显示统计学意义差异与所有治疗组( )。从罗高频组没有统计学差异,与其他组(R和一特( );EtEROM ( ));从R和一特罗组不同统计组( )。最坏的结果是在R组( ),其次是一特( )w5hich有统计学差异( )。EtEROM ( )小组还提出了统计上显著差异和两个坏的团体,R ( )和一特( )。

4所示。讨论

产生的成功修复周围神经的后句取决于损伤的类型和程度。neurotmesis损伤最严重,完整的神经横断的高潮在连续性和功能的丧失,轴突和结构的混乱,损失的涂层元素和髓鞘(78年]。ngc的使用是一个有效的替代传统技术治疗neurotmesis损伤如缝合线和签名,确保维护proregenerative环境内,较少受到有机免疫反应,有时,不利影响(79年]。这些ngc可以由材料与自然和人工起源、和他们的化学和物理特性可以修改和调整,以确保最佳的性能在促进神经再生和控制炎症反应(80年]。然而,尽管到目前为止提出的各种材料,但没有保证最优功能恢复后管道的应用程序。目前最有前途的选项包括修改ngc的内部架构,移植msc腔,也包括ECM和神经营养因子治疗方法。事实上,神经再生促进这项工作,使用壳聚糖ngc和OM-MSCs悬浮在基底膜基质®,允许观察功能好,运动,动物受到neurotmesis histomorphometric结果,尽管结果尚未足以相当于完全再生。

壳聚糖用于医学应用已有很长一段时间由于其生物降解性,生物相容性,没有毒性。尽管这种生物材料已经应用在不同形式和不同的外科技术,作品的数量,它一直作为ngc降低,尤其是在ngc仅由壳聚糖组成(16]。运用工作研究了好处之一Reaxon®ngc在周围感觉神经的主要修复展示了更好的触觉灵知的结果和敏感性比传统的高频缝合技术(21]。另一个工作探索新鲜骨骼肌纤维的应用结合Reaxon®渠道促进neurotmesis后大鼠正中神经的再生。然而,尽管这种组合技术似乎有优势,也就是说,增加生产调节、无统计差异的观察剩余的形态学分析治疗组在功能恢复和不允许画任何更广泛的结论(81年]。在这工作,Reaxon®ngc和内部直径2.1毫米被用于不同的外科技术刺激大鼠坐骨神经再生neurotmesis后,独自和结合OM-MSCs和基底膜基质®。

OM-MSCs最近才开始探索在再生医学和应用于神经系统。在一项研究中,比较了使用两相的胶原蛋白和laminin-functionalized透明质酸与OM-MSCs ngc和没有补充,结合技术显示更好的临床和电生理结果比单独使用ngc,与更多的轴突和疼痛的戒断反应更迅速恢复正常的值(45]。在这项工作中使用老鼠OM-MSCs遵循宽表征的研究这些细胞(23]。一个完整的生物特征,与核型正常的识别在不同的段落,tridifferentiation和神经源性分化的能力,具备干细胞和确认他们的特点,允许建立这些细胞足够的应用在再生医学治疗。此外,它还允许识别多个基因msc和各自的特点也分化和特定的表面标记。初步鉴定的条件培养基OM-MSCs在48小时还允许识别免疫调节和免疫抑制因素,趋化因子,生长因子,和白细胞介素重要再生现象,补充结果被其他作者(82年]。因为在这之前的研究基因和表面标记与神经源性分化的潜力被确定在OM-MSCs未分化状态和神经源性分化的能力测试完全通过观察收购neuroglial-like形状在文化、在目前的研究中,一个额外的生物特征进行了识别神经源性分化相关基因和表面标记,比较他们的存在和表达之间的未分化的细胞和神经源性分化后。之前在活的有机体内应用程序中,cytocompatibility OM-MSCs与Reaxon®和细胞和基底膜基质之间®进行了测试,以确保细胞生存能力和新陈代谢之间的接触不会造成不利影响细胞和生物材料和ECM的替代品。此外,互补,Reaxon®管接受播种OM-MSCs通过SEM和EDS分析证实这些细胞的粘附其内部表面没有形态变化,形成均匀的细胞层。这些初步的测试后,最后,壳聚糖ngc结合OM-MSCs和基底膜基质®被用于neurotmesis损伤后大鼠的坐骨神经,测试的能力,这种治疗方法在句后促进周围神经再生。这种能力测试在活的有机体内通过功能和运动学研究和后期通过histomorphometric stereological评估。

