生物相容性和血管生成壳聚糖/氧化石墨烯水凝胶支架对内皮祖细胞的影响

文摘

血管生成在组织工程领域引起了广泛的关注。氧化石墨烯已经成为一种很有前途的纳米材料在组织工程以其独特的生化特性。因此,在此,一系列的壳聚糖(CS) /氧化石墨烯(去)合成了交联水凝胶支架CS和在不同浓度(0.1,0.5,和1.0 wt. %)使用genipin。与CS水凝胶支架相比,CS /去水凝胶支架有一个更好的网络结构和机械强度。然后,我们使用了内皮祖细胞(epc)提取人类脐带血和cocultured这些内皮祖细胞和支架。0.1和0.5 wt的支架。%没有显示出相当大的细胞毒性,可以促进内皮祖细胞的增殖和管的形成,调节CD34的表达,VEGF, MMP9, SDF-1内皮祖细胞与支架的情况下以1.0 wt. %。这项研究表明,石墨烯氧化物的加入提高了壳聚糖水凝胶的结构和增强内皮祖细胞的增殖活性和血管生成能力。

1。介绍

组织缺陷造成的创伤、感染和肿瘤切除已成为一个严重的问题在全球医疗1]。虽然手术是最有效的方法来治疗这些缺陷,它有一定的局限性。在这方面,组织工程吸引了大量关注。然而,随着组织再生依赖于血管的运输营养物质和代谢废物,策划组织不能广泛使用,因为他们缺乏血管系统(2]。没有植入微脉管系统的灌注,体外组织工程结构的厚度是限于大约200μ米,氧气扩散限制(3]。因此,足够的血管生成可以促进受损组织的生存和修复(4]。尽管一些研究已经报道的骨支架材料,研究血管生成这些材料目前还在起步阶段的5,6]。因此,在组织工程领域的研究人员开始关注改善组织工程血管生成的结构(7,8]。

三维多孔结构有利于内皮细胞的生长和血管结构的形成9,10]。水凝胶作为一种三维多孔结构,获得良好的生物相容性、降解性,和合适的机械性能,它可以开发和改进来实现更多潜在的支架材料(11,12]。壳聚糖(CS)是甲壳素脱去乙酰基产品,已广泛的可用性和无毒性的优势(13]。CS组成的水凝胶具有良好的生物相容性和降解性,被广泛用作组织工程支架材料(14,15]。然而,疲软的机械强度和低骨传导性的CS限制这些支架材料在组织工程中的应用16]。为了克服这些限制,许多研究人员已经开发出CS复合材料(17,18通过加入无机生物活性材料,等β磷酸三钙和羟基磷灰石(HA),使用CS促进骨再生(19,20.]。然而,这些材料的应用是阻碍osteoinduction不足和血管生成(21]。

此外,石墨烯衍生品已经逐渐成为一个研究热点领域的nanobiomedicine,因为他们可以提供一个良好的物理和化学环境对骨形成22]。石墨烯氧化物(去)显示相当大的潜在的生物医学应用,包括骨组织工程,由于其优良的理化性质和生物活性23,24]。在适当的浓度可以诱导血管生成无明显的细胞毒性(25,26]。此外,拥有丰富的含氧组,可以增加HA的沉积27]。许多研究人员介绍了进入组织工程移植物,发现是有效的促进血管生成(27- - - - - -29日]。因此,添加纳米粒子到CS水凝胶可以克服上述限制的水凝胶。

除了拥有一个合适的三维支架,种子细胞的生长和增殖是至关重要的。内皮祖细胞(epc)是内皮细胞的前体细胞,能刺激抵押品缺血组织血管的生长,从而促进血管生成(30.]。内皮祖细胞可以从脐带获得无创血液和成人外周血,从而消除免疫原性(31日]。因此,组织工程血管生成能力的植入可以通过引入增强内皮祖细胞。

此外,genipin(国民生产总值)是一种无毒、易降解的天然物质,已被广泛用于交联生物材料(32]。预测,CS能与genipin反应,亲核开环反应,更有利于形成空间网络结构研究[33,34]。多项研究表明,国民生产总值的细胞毒性明显低于经典的交联剂戊二醛体外(35,国民生产总值不断应用于生产生物聚合物支架在骨组织工程36,37]。

