文摘

建立了研究证明了静水压力有多对椎间盘的生物行为的影响(试管)。然而,先前的研究的结论是不一致的,由于液压加载装置和观察方法的差异在这些研究中使用。目前的研究旨在调查动态静水压力的作用在调节生物行为的notochordal髓核(NP)和纤维软骨的内部纤维环(AF)及其可能机制使用我们新的自主研发的静水压力生物反应器。兔子的生物学行为的差异试管组织不同程度的静水压力下被评估通过组织学分析。结果显示,给定动态静水压力是有利于细胞存活率和细胞外基质(ECM)内稳态notochordal NP和纤维软骨的内在房颤通过上调N-cadherin (N-CDH)和整合素β1。相比之下,高震级动态静水压力加剧ECM内稳态的破坏NP和内心AF通过提高Hippo-YAP /小胡子pathway-mediated细胞凋亡。此外,内部AF展现更大的宽容比notochordal NP生理中度载荷的静水压力。潜在的机制有关的微分表达式mechanosensing因素notochordal NP和纤维软骨的内在房颤,影响细胞在静水压力下的命运。我们的发现可能会提供一个更好的理解发挥监管作用的静水压力对细胞命运的承诺和基质代谢的试管和更实质性的证据使用静水压力生物反应器在探索试管退化机制以及再生策略。

1。介绍

椎间盘(试管)包括两个隔间,髓核(NP)和纤维环(AF) [1连接相邻骨椎体)。NP组织是一种凝胶状的结构,主要包含胶原原纤维和蛋白多糖分子,aggrecan [2]。NP AF包围,由I型和II型胶原原纤维,安排在交替斜角度形成同心圆(3]。试管组织由NP和房颤,但是他们来自不同的胚胎结构。NP来自脊索,而房颤来源于体节[1,4,5]。此外,更丰富的NP蛋白多糖分子和内心比外房颤(AF3]。丰富的高水分蛋白聚糖有助于缓冲压加载的脊椎和保持组织内的胶原蛋白一起超微结构(6]。因此,细胞NP和内心房颤与静水压力生活在一个独特的微环境。

一些研究报道静水压力的影响在试管组织或细胞获得不同的物种。然而,研究的结论并不完全一致,由于不同质量的液压加载装置和观察方法用于研究。据报道,“生理强度(0.35 - -0.75 MPa)”的静水压力作为一个NP和房颤细胞的合成代谢因素,由于刺激蛋白合成的7- - - - - -9]。相反,过度的压力加剧蛋白多糖的分解代谢NP和房颤细胞(7- - - - - -9]。另一项研究报道,蛋白合成抑制0.35 MPa相比,大气压力对NP和房颤腰椎试管组织细胞克隆的狗(10]。然而,刺激胶原蛋白的合成在NP细胞但在房颤抑制细胞(10]。这些实验结果的差异可能是由于的原因,之前的研究中使用的细胞培养在菜或海藻酸。矩阵刚度、弹性模量和渗透的营养与试管的自然矩阵[有很大不同7,8,10]。此外,NP组织经过一个过渡从notochordal纤维软骨的一个,它伴随细胞类型从notochordal fibrochondrocyte-like细胞的变化。在人类中,过渡通常是二十岁之前完成11]。而在一些动物,比如兔子、狗、notochordal NP是永久保存在一些比例(5,12- - - - - -14]。根据一些研究,成熟的髓核和notochordal细胞的响应的静水压力是完全不同的15,16]。此外,据报道,静水压力可以促使notochordal NP过渡的纤维软骨的NP (15- - - - - -17]。

