人类脂肪基质细胞单细胞转录组分析,识别一个收缩的细胞亚群

文摘

潜在的人类脂肪基质细胞(hASCs)被用作治疗正在评估产品在多个临床试验。然而,仍有许多他们之前了解这些细胞可以用于临床的信心。hASCs固有的特性不是很清楚他们的异质性。本探索性研究的目的是描述非均质性的新孤立hASCs经过两个人口倍增(P2)使用单细胞转录组分析。至少两个亚种群在P2被确定。一个主要族群被确认为收缩细胞,基因表达模式的基础上,可能和/或周围的周血管平滑肌细胞(vSMCs)。

1。介绍

人类脂肪基质细胞(hASCs)获得了越来越多的关注作为一个潜在的细胞疗法的产品。hASCs被归类为多功能、呈、塑料贴壁细胞在体外可以很容易地扩展到脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞1,2]。hASCs的一个明显的优势是一个相对大量的细胞可以从脂肪组织中提取小施主能级发病率(2,3]。这引发了全球增长的一个新的研究领域和行业。

众所周知,从脂肪组织细胞分数孤立(间质血管分数;SVF)和合成hASCs生长在文化异构(1,2,4]。它也建立了异质细胞群的扩张会导致克隆选择和多样性的丧失5- - - - - -7]。然而目前尚不清楚是否SVF的异质性,或损失在扩张,导致或妨碍hASCs的潜在治疗用途。大量的努力因此被更好地理解的异构特性孤立的细胞群。

转录组分析可以全面了解分子机制,导致功能变化和异质性的细胞数量。描述基于蛋白质编码的细胞核糖核酸(RNA),将转化为功能性蛋白质允许研究人员观察转录组的前体蛋白质组。直到最近,大多数转录组工作已经进行池平均人口的细胞提供整个细胞类型的基因表达水平呈现(8]。这面具基因表达模式的独特性和异质性在单个细胞,导致细胞丰富的被研究为主,而罕见的细胞群仍差特征(9]。单细胞RNA序列(scRNA-Seq)技术构成一个强大的工具来量化intrapopulation异质性通过研究单个细胞的基因表达模式(10,11]。迄今为止,scRNA-Seq已被用来分析各种异质细胞群和复杂的组织,例如骨骨髓来源间充质基质细胞(BM-MSCs) [12和造血细胞谱系13]。

各种研究以前的异质性进行了探讨人类和小鼠对asc在单细胞水平上;然而,大多数这些研究集中在SVF [14- - - - - -16]。对于特定的临床应用,异构hASC人口也可能需要增加体外获得临床相关的细胞数量。我们因此作出一个探索性研究在新鲜分离细胞的异质性特征,培养hASCs P2,使用scRNA-Seq分析。

2。材料和方法

2.1。组织收集

批准本研究从研究伦理委员会获得大学健康科学学院,比勒陀利亚大学(参考号:241/2015)。脂肪组织是来自健康的捐赠者做抽脂手术,曾给予书面知情同意。每个捐赠者被分配一个独特的参考号码,以确保匿名性。所有捐赠信息是保密的。

2.2。脂肪基质细胞的隔离和维护

脂肪组织是加工使用科尔曼的适应方法发表的其他地方(17]。结果SVF resuspended完全生长培养基(CGM)组成的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM), 10%的胎牛血清(的边后卫),和1%的青霉素和链霉素(p / s)。细胞数和在CGM播种密度每厘米5000个细胞²在25岁或75厘米²培养瓶。三个hASC文化(A20、25和A10)被孤立和维持在37°C, 5%的公司₂在CGM。文化是体外扩大两轮(P2)。细胞分离[使用3毫升0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸(EDTA) 7分钟37°C)当他们到达融合和受移植者密度5000细胞/厘米²。

2.3。Immunophenotyping人类脂肪基质细胞

流仪分析是用来确定immunophenotype之前每个实验的开始。六色抗体面板设计内部基于对asc的出版标准(1,18]。下面的抗体被包含在面板:CD34-PE-Cy7(克隆581;美国贝克曼库尔特,迈阿密)、CD36-APC(克隆5 - 271;美国加利佛尼亚Biolegend)、CD44-APC-Cy7(克隆IM7;美国加利佛尼亚Biolegend), CD45-Brilliant紫™(BV) 510(克隆HI30;BD生物科学,新泽西,美国),CD90-BV421(克隆5 e10汽油;BD生物科学,新泽西,美国),CD105-PE(克隆43 a3;美国贝克曼库尔特,迈阿密)。