因此,在这项研究中,一系列的CS /去水凝胶支架是由交联的CS和使用国民生产总值在不同浓度。这些水凝胶支架表现出显著提高稳定性。随后,我们调查这些支架的物理和化学性质。此外,这些支架的血管生成潜力评估通过coculturing人类内皮祖细胞,和可能的机制进行了讨论。

2。材料和方法

2.1。水凝胶的生产

在此,2.0 g CS(程度的 ,Macklin,中国上海)溶解在水100毫升盐酸(0.1 mol / L, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在无菌条件下。最终解决方案的pH值调整到7.25左右β甘油磷酸酯钠溶液(70% ,中国,北京,Solarbio)。然后,适量的国民生产总值(1%的解决方案 ,Sigma-Aldrich)和去水溶液(3毫克/毫升,Macklin)被添加到上述的解决方案。通过机械搅拌和超声打破,CS /去混合解决方案与不同浓度准备。此后,这些混合解决方案在4°C和离心机3000 r / min 10分钟,然后放在一个生化培养箱在37°C形成水凝胶。最后,这些水凝胶被冻结在-80°C 4 h,然后放置在真空冷冻干燥机(Biobase,济南,山东,中国)来构建水凝胶支架。

2.2。扫描电子显微镜(SEM)

冻干水凝胶支架都是切成立方体边长为0.5厘米在液氮溅射涂层用金紧随其后。支架部分的内部结构和形态是由扫描电镜检查(日立s - 3700 n、千代田、东京)。每组三个样本的选择,在电子显微镜下拍摄照片。三个地区的每个样本被ImageJ随机选择和测量。通常情况下,平均孔隙尺寸计算。

2.3。傅里叶变换红外光谱(FTIR)

水凝胶支架在适量地面和混合KBr (Macklin)粒子1:300的比例。然后,他们扫描64次使用傅里叶变换红外光谱仪(力量张27日,卡尔斯鲁厄巴登-符腾堡州,德国)在4000 - 400厘米¹在分辨率为2厘米¹和傅里叶变换红外光谱被记录下来。

2.4。粉末x -射线衍射(XRD)

使用x射线衍射仪分析了上述样品(D8X力量),和相应的x射线衍射模式。的扫描区域2θ一系列0-40°,扫描速度是2°/分钟。

2.5。拉伸性能

冻干支架被切成 条,其拉伸性能测定使用电子万能材料试验机(Qingji仪器技术有限公司、上海、中国)和100 N负荷细胞加载速率的10毫米/分钟。测量进行了5次,计算平均值。

2.6。膨胀率(SR)

合适的冻干支架的体重,沉浸在大量的超纯水25°C 24 h,然后称重后再去除表面水分: 在哪里和是湿和干燥的水凝胶支架的重量,分别。

2.7。孔隙度( )测试

具体方法如下(38:水凝胶(干质量M0)称量瓶浸没在乙醇。瓶子是重(Mb)删除之前(Ma)和之后潮湿的脚手架。与此同时,50毫升比重瓶满乙醇重与体重表示M1。乙醇是倒出,湿脚手架之前浸泡在酒精放在比重瓶,和乙醇添加到比重瓶都是相同的。比重瓶又重的重量表示M2。根据以下方程(孔隙度计算是乙醇的密度): V1支架孔隙的体积,V2的表观体积是脚手架,然后呢支架的孔隙度。重复测量三次同样的样品,和平均值。

2.8。细胞亚文化

2.8.1发布。亚文化的内皮祖细胞

在epc(从广东购买脐带血银行,广州,广东省,中国)坚持墙,媒介改变了每两天。细胞可以亚文化当他们已经增长到了80%。删除原来的介质后,用PBS洗净(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)两次,添加0.5毫升0.25%胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)。当细胞,添加介质停止消化。在800转离心后3分钟,再悬浮与内皮细胞生长培养基(临时)被用来接种于培养瓶,然后培养在37°C, 5%的公司₂孵化器(热费希尔科学)。