用rt - pcr技术,22日与神经源性分化相关的基因在未分化和分化OM-MSCs量化。它也可以识别褶皱的变化表达这些基因在细胞间的两组。在两组,细胞在P6被使用,根据细胞分化倾向的增加在这篇文章,正如前面确认(23]。没有污染的RNA样品用于证实了互补脱氧核糖核酸合成分光光度法,和融化的解释曲线证实存在一个峰值,也就是放大一个每个基因的扩增子。基因的识别特征的神经胶质细胞未分化细胞必须被视为倾向为这些细胞神经源性分化时受到适当的prodifferentiation刺激。分化的细胞,可以考虑基因的存在有一个活跃的功能在他们的特定功能和表型。合成的基因,表达了特别的雪旺细胞周围神经系统,负责跨膜糖蛋白与外围髓鞘结构函数(83年),是唯一一个不确定的细胞群体。克莱斯勒(microtubule-associated磷蛋白质表达的不成熟postmitotic神经元,神经元迁移所需(84年]),Rbfox3从成熟postmitotic神经元(特定的蛋白质85年])和Syp(监管水泡内吞作用在成熟神经元的突触(86年])基因的分化但不是在未分化的细胞,这可能表明一个分化的OM-MSCs neuron-like方向。重要的是要注意,synaptophysin已经发现在未分化OM-MSCs通过免疫组织化学技术,虽然免疫反应性较弱(23]。Ocln(表达在神经发生的神经上皮细胞早熟的阶段(87年])仅仅是未分化的细胞中表达,没有像预期的那样在分化细胞。Olig3,成熟少突胶质细胞的表达88年),也只表现在未分化的细胞。所有剩余的基因被发现在两组细胞,在任何情况下的差别,对这些基因的分化细胞。价值最高的基因RQ Aldh1l1(星形分化标记(89年])和Cd40(在小胶质细胞中表达90年),即基因与神经胶质细胞在中枢神经系统有关。其他基因与神经胶质细胞分化调节在OM-MSCs包括Cdh2(径向神经胶细胞中表达91年]),GFAP(纤丝的蛋白质在星形胶质细胞胶质细胞表达的特点和径向神经胶质92年]),Ncam1(细胞粘附相关糖蛋白nonmyelinating雪旺细胞(93年]),Nes(中间丝蛋白表达在未分化的中枢神经系统,在径向神经胶质星形胶质细胞的发展,而且在成熟的中枢神经系统(94年]),Sox2(持久的标志multipotential神经干细胞增殖细胞中表达和那些跟随胶质分化,但不是在postmitotic神经元中表达的95年])和Sox10(存在于神经上皮细胞和髓鞘许旺细胞前体(96年])。GFAP和Sox2也被发现在未分化OM-MSCs [23]。反过来,与神经元,相关的基因调节,包括Ascl1(促进神经分化,即在嗅觉神经元的生成97年]),Cdksr1(不同的功能从神经元分化和迁移到突触传递98年]),图书馆(兴奋性突触的突触后蛋白质99年]),Map2(微管稳定剂在postmitotic神经元的树突(One hundred.])和Tubb3(未成熟的特异性神经元微管蛋白还参与周围轴突再生(101年]。最后,Cspg4(与髓鞘相关少突细胞前体(102年]),GAP43(常见的标记神经元发生分化,在开发或高度表达的神经元在再生轴突生长,也表达了在nonmyelinating雪旺细胞103年,104年])和Neurod1(与未成熟神经元,促进神经系统发育、神经分化和诱导终端在嗅觉神经发生105年]),尽管在两组细胞的表达,既不,也不分化OM-MSCs表达下调。一般来说,rt - pcr的结果表明,当发生神经源性分化,OM-MSCs不仅获得神经胶质细胞表型也呈现显著upregulation神经胶质的基因。