抗体被添加到 从每个细胞悬液细胞(5μL每个抗体),放置在一个流式细胞术在室温下管(FCT)和孵化(RT)在黑暗中20分钟。第二个FCT包含 无污点的细胞制备负控制和被用来设置消极/积极的界限。潜伏期后,1毫升磷酸缓冲盐(PBS)含2% p / s添加到整除。样品在300 g离心5分钟,以及由此产生的上层清液被移除。样本表型特征使用迦流流式细胞分析仪(图S1和表S1;美国贝克曼库尔特,迈阿密)。总共有18 000 - 18 500个事件获得每个样本和分析使用Kaluza流式细胞仪分析软件(版本2.1;美国贝克曼库尔特,迈阿密)。单色FCTs(即。,cells stained with only one monoclonal antibody per tube) were used to calculate the color compensation matrix in order to correct for spectral spill over into other detector channels.

2.4。人类脂肪基质细胞的分类

排序是为了确保只有单一的、可行的 直径,即。,that were not too big for the microfluidic channels of the C1™ Single-Cell Auto Prep Array Integrated Fluidics Circuit (IFC) plates (Fluidigm, California, USA) were selected for analysis. hASC markers, CD90, and CD44 were included in the sort criteria to ensure inclusion of most hASC subpopulations at P2. CD45, a common leukocyte marker, was included to ensure that hematopoietic cells were excluded from the sort.

样品在300 g离心5分钟在RT,上层清液被删除,5μL一起每个抗体的可行性标记(Propidium碘;π)添加到样本。生存能力介于100%至96之间。样品在RT孵化20分钟,免受光。潜伏期后,样品是用1毫升PBS含有2% p / s。样品在300 g离心5分钟在RT,和上层的移除。样品在1毫升CGM resuspended排序使用FACSAria™融合细胞分选仪(美国新泽西州BD生物科学)。

一种顺序控制策略用于hASCs(见图S2)。一面向前散射(SS)和散射(FS)两个参数点阴谋被用来排除碎片。大细胞FS信号也被排除由于较强的风险可能阻塞的微流控通道IFC板(图S2 (a))。党卫军区域与SS宽度点阴谋被用来排除总量(图S2 (b)),确保单个细胞分类。可行的细胞包括基于-π染色(图S2 (c))。细胞为阴性CD45和CD44阳性CD90包含在标准(图S2 (d) - (e))。控制策略背后的目的从而确保只有单一的、可行的,CD90⁺,CD44⁺、CD45^{- - - - - -}细胞被选择和排序。

执行这类使用中性密度滤光片2和喷嘴大小为130μm。纯度被设置在“纯洁。“细胞(300 000)分为preprepared排序包含2毫升CGM管。排序后,样本离心机,上层清液被移除。500年的细胞被resuspended排序μL PBS ( )。

2.5。单细胞捕获、裂解、逆转录和放大

Fluidigm C1™单细胞汽车准备系统(美国加州Fluidigm)与国际金融板块(17到25岁μ米大小)被用来捕获单个细胞。聪明的Clontech®®技术(美国豆类生物有限公司)是用于裂解、反转录,并放大的互补DNA(互补),按照制造商的说明。

2.6。图书馆准备和测序

图书馆准备和测序完成的北京基因组研究所(BGI),大埔,香港,中国。

2.7。针对管道

scRNA-Seq数据的分析是使用RNA-Seq协议BCBIO, bioinformatic-specific管道设计的自动化,高通量测序分析(https://github.com/chapmanb/bcbio-nextgen)。数据质量是决定使用FASTQC程序,人类参考基因组的样本对齐(GRCh38)使用HISAT2(分层索引拼接对齐的成绩单)19]。基因进行量化使用featureCounts [20.]。

2.8。单细胞的质量控制处理数据

质量控制指标应用于识别和消除质量差样本下游分析。一个可以在MultiQC报告http://wiki.bi.up.ac.za/scasc/multiqc被用来评估数据的质量(phr分数),读取每个样本的数量和比例调整人类的参考基因组(GRCh38)。细胞与 ,阅读的深度≤100 000,对齐或< 70%人类基因组参考从下游分析。基因不表达的三个或三个以上细胞从进一步分析。细胞表达< 200基因也被删除。细胞表达≥10 000个基因被认为是artifactual,也被删除。做进一步的数据分析(3.5.2)版(21)和RStudio(1.0.153版)使用修包(2.3.3版本)[22]。