2.9。细胞识别

在此, 内皮祖细胞收集,荧光染料用于共轭细胞表面标记:CD45 / FITC CD14 / PE、CD34 / PE, CD133 / PE、CD31 / FITC CD105 / FITC和KDR-PE(热费希尔科学)。细胞被固定为4%多聚甲醛(Beyotime生物技术)。染色和流式细胞术洗染色后缓冲区( ),分析了细胞用流式细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。

2.10。管形成实验

基底膜基质(美国纽约康宁)融化在4°C和添加到96孔板预冷在-20°C的移除气泡紧随其后。然后,这个盘子是放置在一个细胞孵化器在37°C 1 h。内皮祖细胞是治疗血清内皮细胞生长培养基(临时)1 h,然后放置在一个96孔板覆盖着人工基底膜 细胞/;此后,这个盘子是放置在一个37°C, 5%的公司₂湿润孵化器。8 h后,观察管形成使用显微镜(日本奥林巴斯IX51)和图像。

2.11。内皮祖细胞的共培养和分组和水凝胶支架

水凝胶支架被放置在一个盘,然后,适量的内皮祖细胞接种到这些支架根据实验的要求。基于浓度的支架,coculture系统分为五组:内皮祖细胞,CS;内皮祖细胞,CS / 0.1 wt. %;内皮祖细胞,CS / 0.5 wt. %;内皮祖细胞,CS / 1.0 wt. %;和内皮祖细胞。

2.12。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

在无菌条件下支架在适量捏造和传播在24-well板;然后,500毫升中包含 内皮祖细胞被播种在每个好,50μL CCK-8解决方案(Dojindo、熊本、日本)被添加到每个好每36 h。孵化后37°C 2 h, 100μL中被撤销和添加到96孔板在450 nm为吸光度测量使用标(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国)。在每次测试中,三个重复的井设置对所有标本。

2.13。乳酸脱氢酶(LDH)的毒性试验

支架是在无菌条件下合成和在96孔板中传播。内皮祖细胞是消化和播种 细胞/。后1、3和5天3井为每个组的细胞在400 g离心5分钟,和上层清液。LDH工作解决方案(Beyotime生物技术)是根据LDH的指示准备的。LDH工作解决方案是完全混合测试的解决方案。大约有120μL的上层清液被撤回从每个好,放在一个新的96孔板。在室温下,96孔板与铝箔包装放在一个水平为慢摇瓶在黑暗中孵化30分钟紧随其后。然后,吸光度测量使用上述标在490海里。

2.14。生活/死染色

内皮祖细胞是播种12-well盘子上 细胞/。培养后细胞培养箱,文化解决方案被撤回,轻轻地与PBS浸泡三次,确保清除活性酯酶的培养基中。

2.14.1。染色工作解决方案的配置(Beyotime生物技术)

钙黄绿素和碘化propidium平衡在室温为30分钟,和染色工作解决方案配置根据指令。染色工作方案(200μL)被添加到每个封面好板的底部,其次是潜伏在黑暗中30分钟和温柔与PBS洗涤三次每次5分钟。同一地区的绿色和红色荧光检查使用荧光显微镜(日本奥林巴斯IX51)。

2.14.2。测量死细胞和活细胞的数量

胰蛋白酶没有乙二胺四乙酸被用来消化前面播种和浸泡内皮祖细胞,其次是离心分离和洗涤两次与PBS resuspend细胞。然后,每组的细胞被上述染色过程洗涤离心和PBS紧随其后。最后,使用流式细胞分析仪进行测量。

2.15。管形成分析

细胞接种根据CCK-8工具包提供的指示,不断培养7天。基底膜基质基底膜矩阵(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)在4°C解冻,与同等比例的基础培养基混合,用移液器吸取到预冷96孔板,在孵化为30分钟37°C。基底膜基质聚合后,内皮祖细胞治疗与血清及1 h,然后消化和受移植者在96 -孔板基底膜基质 细胞/。孵化后在37°C 8 h,使用显微镜的细胞成像(徕卡,位于Hesse-Darmstadt,德国),并使用ImageJ图像进行了分析和解释软件。