考虑到不同的细胞表型在试管中,当前的研究证明notochordal NP的反应和纤维软骨的内在AF的静水压力。为此,我们建立了一个新颖的静水压力组织培养模型研究不同生物行为的两个有凝聚力的组织在同一个试管样本。我们切断了软骨终板和暴露了NP和内心AF兔腰椎试管的组织,这是一个常用的模型研究试管生物行为和变性进展(12]。接下来,对待试管中培养我们的新开发的静水压力生物反应器四个星期。我们之前的研究已经表明生理的静水压力可以刺激细胞增殖和ECM关节软骨的生产,证实了我们的静水压力培养系统的可行性和可靠性(18]。一项研究表明N-CDH和integrin-mediated粘附相关交互调制YAP-TAZ mechanosensing和细胞命运的承诺19]。我们之前的研究阐明,N-cadherin (N-CDH)作为一个NP细胞保护作用对重载压缩(20.]。此外,一些研究报道,纤连蛋白结合整合素β1导致提升apoptosis-related蛋白质的表达[21,22]。N-CDH和integrin-associated监管角色可能涉及椎间盘细胞的组织学和生化改变compression-loading引起的压力。因此,在当前的研究中,我们的目标是找出差异和潜在机制的生物行为notochordal NP和纤维软骨的内在房颤在不同程度的静水压力通过调查组织学特性,细胞生存和ECM代谢。本研究可能提供一种新的流体静力pressure-based试管再生战略和潜在的调节目标治疗抗压loading-related试管变性。

2。材料和方法

2.1。源的动物

成熟的雄性新西兰白兔(160周,体重3.5 - -3.8公斤)被用于当前的研究。后腰椎棘突是无菌获得来自兔子被过量的钠pentobarbiturates安乐死。

2.2。组织解剖和文化

脊柱运动节段被大幅削减在近端和远端椎骨在轴向平行平面接近邻近终板和洗五次磷酸盐(PBS)的组织培养菜(喷气Biofil,中国)。然后,软骨终板的试管被大幅削减公开NP和内心AF组织。之后,对待试管被转移到我们自主研发的文化室动态水压加载器官培养生物反应器。组织培养在室完全培养基(DMEM / F-12(美国Gibco)含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)和1%青霉素和链霉素(美国Gibco))和孵化(5%的二氧化碳,37°C)四天前施加静水压力。每四天培养媒体所取代。

2.3。静水压力施加协议

在执行政权的压力,文化钱伯斯被转移到我们的定制的动态静水压力生物反应器。我们设置了压力装置提供间歇性的静水压力。简单地说,每一个动态静水压力施加周期包含一个30秒的压力施加阶段和一个30秒的压力释放阶段。样本分为以下组:对照组( MPa)和梯度动态静水压力施加组( MPa, 0.8 MPa, 1.0 MPa, 3.0 MPa, 5.0 MPa)。每组是施加动态静水压力每天2小时,然后转移到孵化器(5%的二氧化碳,37°C)。培养基是每四天更换一次。试管标本被收集进一步的实验测试后30天的文化。

2.4。组织学苏木精和伊红染色(他)

对样本收割和4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,然后切成5μ米每一节。然后,组织部分被苏木精和伊红染色。彩色部分是光学显微镜下观察和扫描(奥林巴斯、日本)。

2.5。阿尔新蓝染色

阿尔新蓝染色法用于检测ECM粘多糖沉积。短暂,每个组织切片是孵化前0.2%阿尔新蓝溶液和去离子水冲洗。然后,染色细胞被安装和光学显微镜下观察(奥林巴斯、日本)。

2.6。硫酸粘多糖(sGAG)量化

ECM的定量分析,量化了每组的sGAG内容二甲基氯化亚甲蓝(美国Sigma-Aldrich)。总sGAG由0.98 mol / L氯胍盐沉淀的解决方案。之后,光密度(OD)检测在595海里。sGAG内容确定根据OD值和标准曲线。

2.7。荧光TdT-UTP尼克结束标记(TUNEL)化验

TUNEL分析进行检测的靶细胞凋亡一步TUNEL细胞凋亡测定工具包(Beyotime,中国)根据制造商的指示。组织部分首先接受Triton x - 100(0.3%)在室温下5分钟。然后,与TUNEL细胞治疗1小时37°C的黑暗。通过荧光显微镜成像的部分DAPI染色后(德国徕卡)。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)

为了进一步评估ECM的合成,包含IHC染色是用来检测aggrecan, I和II型胶原含量。补液后,组织部分被山羊血清,采用透明质酸酶(0.8%)20分钟37°C,然后用aggrecan孵化、I型和II型胶原抗体(Abcam 1: 100年,英国)60分钟。在PBS洗涤后,生物素化的二次抗体(Dako 1: 100年,丹麦)申请30分钟,在公安局洗,对待avidin-biotin复杂的试剂。色彩是使用3,3-diaminobenzidine试剂(Dako、丹麦),部分与哈里斯的苏木精复染色。平均光密度(AOD)五个随机选择的视觉领域(每片免疫组织化学)在高放大倍数下使用Image-J (400 x)测量分析系统。