高水平的线粒体基因表达通常是细胞的指标压力(23];因此,样品含有线粒体基因被排除在下游分析> 10%。线粒体基因也退化的单细胞基因表达数据由于微分可能干扰分析。各种线粒体假基因(MTND1P23,MTND2P28,MTCO1P12,MTCO2P12,MTATP8P1,MTATP6P1,MTCO3P12,MTCYBP45)高度表达,使初步结果,因此从下游分析。

细胞周期基因也倒退的一个数据集,以防止干扰下游基因表达差异分析(24]。

样本归一化采用全球范围内标准化(lognormalize)。这个函数实现基因表达规范化测量每个细胞总表达和繁殖通过比例因子(000)。

2.9。批处理效应校正利用典型相关分析

初始聚类的细胞使用修包导致集群基于生物复制(图S3),一大部分原因要归咎于生物和技术变化。计算策略引入了巴特勒et al .(2018)称为典型相关分析(CCA)被用来纠正这22]。热图(图S4)和一个biweight midcorrelation (bicor)饱和度图(图S5)被用来确定最显著的典型相关向量(CCs)使下游的三个生物复制的分析。生物复制(A20、25和A10)对齐使用分散在所有三个最高的1000个基因数据集,和六个CCs被用于下游集群。

2.10。 - - - - - -新力聚类分析

集群transcriptomically相似的细胞被发现使用共享的最近邻(SNN)模块化文中针对聚类算法(25),与非线性降维( - - - - - -分布式随机邻居嵌入; - - - - - -SNE)被用来想象可能的集群。分辨率参数的数量从0.5到1.2。(度)特定于每个集群的差异表达基因被确定使用FindAllMarkers函数。

2.11。统计分析

为每个集群被确定基于度 。使用非参数统计显著性测试Wilcoxon等级与Bonferroni调整和测试。一个调整的价值α≤0.01被认为是显著的。

3所示。结果

至少两个,最多五个集群被确定在hASCs P2。而识别集群,可以改变集群解决方案。增加分辨率通常会导致增加集群的数量确定。确定了两个集群(图0.5决议1(一)),而三个集群被确定在决议(图0.6和0.71 (c))。四个集群标识(图0.8决议1 (e)0.9到1.2),决议一致确定五星团(图1 (g))。度被确定为每个集群数量排列(2至5集群)。基因识别和报告是基于一个积极的 ,与一个值≤0.01。然而,只有基因调整≤0.01被认为是进一步分析的价值。数据1 (b),1 (d),1 (f),1 (h)显示的热图说明每个集群的集群度排列确定(分别为2、3、4和5的集群)。显著度的列表( )可以在表吗S2。

集群1保持稳定决议0.6到1.2。统计上显著的列表( )度也保持相似集群在不同集群数量排列(表1)。在这些基因中,两人始终以积极识别 所有不同的集群数量排列,即ACTA2和COL11A1。COL11A1proalpha1代码(XI)链习类型的胶原蛋白(26]。ACTA2编码平滑肌alpha-actin蛋白质和是一个最好的已知分子标记等收缩细胞血管平滑肌细胞(vSMCs)和周27- - - - - -30.]。的 - - - - - -新力绘制在图2显示的表达模式ACTA2和COL11A1在单hASCs和清楚地表明,这些基因主要表达在细胞集群1。进一步调查后,其他集群内确定的显著度是1,也为蛋白质编码参与收缩的细胞结构和功能。这些基因的列表,它们编码的蛋白质和它们各自的功能,如表所示1。

Kumar et al。(2017)使用散装RNA-Seq技术研究的周和vSMCs分化从mesenchymangioblasts来源于人为多能干细胞(万能)28]。他们的研究结果表明,vSMCs和周分享的表达ACTA2,TAGLN,TPM2,MYLK,而MYL12A,CALD1,COL11A1,SYNPO2只有确定vSMCs [28]。根据显著度(表的列表1),它是假设集群1是由包括周和/或vSMCs收缩细胞。