2.16。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

内皮祖细胞是播种在6-well板块 细胞/好,不断培养7天。每组的细胞总rna提取试剂盒的试剂(σ,密苏里州,美国)和反向转录成cDNA使用Evo M-MLV RT预混料装备(准确的生物学,长沙,湖南、中国)。绿色的SYBR®预混料Pro Taq HS qPCR工具包(准确的生物学,长沙,湖南、中国)被用于PCR扩增,和反应系统的总体积是20μl . PCR进行采用ABI棱镜®7500序列检测系统。反应条件如下:95°C 30年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 30年代。此后,2 -ΔΔCT方法用于计算的相对DNA表达。在这个实验中使用的所有引物合成了TsingKe(中国,北京),表中列出1。

2.17。免疫印迹分析

细胞被播种和培养中提到的部分2.15。细胞是细胞溶解里帕裂解缓冲(σ,密苏里州,美国),放在冰为30分钟,然后在12000克15分钟离心机在4°C,和上层清液吸气。bicinchoninic酸蛋白工具包(中国Biyuntian生物技术有限公司)是用来确定细胞的蛋白质浓度。dodecylsulphate-polyacrylamide钠凝胶电泳(sds - page)加载缓冲区(进集团、广州,广东省,中国)添加到细胞4:1后面比加热10分钟的100°C。样例(20μg)受到了sds - page,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,Billerica的),当时阻止了5%的脱脂牛奶在室温下2 h。由此产生的膜主要抗体孵育在4°C过夜,然后用具体的二级抗体室温2 h。此后,ChemiDoc XRS + (Bio-Rad)采用化学发光检测蛋白质乐队,和图像进行了分析使用一个软件的数量。以下使用抗体:CD34 (1: 1000;Proteintech 3 c8g12), VEGF (1: 1000;热费舍尔ma5 - 13182), SDF-1 (1: 1000;Abcam ab9797), MMP9 (1: 3000;热费舍尔pa5 - 83748)和GAPDH (1: 5000;题咏生物技术、fd0063 - 100)。

2.18。统计分析

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有的实验数据都表示为 。对比不同群体进行了使用一个独立的样本 - - - - - -测试。此外,多个标本,最初,列文计算方差的同质性的测试。如果方差是统一的,单向方差分析(方差分析)同时使用SNK多个执行组之间的比较;如果方差不均匀,韦尔奇的健壮的进行了方差分析,Dunnett T3测试是用于多个对比组。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。特性和结构特性的CS /水凝胶支架

好了CS /水凝胶支架是深蓝色,看起来,和弹性(肉眼观察到),和他们的内部结构松散,变形后恢复光压力(数据1(一)- - - - - -1 (d))。真空冷冻干燥后,纹理变得硬,脆,纯c水凝胶支架不适合夹紧和机械强度较低(图1 (e))。

纯c水凝胶支架的结构无序和不规则卷曲。与增加浓度,这个支架的内部形状慢慢变得均匀,和不规则卷曲逐渐改善(图2(一个)),表明添加去改善CS水凝胶支架的内部结构。SEM图像同时显示,所有的水凝胶支架高度多孔和相互联系的,与孔隙大小的范围100 - 150μ(数据2 (b)和2 (c))。

我们使用了一系列的实验来进一步描述的物理和化学性质CS /水凝胶支架。CS水凝胶支架的红外光谱光谱表现出两个特征吸收带为1636和1597 cm - 1,对应切断拉伸振动的乙酰化氨基(-NHCO)和nh - h弯曲₂,分别。在CS /水凝胶支架,nh₂吸收带移到一个较低的值,而-NHCO -带的强度增加;这可能是由于北半球₂群CS与羧基组反应,形成的-NHCO——贪污点(图3(一个))。

XRD支架的每一组模式显示CS的特征峰 ,这表明CS的结晶度(图3 (b))。去浓度的增加,峰的强度逐渐降低,和一个新的顶点附近出现 ,成为越来越明显增加浓度。这些结果表明,引入的确改变了CS的晶体结构,与红外光谱的结果是一致的。