2.9。免疫荧光染色

补液后,组织部分被山羊血清,采用透明质酸酶(0.8%)20分钟37°C,然后孵化N-CDH抗体,整合素β1抗体(Abcam 1: 100年,英国),和YAP-TAZ抗体(圣克鲁斯1:100年,美国)一夜之间在4°C。接下来,一个额外的清洗步骤后,部分被孵化的荧光二次抗体(1:1000;Proteintech,中国)在室温下2小时,受光。然后与DAPI染色的部分,并使用荧光显微镜成像(德国徕卡)。

2.10。组织蛋白提取和免疫印迹

在液氮后,组织细胞溶解与里帕裂解缓冲含有1% PMSF (Beyotime,中国)30分钟在4°C。然后,溶解产物离心机在12000 g×8分钟4°C。蛋白质样品受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转让electroblotting PVDF膜。乐队被孵化与主抗体(anti-N-CDH anti-integrin -β1 (1):1000;英国Abcam)、anti-YAP (1: 1000;圣克鲁斯,美国),anti-Caspase3 anti-GAPDH (1: 500;Proteintech,一夜之间中国)在4°C。乐队与TBST洗了三次后,他们二次抗体孵育80分钟在室温下。与TBST清洗三次,屁股的强度检测的图像实验室软件(美国Bio-Rad)。

2.11。统计分析

所有的数据进行了分析使用GraphPad棱镜(美国GraphPad软件6.0版本),和作为 与 。双尾学生的 - - - - - -测试是用来评估结果的统计学意义( )。

3所示。结果

3.1。静水压力对组织形态学和粘多糖合成的影响兔Notochordal NP和纤维软骨的内心的房颤

根据这项研究的设计,我们需要使用试管同时包含notochordal NP和纤维软骨的内心AF作为我们的研究对象。我们从12成熟兔子收获试管相同的年龄和性别,和五个兔子保持整个notochordal NP与许多不同大小的液泡。notochordal NP在成熟兔子的出现率及其组织总值和组织学形态是与先前的研究一致12,23]。接下来,试管组织团结地notochordal NP和纤维软骨的内在房颤被分成六个组,在室内培养,不同级别的静水压力对由我们自主研发的生物反应器(数字1(一)和1(b))。在离体培养30天之后,NP的组织学形态和内在房颤组织显示明显的多样性。作为显示在图1(d), notochordal NP出现作为一个充溢的岛屿由一个细胞液泡均匀嗜碱性的ECM复杂。内部AF表现出纤维软骨的形态,细胞小比notochordal NP组织,但更大的规模和更比外圆AF(图1(d))。此外,他的形态学染色结果表明,notochordal NP和内心AF细胞相对正常组组织≤1.0 MPa下静水压力(图1(d))。然而,当静水压力的等级提高到≥3 MPa, NP细胞的细胞质和内心AF变得萎缩,和染色ECM开始巧妙地减轻(图1(d))。阿尔新蓝染色强度可以反映的内容在软骨粘多糖或cartilage-like组织(24- - - - - -26]。作为显示在图1(e), NP和内在AF施加0.5 MPa静水压力阿尔新蓝染色强度最高。压力水平增加超过0.8 MPa时,染色强度是逐渐下降的压力加载(图1(e))。此外,定量的sGAG评估进一步证明了NP和内在AF 0.5 MPa下静水压力最高sGAG内容(数据1(f)和1(g))。当压力水平≥0.8 MPa, sGAG减少的内容逐渐在NP组织(图1(f))。然而,0.8 MPa静水压力不下降的内容sGAG与群组织施加0.5 MPa静水压力在内心AF(图1(g))。上述结果表明,给定生理静水压力有利于葡糖氨基葡聚糖合成notochordal NP和纤维软骨的内心房颤。然而,高震级静水压力明显减弱矩阵sGAG notochordal NP和合成纤维软骨的内心房颤。明显,细胞形态的多样性在NP组织更为明显,而粘多糖含量的多样性是更重要的在内心AF组织不同程度的静水压力。