补充rt - pcr的结果,GFAP免疫组织化学评价进行识别,NeuN (Rbfox3)和immunomarkers GAP43蛋白质。GFAP标记被确认在未分化和分化细胞,但与弱和强免疫反应性在第一组neurodifferentiation之后,分别。这个结果证实,获得的rt - pcr upregulation GFAP的分化细胞中检测到。GFAP之前已经被确认在未分化OM-MSCs [23]。NeuN表达式仅被neurodifferentiated细胞免疫反应性较弱,在rt - pcr, Rbfox3表达式也只在细胞分化后观察。GAP43表示只有在分化细胞的膜,用温和的反应性。在rt - pcr,虽然GAP43被确认在两组细胞,观察差别无论是upregulation还是对这些neurodifferentiation之后。

rt - pcr和免疫组织化学检测同一行之后的结果,表明超表达的神经胶质的immunomarkers神经源性细胞分化后细胞内。然而,由于upregulation和免疫反应性neuron-related和glia-associated基因和蛋白质标记都注意到,很难定义是否有主要倾向于OM-MSCs分化成一些特定的神经胶质的细胞类型。也许,在活的有机体内,OM-MSCs将遵循不同的神经或神经胶质分化取决于植入网站和当地的刺激。

生物材料的应用在人体或动物模型仅得遵循一定的要求:在生物安全(没有毒性,也没有生成宿主免疫反应),摘要,抵抗降解(不含材料的固有生物降解)。这些特征可以通过确定证实他们的生物相容性106年]。cytocompatibility这个词,即在体外特定细胞的行为和代谢性能播种接触材料时,可以被认为是一个特定的生物相容性,这是更广泛的术语(107年]。与OM-MSCs cytocompatibility Reaxon®和基底膜基质®研究使用PrestoBlue®细胞生存能力分析。基于刃天青PrestoBlue®是一个蓝色的试剂,细胞膜的渗透性,在线粒体代谢,导致resorufin,红色荧光化合物,可以同时通过肉眼观察和测量其吸光度,建立直接关系的可行性和研究细胞的代谢活动(108年]。这项试验的结果表明壳聚糖导管和基底膜基质®暂时延迟细胞粘附,生存能力和代谢的差异表现在24小时观察OM-MSCs相比,种子只有通常的培养基。然而,从这一点上,与生物材料相关的可行性和基底膜基质®增加,之后的时间点,没有积极的控制和测试组之间的差别。确认微观互动OM-MSCs和Reaxon®管道,被播种的壳聚糖导管细胞应用扫描电子显微镜及能谱仪进行评估,评估中可以证实的容许特点Reaxon®。OM-MSCs坚持内部管道表面,保持正常形态和形成细胞层。EDS技术,结合SEM,使用时允许元素的识别要分析的样品表面附近,创建一个平面的地图确定的化学成分通过发射x射线的能量109年]。在这种情况下,所有的分析区域,可以看到优势的元素碳和氧,由于壳聚糖的化学结构。然而,评估Z1和Z2地区允许氮峰的鉴定,这是一个基本的细胞化学成分,在这里工作是一个标识符的存在细胞的表面材料坚持NGC,确认扫描电镜的结构确定,事实上,OM-MSCs坚持和细胞层壳聚糖NGC的内表面。

OM-MSCs后额外的生物表征和测定之间的cytocompatibility msc、Reaxon®,和基底膜基质®,选择治疗的疗效的组合在活的有机体内被评估。手术后应用程序的五个治疗选项,动物被定期评估来确定电动机的发展超过20周,疼痛的,行为表现和步态特征。在研究结束的时期,动物受到运动评价和坐骨神经和颅胫骨肌肉收集stereological和histomorphometric评估,分别。