3.2。物理和化学性质的CS /水凝胶支架

孔隙度的测试表明,每个组支架的孔隙度从92%到95%不等。然而,它慢慢地增加而增加的浓度从0.1到1.0 wt。%(图3 (c))。每组之间没有差异,孔隙度( )。

如图3 (c)老,CS水凝胶支架有更高的CS /水凝胶支架,和SR CS /水凝胶支架逐渐减少与增加浓度从0.1到1.0 wt. %。

进一步探索的影响继续CS水凝胶支架的性质,CS /去水凝胶支架的拉伸性能。每个组支架的拉伸应力-应变曲线如图所示3 (e),总结了机械性能表2。结果表明,当浓度从0提高到1.0 wt。%,弹性模量、拉伸强度和断裂伸长率增加从0.829到22.026 MPa,从1.363到7.153 MPa,分别从61.3到161.5%。

3.3。鉴定内皮祖细胞

来验证假设,CS /水凝胶支架可以改善细胞的血管生成,我们使用从人类脐带血内皮祖细胞作为种子细胞进行调查。新孤立主要细胞(图4(一))。被培养3 - 5天后,细胞扩散,发展成近纺锤状细胞,证明了“群体看作增长”(图4 (b))。7天之后,细胞迅速扩散和彼此连接在一个典型的“铺路石”模式(图4 (c))。流式细胞术结果显示,第三代epc CD45的表达较低(0.11%),CD14 (0.21%)、CD34(4.21%),和CD133(1.16%)和内皮细胞标记物的高表达CD31 (99.76%)、CD105(98.45%),和KDR(92.55%)(图4 (d))。小管形成实验的结果表明,细胞连接的端到端与基底膜基质形成孵化期间tubule-like结构,并且每个小管连接形成管状结构类似于血管腔(图4 (e))。这些结果证实,在这个实验中提取的内皮祖细胞是一类祖细胞,可以分化成内皮细胞,形成小管的能力。

3.4。评价CS /去水凝胶支架的影响内皮祖细胞的增殖和细胞毒性的支架

coculture中内皮祖细胞的水凝胶支架,我们研究了CS /去水凝胶支架的影响内皮祖细胞的增殖和细胞毒性的支架(数字5(一个)和5 (b))。首先,内皮祖细胞的增殖在五个文化团体CCK-8化验分析的1,3,5天后文化。细胞增殖显著抑制时的浓度增加到1.0 wt。%,而它被提拔当的浓度从0提高到0.5 wt. %。再次LDH毒性试验证实,包含1.0 wt组。%确实有明显的细胞毒性,表明一定浓度引起的细胞毒性。

为了进一步确认与1.0 wt水凝胶支架的细胞毒性。%,现场/死进行染色,使用荧光显微镜和图像得到,和死细胞和活细胞的数量记录的流式细胞术(图6)。内皮祖细胞坏死细胞的比例,CS;内皮祖细胞,CS / 0.1 wt. %;内皮祖细胞,CS / 0.5 wt. %;内皮祖细胞,CS / 1.0 wt. %;和EPC组低于10% ( ,与内皮祖细胞的情况相比,CS / 1.0 wt。%组),无统计差异的比例之间的死细胞内皮祖细胞;内皮祖细胞,CS;内皮祖细胞,CS / 0.1 wt. %;和内皮祖细胞,CS / 0.5 wt。%组织( )。内皮祖细胞,CS / 1.0 wt。%组织,死细胞的比例高达16.5% ( ,相比之下,其他组的情况下)。所有这些结果明确确认水凝胶支架为1.0 wt。%有大量的细胞毒性。

3.5。CS /去水凝胶支架的影响内皮祖细胞的血管生成

管的形成分析(数据的结果5 (c)- - - - - -5 (f))表明,第七天coculture,内皮祖细胞的内皮祖细胞,CS / 0.5 wt。%去组最重要的管形成能力,而内皮祖细胞,CS / 1.0 wt。%去组最低管形成能力( )。此外,管形成能力的内皮祖细胞内皮祖细胞和内皮祖细胞,CS组不显著(^Δ )。