集群2保持稳定在低分辨率(0.5 - 0.7),但分辨率增加到0.8时变得支离破碎。在更高的分辨率确定额外的集群(集群4和5)显示很少度和重叠度2集群在较低分辨率。基于这些观察,集群4和5不能最终确定为独立的亚种群在这个数据集。

尽管集群3保持稳定的集群数量排列(分辨率0.6到1.2),只有三度被确定统计学意义( )在这个集群:MMP16,SFRP2,SOX4。缺乏显著度这个集群不允许明显识别的细胞和/或它们的功能在这个集群。

4所示。讨论

hASCs显示伟大的承诺作为一个潜在的细胞治疗产品的疾病,并正在努力更好地理解的异构特性孤立的细胞群。单细胞转录组技术是强大的工具为研究细胞的异质性。很少单细胞研究hASCs发表迄今为止,和绝大多数集中在SVF。然而很少有共识的亚种群数量出现在为每个分组人口SVF或特定的标记。这主要是由于不同的目标和方法采用每个研究小组。雷纳尔特et al。(2016)研究了96个基因使用单个细胞的人类SVF和识别五个亚种群14]。哈迪et al .(2017)也使用单细胞技术研究两个亚种群在SVF,叫外膜基质细胞和周,基于以下表型标记:CD31、CD45、CD146, CD34 (15]。周有一个不同于外膜基质细胞转录组签名。每个族群可进一步分为乙醛脱氢酶(ALDH)明亮和ALDH-dim人口(15]。也报道称,至少六个基因可以用来区分的周和外膜基质细胞(15]。

克隆扩张主要文化等对asc一直很好的记录(5- - - - - -7,36]。在一个优雅的研究由Selich et al。(2016)在msc来源于脐带,结果表明,多样性的第一次严重的亏损在原代细胞培养中观察到的前三个段落(5]。第二克隆多样性下降可以观察到在进一步扩大特定克隆成为占主导地位的5]。

的细胞转录组异质性hASCs体外培养尚未全面调查在单细胞水平。在我们的研究中,其目的是描述非均质性的新孤立hASCs经历了两个人口倍增(P2;之前严重丧失多样性)。本研究的目标是(一个)来确定亚种群的数量目前在hASCs P2通过聚类和(b)为每个集群识别显著度。

hASCs来自三个女性捐赠者。hASCs的百分比表达表型标记在P2在92%至88之间。能够很好的证明,分化和增殖的潜力hASC年长女性的减少;然而,hASC表面标记表达式仍然完好无损37,38]。

聚类是在不同的集群的决议。hASCs来自三个不同的捐赠者,在扩张有克隆选择的可能性。然而,scRNA-Seq分析322个细胞显示有限的异质性只有两到五个亚种群出席P2。两个集群保持一致决议0.6到1.2,即集群1和3。尽管集群3一直确认中,很少有统计上显著( )这个集群度可以被识别。相比之下,统计上显著的列表( )度(尤其是ACTA2,COL11A1,SYNPO2,TAGLN,CALD1,MYLK,MYL12A,TPM2)确定集群1表明这个族群由收缩细胞周和/或vSMCs等。

周和vSMCs统称为血管周的细胞。他们的主要功能是支持和稳定血管网络和调节血流量(4,39]。vSMCs形成动脉和静脉的媒体不同的复杂性和大血管的动脉外膜还发现,虽然周围小血管周围的周如毛细血管和postcapillary小静脉(27,39,40]。两种类型的细胞被认为是存在于孤立的SVF脂肪组织(1,2,4]。单细胞研究哈代et al .(2017)确定的周(根据分类标准)有一个独特的转录组签名可以区分从其他SVF使用至少6个不同的分子标记。这些标记之一ACTA2(15),这是一个集群的主要分子标记鉴定1。此外,Baryawno et al。(2019)做了一个全面的对小鼠BM-MSCs单细胞研究。他们发现了一个占主导地位的族群表达ACTA2他们分为周(12]。ACTA2似乎不过是表达的周和vSMCs [30.,31日]。在最近的一项研究中,Kumar et al。(2017)研究了周和从mesenchymangioblasts vSMCs分化28]。转录组的数据,研究表明vSMCs和周分享的表达ACTA2,TAGLN,TPM2,MYLK和MYL12A,而CALD1,COL11A1,SYNPO2只有确定vSMCs [28]。因此假设集群1细胞和/或vSMCs周围的周。