3.2。静水压力对细胞生存的影响兔Notochordal NP和纤维软骨的内心的房颤

前整体形态分析的基础上,我们进一步检测细胞存活率notochordal NP和纤维软骨的内在AF组织通过荧光TUNEL染色。实验结果显示,≥0.8 MPa静水压力显著增加NP组织的细胞凋亡率(数字2(一个)和2 (b)),而内部AF细胞的凋亡率明显恶化时施加≥0.5 MPa静水压力(数据2 (c)和2 (d))。然而,TUNEL阳性率没有显著差异3.0 MPa和5.0 MPa组之间的NP和内部AF(数字2 (b)和2 (d)),这表明3.0 MPa是最终的静水压力水平的NP和内心AF细胞生存。

3.3。静水压力对兔的合成细胞外Aggrecan Notochordal NP和纤维软骨的内心的房颤

蛋白聚糖复杂,主要aggrecan,负责的亲水特性NP,能发挥机械的影响在NP细胞通过调节养分运输、水化、膨胀压力(1,27]。此外,内部AF代表一个过渡区和包含大量aggrecan受到压缩载荷转移从NP1,28]。因此,aggrecan含量是一个重要的指标来评估试管的退化程度。作为显示在图3NP和内在AF 0.5 MPa下静水压力最高的内容矩阵aggrecan。当压力水平达到≥0.8 MPa, aggrecan拒绝的内容逐渐上升的压力加载在NP组织(数字3(一个)和3 (b))。然而,0.8 MPa静水压力不下降的合成aggrecan相比,房颤组织内部的组织施加≤0.5 MPa静水压力(数据3 (c)和3 (d))。相比之下,aggrecan在内心AF的表达明显减弱时静水压力超过1.0 MPa(数据3 (c)和3 (d))。

3.4。静水压力对I型和II型胶原的合成兔Notochordal NP和纤维软骨的内心的房颤

除了蛋白聚糖的丰富内容,NP和内心房颤也包含随机组织胶原蛋白,主要是二型,形成原纤维是因为框架支撑结构(28]。然而,随着变性的发展,试管展览越来越多的纤维组织和韧带和肌腱相似的特征与大量的I型胶原原纤维(23,28]。因此,我们进一步发现胶原蛋白的表达水平通过包含IHC分析第一种和第二种。作为显示在图4,矩阵型胶原的表达增强,当静水压力达到≥0.8 MPa NP组织(数据4(一)和4 (b))。在内心的房颤,胶原蛋白的表达水平提高了I型≥1.0 MPa静水压力(数据4 (c)和4 (d))。相反,胶原蛋白II型的表达在NP增强了0.5 MPa静水压力但减毒≥0.8 MPa静水压力(数据5(一个)和5 (b)),而胶原蛋白II型的AF的表达增强了静水压力范围0.5 - -0.8 MPa但减毒的静水压力超过1.0 MPa(数字5 (c)和5 (d))。

3.5。的微分表达式N-CDH和整合素在兔子Notochordal NP和纤维软骨的内心的房颤

进一步找出可能的分子机制导致微分响应notochordal NP的静水压力和纤维软骨的内在房颤,我们发现N-CDH和整合素的表达β1,承认mechanosensitive试管细胞因子(29日]。双重荧光标签N-CDH(红色荧光)和整合素β1(绿色荧光)表示的表达在notochordal NP N-CDH远远高于内部AF(数字6(一)- - - - - -6 (c))。然而,整合素的表达β1内部房颤的相对高于notochordal NP(数据6(一),6 (c),6 (d))。