进一步研究CS /去水凝胶支架的作用在促进血管生成,存在和免疫印迹进行了分析,结果表明,在第七天coculture、CD34的表达,VEGF, MMP9, SDF-1内皮祖细胞与增加显著调节去浓度与EPC的情况相比。然而,CD34的表达,VEGF, MMP9,和SDF-1抑制内皮祖细胞,CS / 1.0 wt。%组织(图7)。如图7(一)的相对mRNA表达内皮祖细胞,CS和EPC组不显著( ),而其他的团体在多个比较有统计学意义( ,相比之下,EPC的集团)。免疫印迹分析的结果中存在的类似(数字7 (b)和7 (c))。这些结果表明,在一个合适的浓度范围,就能促进内皮祖细胞的增殖和血管生成能力,这将有助于改善组织工程血管生成。

4所示。讨论

1993年,组织工程是由美国学者提出,随后带来了新曙光的重建和修复组织缺陷(39]。组织工程是一门学科,涵盖生物学等多学科领域,医学,工程。开发新的生物材料开发生物替代品,可以修复或改善有缺陷的组织,器官,或部分的人体40,41]。尽管现有的生物材料在组织缺陷的修复取得了一些进展,再生组织的血管生成仍然是一个研究问题。虽然目前不同的研究通过血管生成,促进组织再生的方法已经成功地应用在临床上[5,8,42]。因此,支架材料的连续的勘探和开发,促进组织血管生成和组织缺损修复的成功率具有重要的药用价值。

去被带进为其良好的机械性能和组织工程血管生成属性(43,44]。所以,我们添加壳聚糖水凝胶为了使一个理想的水凝胶支架材料。一个单一的生物材料限制由于自身的性能。因此,复合材料的优越性能由于多个材料相互重建,将发挥至关重要的作用在组织工程支架修复组织缺损。交联,共价键的应用极大地提高了水凝胶的稳定性(45,46]。所以,genipin是用作交联剂在这项研究。因此,一系列的CS /去水凝胶支架被交联的CS和在不同浓度在我们的研究中使用的国民生产总值。

特性和结构特征的分析CS /水凝胶支架,我们获得的结论如下。与浓度,增加支架的强度逐渐增加。因此,添加到CS水凝胶支架是有效增加支架的硬度。此外,支架的孔隙大小缓慢降低浓度的增加。这进一步表明,添加改善CS水凝胶支架的结构,使支架内的空间网络结构更加均匀和多孔。

我们使用了一系列的实验来进一步描述的物理和化学性质CS /水凝胶支架。红外光谱和x射线衍射,引入确实改变了CS的晶体结构。我们预测可能的原理图在图中材料的结构8。

孔隙度的测试仅仅确认去的引入增加了CS水凝胶支架的孔隙度。此外,一个更好的孔隙度可以促进细胞传播和促进细胞增殖47,48]。此外,SEM照片表明,去的引入使得CS水凝胶支架的结构更均匀,降低了孔隙大小,并增加了孔隙度。考虑到孔隙度增加,水凝胶的结构变得更加均匀增加,它是由于物理交联羧基之间和去nh -哦₂CS,甚至可能对国民生产总值的增加化学交联。因此,我们预测,细胞可以扩大和成长更好的水凝胶支架材料,这将促进植入体之间的物质交换和外部环境提供更多的能量,促进血管和组织的形成。所有这些结果表明CS /水凝胶支架可能成为潜在的组织工程支架。

这暗示的存在增强CS的肿胀率之间的物理交联水凝胶支架可能由于羧基和去nh -哦₂CS,甚至化学交联增加国民生产总值;然而,这需要进一步确认。因此,可以推测的是交联抑制CS水凝胶支架的膨胀,从而降低了SR。

因此,增加的拉伸性能显著提高CS水凝胶支架。这与之前报道的结果是一致的CS /去水凝胶薄膜不同浓度(49,50]。总之,我们发现的去改变壳聚糖水凝胶的结构,影响材料的物理和化学性质。