我们承认,转录组只是翻译的前体蛋白,因此,孤立地分析有一定的局限性对功能的相关性。因此它应该有用的确认和区分不同的收缩细胞;然而,目前没有一个标记,可用于区分vSMCs和周39,41),因此使用标记数组。许多membrane-specific标记已确定为对包括CD146、neuron-glial抗原2(喜欢的《忍者外传2》),核糖体蛋白S14系列(3 g5) (27,28]。vSMCs通常是通过免疫组织化学鉴定使用蛋白质,如myocardin transgelin,肌凝蛋白重链11 [28,30.]。识别membrane-specific蛋白质将允许孤立的细胞流式细胞仪的特定集群。特别感兴趣的是集群内的周1的存在与否。周已经被多个研究小组报道潜在祖细胞分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、细胞(4,42- - - - - -46),有能力共享hASCs [1,47]。如果集群1可以脱离其他hASC人口,这将是是否感兴趣的分化能力通常观察到hASCs可以归因于周,至今未被发现的祖/干细胞群,或两者兼而有之。虚拟收缩分组人口构成了31%的322年hASCs就读于P2。这将是重要的决定在多大程度上的分化能力的周有助于整体分化潜力的更广泛的异构hASC的细胞群。胶原凝胶收缩化验可能有助于进一步证实这些细胞的功能。

MSC种群表现出相当大的捐助者之间的异质性和个人捐赠数量,调节自我更新的机制与血统规范在很大程度上仍未知。这就产生了重大障碍在努力旨在研究和开发临床生产协议产品生产标准化MSC治疗(48]。的功能变异和异质性msc来自各种来源据称是不一致的主要原因和有争议的结果在临床试验中观察到的48,49]。单细胞测序技术是强大的工具,可以用于探索细胞群中的异质性。传统测序方法分析人口集中的面具的异质性差可见小的亚种群。单细胞RNA-Seq允许识别和转录组的大型和小型亚种群可能导致特定标记的发现与治疗相关的应用程序。理解的机制,规范的命运规范可能导致的扩张非常特殊的血统具有独特的生物学特性,适用于特定的治疗需求。

隔离和扩张的标准化方法MSC产品的质量控制的一个关键因素。我们认识到,使用在我们的实验是一个混杂因素的边后卫。这些结果形成初步研究的一部分在我们的小组探索hASCs培养体外转录组异质性。我们意识到这些实验需要重复使用良好生产规范(GMP)条件更好的临床翻译。

本研究的另一个限制是,C1™IFC盘子只能捕获细胞的特定尺寸范围(17到25岁μ米)。这将导致细胞的noncapture这个尺寸范围之外。这将创建一个偏见的hASCs被俘,这通常相当异质细胞大小。未来实验应该使用一个系统,允许捕获所有细胞的大小。

5。结论

总之,这个探索性研究的异质性特征hASCs P2利用转录组分析在单细胞水平。我们的研究结果揭示的存在至少两个亚种群的细胞。其中一个亚种群被认为是收缩的细胞,包括周和/或vSMCs。

数据可用性

单细胞RNA-Seq数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

确认

我们要感谢夏尔曼Steyn说(私人执业,比勒陀利亚,南非)lipoaspirate样本和Marie-Luce Bochaton-Piallat(病理学和免疫学,日内瓦大学)对她的建议。这项工作是由南非医学研究理事会支持旗舰奖[SAMRC - rfa ufsp - 01 - 2013 /干细胞)和SAMRC单位以外的单位为干细胞研究和治疗,以及细胞和分子医学研究所比勒陀利亚大学的。