电动机赤字的比例显著降低在所有动物neurotmesis后的第一个星期。第六至第八周,改善电机性能开始在所有组中被观察到,但这是14周改善更加明显,表明优越的运动神经纤维再生。在20周,所有组电动机赤字的比例远低于参与值,揭示所有治疗方法的疗效在促进运动功能的恢复。罗组的最好的结果。除了疾病组,最坏的结果,测试组之间没有统计学差异,但没有一个人,一个电机性能与对照组相似。

WRL也增加到最大值后考虑neurotmesis(12),表明热灵敏度的总没有在这个阶段。第二至第四个星期后手术,减少WRL时间观察,表明感觉神经纤维的再生。这种改进,不太明显的集团,一直持续到20周的结束。最好的结果是一特组中观察到,但学习小组都是足够低的值不观察统计,UC组之间的差异。这些好的结果证实了其他研究中观察到疼痛的评估使用Reaxon®ngc [21]和OM-MSCs [45]。

SSI和SFI的观察结果是一致的。在这两种情况下,neurotmesis后,值下跌接近最小值被认为是伤害。第二个和第四个星期,之间有一个改善这两个指标的值,值不断增加到20周的结束。疾病组,最坏的结果,和罗EtEROM组的最佳效果,与UC组无统计学差异。只有团体没有收到OM-MSCs和Reaxon®显示统计差异由加州大学。录像和照相记录技术用于这项工作也能取代传统的技术用墨水记录足迹,使过程更快,更容易执行和结果更容易理解。

总的来说,是有可能的状态,所有的治疗团体提升改进的功能参数评估,与团体收到OM-MSCs Reaxon®,和基底膜基质®促进电动机性能最好的最终结果和步行道一特集团分析和促进最佳的疼痛的复苏。伤害感受和坐骨指数最终值足以避免统计组与更好的结果和对照组之间的差异,这一事实并不是注册在马达复苏。于高频组显示所有测试的最差表现。

关于运动的结果,另一种统计策略应用使用全局变量曲线对齐,减少个人联合数据克服关节运动学interanimal可变性周围神经损伤后,提出了在以前的作品(110年- - - - - -112年]。可以测量后踝关节的运动赤字句和验证的严重性在摆动阶段散步。在摇摆不定的阶段,而不是在立场阶段,坐骨神经神经支配后运动功能障碍更明显(112年]。一特和EtEROM透露类似的模式的步态偏差与UC组相比,特别是在摇摆不定的阶段,与EtEROM组治疗组之间的最佳性能。这两组的共同点,坐骨神经受到一个与治疗相关疾病缝合NGC和OM-MSCs,但是考虑到穷人的结果观察到疾病组的功能评估运动评价的结果也获得了在先前的研究113年),这种传统缝合的影响在这个良好的运动性能进行解释时应特别谨慎。罗集团是运动学评估显示最糟糕的结果,一个意想不到的结果考虑到这个群体的良好的性能在几乎所有其他测试。脚踝运动赤字影响摆动阶段演示的能力的缺乏积极执行背屈和plantarflexion干预动物。降低踝关节背屈角中间摇摆,定义为瞬间摆动腿穿过侧后肢,已经被报道在坐骨神经axonotmesis [112年,114年,115年),也观察到在这种情况下,即使在动物属于团体,更好的恢复和运动学性能。虽然挛缩neurotmesis损伤后立即在大多数动物观察到减毒随着时间的推移,功能恢复并不完整,和20周后,仍有运动障碍的迹象在步态及其组件/阶段。因此,立场阶段和摆动阶段的持续时间超过《纽约时报》被认为是标准的大鼠(116年]。