进一步探索壳聚糖/氧化石墨烯的生物相容性和血管生成影响水凝胶支架,内皮祖细胞被选择。ECs(内皮细胞)不能被广泛应用于骨组织的血管化,因为他们的低扩散和低利用率(51]。因此,我们使用内皮祖细胞作为种子细胞。CCK-8和细胞毒性试验结果表明,当浓度高于0.5 wt。%,它抑制了内皮祖细胞的增殖和重要的细胞毒性细胞引起的。这与王等报告的结果是一致的。也就是说,在一个合适的浓度没有相当大的细胞毒性,而它展示大量的细胞毒性剂量高于50μ克/毫升(52]。因此,作为一个新的生物材料,在适当的浓度可用于组织工程支架材料做准备。

在CS管实验,形成水凝胶支架没有显著促进血管生成,添加后而去,它刺激管形成。然而,当走到1.0 wt的浓度。%,管形成抑制。这证明了高浓度的内皮祖细胞可以抑制血管生成。进一步探索血管形成的分子机制的CS /水凝胶支架,我们进行更多的实验。CD34、VEGF、MMP9, SDF-1选择探讨机制。

CD34是一种跨膜糖蛋白,是有选择地表达内皮祖细胞表面。SDF-1和VEGF在EPC发挥关键作用的功能。研究表明,ECs SDF-1促进VEGF的表达,是一种重要的细胞因子动员EPC (53]。王等人证实,金属硫蛋白(MT) HIF-1促进内皮祖细胞介导的血管生成α/ SDF-1 VEGF通路(54]。几项研究证明了SDF-1 / VEGF通路对内皮祖细胞的血管生成至关重要55,56]。在我们的研究中,angiogenesis-related基因的表达CD34、VEGF、MMP9, SDF-1被检查,发现在适当的浓度调节。免疫印迹分析结果也证实了这一现象。因此,我们得出结论,可以调节血管生成的能力通过SDF-1 EPC / VEGF信号通路。我们发现一些研究血管生成机制的内皮祖细胞,而不同于ECs。慕克吉et al。26发现phospho-eNOS的激活和phospho-Akt可能是合理的机制,和HUVECs rGO-induced血管生成。的研究,我们得出结论,引起的免疫微环境在适当的浓度促进血管生成HUVEC的VEGF通路(57]。然而,需要进一步的调查来了解相应的特定的信号分子机制。

我们预测的合适浓度CS /水凝胶支架可以促进内皮祖细胞的增殖和管的形成,进一步刺激血管的形成。的长期前景本研究没有提供证据的作用CS /水凝胶支架结合内皮祖细胞在促进血管生成和组织缺陷的修复。我们希望这些研究结果可以为应用程序提供一个新的理论基础的结合CS /水凝胶支架和内皮祖细胞在促进组织工程再生医学和组织修复。然而,我们的研究也有一些局限性。首先,我们没有全面研究CS的具体机制和交联的国民生产总值。第二,只有少数的分子机制进行了详细研究EPC管理由CS /水凝胶支架。第三,体内实验没有完成,我们无法验证的角色这种支架材料在体内修复骨缺损。

5。结论

在这项研究中,我们成功地准备一系列的CS /与不同浓度的水凝胶支架。的去改善CS水凝胶支架的结构,促进空间网络结构的形成,并提高了物理、化学和机械性能的支架。在适当的浓度,没有明显的细胞毒性,促进了内皮祖细胞的扩展和扩散,从而刺激血管的形成。然而,研究在基础和临床医学领域所扮演的角色仍处于起步阶段,参与血管生成和分子机制需要进一步调查。总之,我们的研究不仅为计算机科学的未来的研究开辟了新的路径/水凝胶支架但也为应用程序提供新想法的支架在促进新血管的形成。

数据可用性

张博士,电子邮件:summere0615@163.com将提供的研究数据。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。

作者的贡献

L.F.Z.贡献的概念研究中,生成的数据,和写的手稿。X.P.L.,G.Y.R., and Y.T.P. contributed significantly to the analysis and manuscript preparation. C.Y.S. provided the EPCs for this study. Y.H. provided comments and suggestions for submission. S.G.Z. revised it critically for important intellectual content and approved the final version. Lifang Zhang and Xinping Li are co-first authors of this work.

确认

作者承认支持广州市科技项目(批准号201707010193)和Intra-hospital基金的南方医科大学口腔医院(PY2020022)。

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