补充材料

作为一个单独的文件,包括以下数据和表:图S1:代表点阴谋说明顺序控制策略用于研究结合hASCs immunophenotypic的状况。hASC人口的利益是可视化的FS和SS日志两个参数点阴谋。包括(a)单身hASCs和碎片被控制在完整细胞排除在外。在hASCs大门被标注在两个参数点阴谋,允许同时分析两个表面标记物的表达。(b) hASCs发现CD44阳性和CD90 + +(象限)。(c) CD105积极和CD45负(象限B - +)。最后的情节代表(d) CD44⁺/ CD90⁺/ CD105⁺/ CD45^{- - - - - -}hASCs CD36和CD34染色。这个数字是相关的材料和方法部分。也见表S2。图S2:一个例子的hASCs的排序顺序控制策略。(a) SS和FS两个参数点阴谋被用来识别hASCs(地区)和排除碎片(地区)。(b)党卫军面积与SS宽度点阴谋,封闭的,用于排除小细胞碎片,确保只有单个细胞(b区)都包含在下游地区进行排序。(c)π与统计直方图,封闭在B,被用来选择可行的细胞(地区c)。选择的ASC人口在接下来的两块进一步细化。首先,CD44 APC-Cy7 / CD45 KO情节上封闭的可行的细胞被使用。(d)只有细胞CD44阳性和阴性CD45被选中。最后选择排序是基于(e)阳性染色的CD44和CD90也使用CD44 APC-Cy7与CD90 PE-Cy5阴谋。背后的逻辑顺序控制策略是确保只有单一的、可行的,CD90⁺,CD44⁺、CD45^{- - - - - -}细胞被选择和排序。这个数字是相关的材料和方法部分。图S3: - - - - - -新力情节说明批效果观察在最初的单细胞分析使用修包。不同颜色的点云表示单个的细胞。在初步聚类,发现这些细胞被聚类根据原来的身份,他指的是他们最初是孤立的细胞培养。这个数字是相关的材料和方法部分。图S4:热图说明前20度第一12个CCs。热图显示前20度(行)确定每个单元(列)在每一个CC,黄色代表基因与积极的分数(高表达基因),紫色代表负分数(低水平表达的基因)。度可以可视化(黄色和紫色块)9 CCs。从10 CCs向前,没有独特的图案可能是杰出的。这表明CCs 1到9可以用于下游分析。这个数字是相关的材料和方法部分。 Figure S5: biweight midcorrelation (bicor) saturation plot illustrating the smoothed shared correlation strength versus CCs between the different datasets. The plot measured the correlation strength for 15 CCs of the different datasets. Each colored line on the graph represents the Seurat object of the individual datasets, named according to the cell culture from which the cells originate. The graph shows a saturation point (where the curve in the graph starts to flatten) at 6 CCs. The first 6 CCs were used for downstream analyses. This figure is relevant to the Materials and Methods section. Table S1. List of statistically significant ( )度确定在不同的集群数量排列。这个表是相关的人物1,图2和表1。表S2: hASCs百分比(P2)的三个文化期间使用的单细胞实验坚持表型:CD44⁺/ CD90⁺/ CD105⁺/ CD45^{- - - - - -}/ CD34^{- - - - - -}/ CD36⁺。所有文化坚持表型标准设定的国际联盟脂肪治疗和科学(IFATS)和国际社会的细胞治疗(ISCT)。这个表是相关的材料和方法部分,和图S1。(补充材料)