神经纤维形态分析和定量评估的一个重要评估确定损伤后神经再生的程度,治疗,和体视学应该被结合功能和运动的结果(75年]。在这个工作中,所有神经遭受neurotmesis和遭受特定疗法,20周后,microfasciculation,高密度和神经纤维的数量,与小直径轴突,和薄髓鞘,特征通常观察到神经已经经历了一个再生的过程。在图对应的图像16证实stereological发现。然而,这种分析的结果必须被评估的额外照顾。神经纤维的数量和密度通常被解释为神经再生的直接指标。大量的再生神经纤维可以关联不仅具有良好的再生过程,而且变化如异常的萌芽,和高密度也可以反映的存在大量的轴突,但小的尺寸。相反,低纤维密度可能代表的存在较大的轴突,但也存在intraneural水肿。通常,神经损伤后不久,倾向于看到神经纤维的数量和密度的增加和轴突直径较小的神经再生过程中,随着时间的推移,这一形势逆转,当轴突会增加他们的直径和数量和密度可能减少(117年]。高频组提出的更高的密度和纤维的数量值,因此,考虑功能评估的结果,一个是20周后神经再生的欠发达阶段。EtEROM和一特值最低的密度,和一特最低数量的纤维。神经纤维的直径是主要的决定因素的传导速度因为它告诉直径轴突和髓鞘的厚度118年]。三个参数, , ,和 ,一特集团的礼物是最好的stereological性能,但事实上,其价值观非常不同于那些在UC组和治疗组之间没有统计学差异不允许更多扩展的结论。g比轴突直径涉及总神经纤维的直径(/),通常分析功能和结构指数,反映出轴突髓鞘形成的质量。传统上,0.6的值作为周围神经的最佳g比成立(119年,120年]。因此,在髓鞘的厚度偏差,因此比0.6 g比率更大或更小,促进减少传导速度(121年]。g比观察到这项工作揭示值0.6或非常接近的群体(加州大学和治疗组),因此,无统计差异。这个结果似乎表明,尽管stereological差异中观察到治疗组、介入神经发展潜力良好的轴突髓鞘形成和有效的传导速度,这证实了剩下的测试执行结果观察。总的来说,stereological评估干预神经揭示了一个刺激的神经再生和相同的表演在所有治疗组测试。然而,缺乏统计差异组认为,最终的值低于对照组观察到几乎所有参数不允许建立任何治疗选择最有利的。

Histomorphometric评估前胫骨肌肉,作为效应器坐骨神经肌肉,显示不同的神经源性肌萎缩取决于治疗的方法。最好的纤维领域的最终值和最小Feret的角度观察组,在第一种情况下与对照组无统计学差异,结果偏离这种手术方法表现不佳的剩下的评估。在这两种情况下,最好的罗集团是第二肌肉参数和也是一个肌肉损失的比例较低,确凿的治疗选择的良好的性能在功能评估。生物材料的组织是单独使用那些最糟糕的结果。这些结果似乎表明,高频组中,有一个早期重建的神经连接,这也许是因为可能暂时推迟其他组织细胞活动的因素,如t5he生物材料和人工基底膜®作为cytocompatibility化验证明,导致胫骨前肌的神经reestimulation早些时候也和避免/减少神经性萎缩。尽管早期的重新连接,在这组功能恢复是不像在剩余的有效治疗组和高频组显示最糟糕的结果比其他群体而言,电动机和疼痛的恢复和坐骨索引。20周结束时,罗和EtEROM团体证明类似于高频的表现,这可能表明早期重新连接与使用OM-MSCs似乎并没有发生在组织,只有收到Reaxon®。有趣的是,罗和EtEROM组织EPT还展示了最好的结果,SFI, SSI测试,证实了避免/扭转神经性肌肉萎缩的重要性保持良好的运动性能和保证在步态回到一个正常的行为活动。