3.6。生理上的静水压力影响试管细胞生存和ECM内稳态通过YAP /小胡子途径

YAP及其paralogue PDZ-binding主题(小胡子)称为试管细胞生存被N-CDH相关的监管机构和integrin-mediated信息和cell-matrix附件30.]。所示的数字7(一)和7 (b)细胞核,细胞质YAP /小胡子的比例明显升高在1.0 MPa组相比0.5 MPa组。此外,西方墨迹图7 (c)和7 (e)揭示了微分notochordal NP蛋白表达的分级静水压力下,而西方墨迹图7 (d)和7 (f)揭示了在纤维软骨的蛋白质差异表达内心分级静水压力下房颤。所示的数字7 (c)和7 (e),N-CDH和整合素的表达β1在NP在0.5 MPa下静水压力升高但拒绝≥0.8 MPa下静水压力。狂吠的表达在细胞核和Caspase3也增强了≥0.8 MPa静水压力在NP(数字7 (c)和7 (e))。相应地,狂吠的表达在细胞质中由≥0.8 MPa静水压力衰减NP(数字7 (c)和7 (e))。这些墨迹图7 (d)和7 (f)显示的表达N-CDH在房颤拒绝≥0.8 MPa静水压力。整合素的表达β1在静水压力下房颤增强范围0.5 - -0.8 MPa下但拒绝≥1 MPa静水压力(数据7 (d)和7 (f))。狂吠的表达在细胞核和Caspase3增强≥1.0 MPa静水压力在房颤(数字7 (c)和7 (e))。相应地,狂吠的表达在细胞质被≥1.0 MPa静水压力衰减AF(数字7 (c)和7 (e))。

4所示。讨论

普遍的是重载的压缩力应用于试管是试管退化的原因之一31日,32),而适当的生理压力有利于维持细胞生存能力和ECM内稳态的试管1,2,10]。仍然有一些矛盾在先前的研究不同压力加载方法或强度的影响在试管的生物学行为。大多数认为NP和内心AF组织中的细胞主要受静水压力,因为当一个压缩力应用于试管中,NP和内心AF内静水压力增加(9,27]。因此,在目前的研究中,我们使用了自主研发的静水压力生物反应器基于pressure-transmitting模式通过轻微变形的柔性膜在一个完全密封的不锈钢室,模仿体内微环境对NP和内心AF组织。和组织的反应分级静水压力通过组织学和细胞学的观察分析。我们的研究结果表明,给定生理静水压力(0.5 MPa)是有利于细胞生存和ECM内稳态notochordal NP和纤维软骨的内在AF组织,而高震级动态静水压力(≥1.0 MPa)加重细胞凋亡和崩溃的ECM notochordal NP和纤维软骨的内心房颤。但是,仍有一些多样性敏感性notochordal NP之间的静水压力和纤维软骨的内心房颤。具体来说,细胞凋亡率显著增加NP组织遭受≥0.8 MPa静水压力。相比之下,内心AF组织中的细胞凋亡明显增加了≥1.0 MPa静水压力。此外,sGAG的表达、aggrecan和II型胶原蛋白与细胞凋亡率的趋势是一致的在notochordal NP和纤维软骨的内心房颤。此外,我们发现N-CDH和整合素的表达β1,两个承认mechanosensitive因素调节的表型和功能NP细胞以及房颤。我们发现N-CDH在NP表示更加突出,同时整合素β1表示对房颤更加突出。我们的结果也表明了,YAP /小胡子本地化主要转移到核通过Hippo-YAP /小胡子,引发细胞凋亡通路,当细胞受到高震级静水压力(0.8 MPa NP;1.0 MPa AF)。这些结果表明,notochordal NP细胞更为敏感与纤维软骨的内部压力的变化比较AF细胞。潜在的分子机制与mechanosensitive因素的微分表达式和Hippo-YAP / TAZ-associated细胞死亡。

N-CDH notochord-associated基因也被视为一个NP-specific生物标志物(33]。Embryonically, NP源于脊索,房颤来自间质(1,34]。因此,在notochordal NP N-CDH更突出的表达。然而,notochordal来历不明的细胞被位于取代人类骨骼成熟之前(1,2,5,34]。一些研究声称,缺乏静水压力或超负荷的压力可能诱发的消失notochordal NP细胞组织(15- - - - - -17]。生理压力大小在试管组织估计大约0.1到0.5 MPa在给定条件下,价值高达1.0到3.0 MPa在极端荷载条件下(35]。我们的研究进一步证实,中度载荷的静水压力(0.8 - -1.0 MPa)甚至可能引起的变性notochordal NP通过衰减N-CDH的表达,加剧细胞死亡和ECM的分解代谢,尤其是aggrecan和II型胶原原纤维。Notochordal细胞被报道有很高的蛋白多糖的生产潜力和抑制细胞凋亡通过分泌一些功能性因素(14,34,36]。这就是为什么notochordal NP开始消失的时间正好与形态的发生椎间盘退化的迹象(34,36]。因此,与抗压荷载的积累在人类的脊椎,notochordal NP的退化是不可阻挡的。