引用

1. p . Bourin b·a·邦内尔l . Casteilla et al .,“从脂肪基质细胞tissue-derived基质血管分数和文化扩张脂肪tissue-derived基质/干细胞:国际联合会的一份联合声明中脂肪治疗和科学(IFATS)和细胞疗法(ISCT)的国际社会,“Cytotherapy,15卷,不。6,641 - 648年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. p·拉博拉和a . s . Majumdar脂肪tissue-derived基质血管再生医学部分:简要回顾在生物学和翻译,“干细胞研究与治疗,8卷,不。1,第155 - 145页,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w·哈桑,售后,和w·王,“脂肪干细胞在伤口愈合中的作用。”伤口修复和再生,22卷,不。3、313 - 325年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. n . Guimaraes-Camboa p均y太阳et al .,“多个器官不像周围的周间充质干细胞体内,”细胞干细胞,20卷,不。3、345 - 359页。e5, 2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Selich j . Daudert Hass r . et al .,“大规模克隆选择和瞬变期间造成克隆扩张的间充质干细胞培养了慢病毒RGB-barcode技术,”干细胞转化医学,5卷,不。5,591 - 601年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. p . Bogdan, b . m . Deasy b . Gharaibeh t苦于和r .虽然玛卡里斯库”干细胞动态异构结构:统计模型和定量预测,“科学报告4卷,第4837 - 4826页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. n . y . Liu穆尼奥斯,b·a·邦内尔·t·m·洛根和t·马”密度制约的代谢异质性在人类间充质干细胞,”干细胞,33卷,不。11日,第3381 - 3368页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. A.-E。Saliba a·j·s . a . Gorski和j·沃格尔,“单细胞RNA-seq:进展和未来的挑战,”核酸的研究,42卷,不。14日,第8860 - 8845页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. a . a . Kolodziejczyk j·k·金,诉Svensson j . c . Marioni和s . a .摄影师“单细胞的生物技术和RNA序列。”分子细胞,卷。58岁的没有。4、610 - 620年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 刘和c·杰尔“单细胞转录组测序:最新进展和剩余的挑战,”F1000Res5卷,第191 - 182页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. d . w . Wang高,x,“RNA单细胞测序裂纹细胞的神秘吗?”细胞生物学和毒理学,34卷,不。1、1 - 6,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. n . Baryawno d . Przybylski m . s . Kowalczyk et al .,“细胞分类法体内平衡和白血病,骨髓基质的”细胞,卷177,不。7,1915 - 1932页。e16天2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. f .你们、w·黄和g .郭”使用单细胞技术研究造血作用。”血液学和肿瘤学杂志》上,10卷,不。1,p。27日,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r·c·雷纳尔特·m·Januszyk m·索金et al .,“微流控单细胞转录分析合理确定小说表面标记资料来增强细胞疗法,”自然通讯,7卷,不。1,第11954 - 11945页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. w·r·哈迪n . i摩尔多瓦l .摩尔多瓦et al .,“单一血管周的细胞中转录网络排序从人脂肪组织的层次结构间充质干细胞,”干细胞,35卷,不。5,1273 - 1289年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p c . Schwalie h .咚,m . Zachara et al .,“人口基质细胞,抑制脂肪形成的哺乳动物脂肪仓库,”自然,卷559,不。7712年,第108 - 103页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f·a·范Vollenstee d·霍夫曼,m . s .胡椒,“收获和收集的脂肪组织脂肪基质干细胞/隔离,”干细胞在临床的应用220年,页199 -施普林格国际出版,瑞士,2016。视图:谷歌学术搜索
18. 公元Donnenberg e·m·迈耶,j·p·鲁宾和v . s . Donnenberg”培养的细胞表面蛋白质组脂肪基质细胞,”血细胞计数。部分,卷87,不。7,665 - 674年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. b . d . Kim Langmead, s . l .扎尔茨贝格”HISAT:快速拼接对准器较低的内存需求,”自然方法,12卷,不。4、357 - 360年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. y辽、g·k·史密斯和w·史”featureCounts:一个有效的通用程序分配顺序读取基因特性,”生物信息学,30卷,不。7,923 - 930年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. w·n·维纳布尔斯d·m·史密斯和R发展核心团队,“介绍R,”2017年,https://cran.r-project.org/manuals.html。视图:谷歌学术搜索
22. a·巴特勒·霍夫曼p . Smibert e . Papalexi和r . Satija”集成单细胞转录组数据在不同的条件下,技术,和物种,”自然生物技术,36卷,不。5,411 - 420年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 答:a . AlJanahi m . Danielsen和c·e·邓巴”介绍单细胞RNA-sequencing数据的分析,“分子治疗方法和临床的发展,10卷,第196 - 189页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. f·比特纳,k . n . Natarajan f·p·萨莱et al .,“计算细胞间异质性在单细胞RNA -测序数据的分析揭示了隐藏的亚种群的细胞,”自然生物技术,33卷,不。2、155 - 160年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. l . Waltman和n . j . van Eck”智能当地移动大规模modularity-based社区检测算法,”欧洲物理期刊B,卷86,不。11,471年,页2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. L.-F。