排除的histomorphometric评价颅胫骨肌肉,高频组提出了一个在所有论文表现不佳,这可以被认为是自这一技术仍被认为是意想不到的,加上自体移植术,治疗的黄金标准neurotmesis接合时可以获得张力和在受伤部位well-vascularized床。然而,观察较弱的情况下接受疾病的治疗性能比那些收到制管修复不是独家122年,123年]。尽管并列,面向对齐两个神经的上衣在缝合,很难保证准确axon-to-axon或者endoneurium-to-endoneurium完美的校准和重新连接,通常可以转化为误导现象和异常运动/感觉连接的建立再生神经。另一方面,它已被证明,使用ngc设法减轻误导的现象(124年),与msc结合使用时,他们有能力促进proregenerative环境中,长时间随着时间的推移,转化为更好的性能的这些疗法与传统应用程序的缝合线。

尽管有前景的结果,重要的是要考虑的一些限制,必须克服在未来工作。每组中使用的小型的动物数量达到可以限制的程度的结论,尽管老鼠模型是一个很好的起点,探讨治疗方法研究在转化的角度来看,重要的是要考虑未来论文的使用更复杂的模型能够更好地模拟人类神经再生的速度和特点,这明显不同于观察大鼠模型(125年]。此外,它也将是重要的执行其他功能评估测试,考虑一个尺寸,没有探索,即神经和肌肉电生理论文将允许获取重要信息的返还神经再生后电导率和没有评估工作。

5。结论和进一步的方向

msc和生物材料的组合使用来促进周围神经再生后句是一个越来越应用治疗技术不错的效果。OM-MSCs,尽管很少发表作品,似乎是一种msc的特色应用在神经再生,以及壳聚糖ngc的使用已被证明是一种有效的疗法。在这部作品中,最初的生物表征OM-MSCs允许确认通过PCR和免疫组织化学技术的趋势这些细胞神经源性分化,不仅形态,而且通过神经胶质的标记物的表达。此外,cytocompatibility研究和使用在不同的治疗组没有导致局部反应和全身毒性的证据与OM-MSCs的存在,强化了安全的治疗使用这些细胞。

功能评估、运动分析和histomorphometric评估确认使用Reaxon®ngc和OM-MSCs提升功能改进整个研究期间,20周后神经再生的证据。最好的运动性能和坐骨索引被观察到的组接受ngc和OM-MSCs ROM和EtEROM,疼痛的功能更有效地恢复一特组。20周后步态障碍EtEROM组不太明显。所有治疗组有相同stereological结果,虽然一特集团略高值等重要参数的轴突直径、神经纤维直径、髓鞘厚度。高频技术获得最好的结果histomorphometric评估颅胫骨肌肉,但随着罗和EtEROM组显示相同的表现。

总之,这项工作的结果证明承诺的影响使用OM-MSCs和Reaxon®ngc在促进受伤的周围神经的再生和可能开辟新的治疗途径。然而,也有一些结果中的违规行为不同的治疗组,在大部分的论文,结果都低于对照组观察。这个场景中强化神经再生是一个复杂和多因子的过程,并完全理解再生功效的治疗制定,一个集成的方法总是必要的,使用不同的功能和histomorphometric评估技术与神经再生相关评价两个维度:结构和功能。进一步的研究是必要的回答提出的疑虑,建立更合理的治疗方法使用OM-MSCs和生物材料。

缩写

:	踝关节角度
Ct:	阈值周期
DMSO溶液:	二甲亚砜
ECM:	细胞外基质
EDS:	能量色散x射线光谱
EEPT:	实验扩展姿势推力
EPT:	扩展的姿势推力
研讨会:	端到端缝合
一特:	于高频和包装Reaxon®NGC
EtEROM:	于高频,包装Reaxon®NGC,管理OM-MSCs悬浮在基底膜基质®
HMDS:	Hexamethyldisilazane
其:	脚趾2和4之间传播距离
msc:	间充质干细胞
msc:	间充质干细胞/基质细胞
:	每组动物的数量
NEPT:	正常的扩展姿势推力;
NGC:	神经指导管道
OM:	嗅觉粘膜
OM-MSCs:	嗅觉粘膜间充质干细胞/基质细胞
PBS:	磷酸盐生理盐水
PL:	打印长度
句:	周围神经损伤
接待员:	缝合神经末端的Reaxon®NGC
罗:	缝合神经末端的Reaxon®NGC和管理OM-MSCs悬浮在基底膜基质®
中移动:	相对量化
rt - pcr:	逆转录酶聚合酶链反应
扫描电镜:	扫描电子显微镜
你以后:	坐骨函数索引
SPM:	统计参数映射
SSI:	静态坐骨指数
TS:	脚趾之间传播距离1和5
加州大学:	的控制
WRL:	戒断反应延迟。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者的请求。