然而,我们也观察到内部AF表现出相对较高的整合素的表达β1和更大的宽容的生理介质加载程度的静水压力。详细,位于细胞的形态学和ECM内稳态的内在AF中等载荷作用下的静水压力(0.8 - -1.0 MPa)显示无明显差异比较与那些在大气压力下培养。然而,当压力水平增加到高震级度(> 1.0 MPa),细胞死亡率提高,ECM内稳态的破坏是触发。细胞的表型特征在成熟的人类NP显示圆形,位于形态、和分泌基质大分子,这更像内房颤的典型表型细胞nonerect行走动物,比如兔子、狗(37]。作为人类的脊椎受到轴向压缩载荷调整的程度和频率比nonerect行走动物,人类的细胞类型试管应该更宽容的压应力(6]。一项研究表明,N-CDH和integrin-mediated胶粘剂互动调制YAP-TAZ mechanosensing和细胞命运的承诺(19]。明显,N-CDH主要介导软信息mechanosensing信号,而integrin-mediated硬cell-ECM mechanosensing信号(19]。我们的研究验证,软骨细胞生存能力和ECM生产能力的内在房颤是优于notochordal NP中等或高载荷作用下静水压力的程度。可能的分子机制与整合蛋白的高表达和减毒YAP / TAZ-associated细胞死亡。尽管过渡从notochordal NP软骨被视为一个形态学试管退化的迹象,维护正常的软骨表型和矩阵生产函数是人类试管再生策略更有意义的探索。

虽然有一些新奇的发现在目前的研究中,也存在一些局限性。首先,本研究的组织样本是在常氧条件下培养,因为缺乏hypoxia-culture设置在我们的生物反应器。这个条件不同于生理缺氧条件的NP和内在AF细胞活1]。我们的团队一直致力于更新设备的生物反应器,并试图模仿更仿生微环境的体外试管组织文化。其次,压力设定精度相对粗糙的试管组织,因为这一代的静水压力生物反应器设计模仿体内的所有肌肉骨骼连接条件,如半月板和关节软骨。因此,加载设备旨在施加高震级压力( MPa)室,有限精度调节生物反应器的功能。我们一直致力于开发低压装载设备更精确的压力设定系统NP文化,并试图找出一种更精确的数据静水压力的影响在NP生物行为在将来的研究中。

最后,我们的研究表明,给定生理静水压力有利于细胞生存和ECM内稳态notochordal NP和纤维软骨的内心房颤。其可能的机制是调节保护mechanosensing相关因素(N-CDH和整合素β在给定静水压力下(图1)8),而高震级静水压力加剧ECM内稳态的破坏NP和内心AF通过下调N-CDH和整合素β1,减毒的抑制作用YAP / TAZ-mediated细胞凋亡和ECM分解代谢。此外,内心的AF展品更重要的整合素的表达β1和宽容的中度载荷比notochordal NP的生理上的静水压力。这项研究可能会提供一个更好的理解发挥监管作用的静水压力对细胞生存和矩阵代谢的试管和更实质性的证据使用静水压力在探索生物反应器椎间盘退变机制以及再生策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有竞争的经济利益。

确认

我们真诚感谢洁具华博士Erji高博士,博士Xintong赵,郑博士Ci,王涛博士徐魏博士和小弟Wu博士来自中国国家组织工程中心的慷慨的技术援助。这项工作是由国家重点支持的R & D项目中国(2018号yfc1105803);中国自然科学基金(81772378号,81974346号);重庆,中国的自然科学基金(没有。cstc2020jcyj-msxmX0148);基础研究和前沿探索项目的渝中区,重庆,中国(20200121);项目的创新科学研究重庆市教育委员会的研究生,重庆,中国(CYB20168 CYS20226);的基础研究孵化项目重庆医科大学第三附属医院,重庆,中国(没有。KY20077)。