甜美,l . z Toh s w·l·楚手指、j·l·l . Chua和t . t . Wong“Upregulation截然不同的对象瘢痕组织中胶原蛋白记录:结膜纤维化的研究”疾病模型与机制,10卷,不。6,751 - 760年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. e·阿沃利奥正诉诉Alvino m . t . Ghorbel和p . Campagnolo“血管周的细胞和组织工程:当前应用程序和未开发的潜力,”药理学和治疗卷,171年,第92 - 83页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. a·库马尔s D’索萨o . v . Moskvin et al .,“规范和多元化和平滑肌细胞周围的周mesenchymoangioblasts,”细胞的报道,19卷,不。9日,第1916 - 1902页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. a . Mezheyeuski m·b·林德t . k . Guren et al .,“Survival-associated marker-defined血管周围细胞的异质性在结直肠癌,”Oncotarget,7卷,不。27日,41948 - 41958年,2106页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. l . Bacakova m . Travnickova大肠Filova et al .,”的作用的血管平滑肌细胞生理学和病理生理学的血管,”肌肉细胞和Tissue-Current研究领域的地位InTech,页229 - 257年的哲理,2018。视图:谷歌学术搜索
31. j . a .喜气洋洋的p .他k . Kottke-Marchant和r·e·马尔尚“收缩平滑肌细胞表型的分子调控:对血管组织工程,“组织工程。B部分、评论,16卷,不。5,467 - 491年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 问:江、黄r . s . Cai和C.-L。a .王”Caldesmon调节血管平滑肌细胞的活性调节肌动蛋白细胞骨架稳定性,”生物医学科学杂志,17卷,不。1,p。2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. d·劳森,m·哈里森,c . Shapland”纤维母细胞transgelin和平滑肌SM22alpha是相同的蛋白质,是抑制在许多细胞系的表达,“细胞活性和细胞骨架,38卷,不。3、250 - 257年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. h·杨,l·张,s m . Weakley·h·林问:姚明,和c·陈,“转变增长因子增加血管平滑肌细胞标记物的表达在人类multi-lineage祖细胞,”医学科学监控,17卷,不。3,BR55-BR61, 2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 公园,汉族,美国金et al .,“肌凝蛋白监管轻链需要保持稳定的肌球蛋白II和细胞完整性,”生物化学杂志,卷434,不。1,第180 - 171页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j . Cai,苗x, y李et al .,“全基因组测序识别遗传方差culture-expanded人类间充质干细胞,”干细胞的报道,3卷,不。2、227 - 233年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. 董h . m . Liu Lei, p . et al .,“脂肪间充质干细胞从老年人表现出迁移和分化能力下降和衰老特性,”细胞移植,26卷,不。9日,第1519 - 1505页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. a·c·潘迪,j . a .义符d Kaushal et al .,“微rna分析显示年龄相关性差核转录因子的表达κB和增殖蛋白激酶在人类间充质干细胞,脂肪和骨骨髓来源”干细胞研究与治疗,卷2,不。6,49页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. m . Wanjare s魏仁芳,s . Gerecht“血管周的细胞在血管再生,”生物技术杂志,8卷,不。4、434 - 447年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. j . t . Kuwabara和m . d . Tallquist跟踪外膜成纤维细胞对疾病:回顾当前的方法来识别居民成纤维细胞,”动脉硬化、血栓和血管生物学,37卷,不。9日,第1607 - 1598页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. a . Armulik g . Genove, c . Betsholtz”周:发育、生理和病理的角度,问题,并承诺,“细胞发育,21卷,不。2、193 - 215年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. 卡瓦略·c·a·Brohem c . m . c . l . Radoski et al .,“比较成纤维细胞和间充质干细胞来源于真皮脂肪组织,”国际化妆品科学杂志》上,35卷,不。5,448 - 457年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. m . Crisan m . Corselli w·c·w·陈,b . Peault“血管周的细胞再生医学,”细胞和分子医学杂志》上,16卷,不。12日,第2860 - 2851页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. s . Supakul k姚,h Ochi et al .,“周作为一个来源的成骨细胞在骨折愈合,”国际分子科学杂志》上,20卷,不。5,1079年,页2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. m . Crisan狂吠,l . Casteilla et al .,”一个血管周的间充质干细胞在多种人体器官来源,”细胞干细胞,3卷,不。3、301 - 313年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. c . Farrington-Rock n . j .园地m·j·多尔蒂b·a·阿什顿c . Griffin-Jones和a·e·坎菲尔德”Chondrogenic,脂肪形成的微血管周的潜力。”循环,卷110,不。15日,第2232 - 2226页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. m . Dominici k·勒布朗,穆勒et al .,“最低限度标准定义多功能间充质基质细胞。被国际社会公认为细胞治疗位置声明。”Cytotherapy,8卷,不。4、315 - 317年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. d . g . Phinney功能异质性的间充质干细胞:影响细胞疗法,”细胞生物化学杂志》上,卷113,不。9日,第2812 - 2806页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. 王黄j .张x h . et al .,“挑战和承诺的同种异体间充质干细胞作为细胞治疗,”干细胞研究与治疗》第六卷,没有。1,p。234年,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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