信息披露

Medovent GmbH(美因茨,德国)没有参与设计、准备、开展的工作和数据分析,写作的结果,本研究和出版。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

这项研究受到了项目PEst-OE / AGR UI0211/2011 FCT和竞争2020年从ANI-Projetos ID&T senior em Copromocao, insitu公司由项目”。生物量-改造生物制造系统通过使用可用性方法原位诊所临时植入制造”与参考poci - 01 - 0247 -菲德尔- 017771项目“Print-on-Organs——工程bioinks和流程直接打印器官”的参考poci - 01 - 0247 -菲德尔- 033877,和项目”Bone2Move——“体内”实验技术的发展和评估建模方法4 d支架在羊骨缺损模型:一个综合的研究方法与参考poci - 01 - 0145 -菲德尔- 031146。马里亚纳维埃拉Branquinho (SFRH / BD / 146172/2019),安娜卡塔琳娜州苏萨(SFRH / BD / 146689/2019),和瑞达马西奥铪锆石(SFRH / BD / 116118/2016)承认FCT的金融支持。本工作中使用的Reaxon®ngc请提供Medovent GmbH(美因茨,德国)。

补充材料

表S1:列表下的基因研究各自的扩增子序列,合奏ID基因,PCR产品长度。表S2:校正吸光度不同组的评估PrestoBlue®可行性试验,在不同的时间点。结果提出了 。表S3:统计差异校正吸光度不同群体之间的确定:(一)24小时;(b) 72 h;(c) 120 h;(d) 168 h;(e) 216 h (ns =)没有明显的统计学差异。表S4:功能性赤字(%)获得的值执行EPT测试。这些测试进行术前(T0)和1和2周后neurotmesis (T1和T2)和从那里每两周直到星期20 (T20)。结果提出了均值和SD (=每组动物的数量)。表S5:统计差异在20周观察在EPT测试(ns =)没有明显的统计学差异。在几秒钟内表S6: WRL值(s)获得执行WRL测试。这些测试进行术前(T0)和1和2周后neurotmesis (T1和T2)和从那里每两周直到星期20 (T20)。结果提出了均值和SD (=每组动物的数量)。表S7:统计差异在20周观察在EPT测试(ns =)没有明显的统计学差异。表S8:通过SFI功能恢复的结果。这些测试进行术前(T0)和1和2周后neurotmesis (T1和T2)和从那里每两周直到星期20 (T20)。结果提出了均值和SD (=每组动物的数量。表S9:统计差异在20周观察在SFI测试(ns =)没有明显的统计学差异。表S10:通过SSI功能恢复的结果。这些测试进行术前(T0)和1和2周后neurotmesis (T1和T2)和从那里每两周直到星期20 (T20)。结果提出了均值和SD (=每组动物的数量)。表S11:统计差异在20周观察在SSI测试(ns =)没有明显的统计学差异。表S12: stereological定量评估。不同的参数考虑被评估再生坐骨神经在20周neurotmesis后(T20)。结果提出了均值和SD (=每组动物的数量)。表向:神经stereological统计差异分析:(a)纤维的密度;(b)纤维的总数;(c)轴突直径;纤维直径(d);(e)髓鞘厚度;(f) g比率;(g)横截面积(ns =)没有明显的统计学差异。表S14系列:在统计上有显著差异的评价胫骨颅肌肉:个人纤维面积(a);(b)最低Feret肌肉纤维的直径(ns =)没有明显的统计学差异。(补充材料)

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