文摘
作为一个标准的临床治疗,血小板输血被用来防止出血患者的血小板减少或血小板功能障碍的影响。血小板也显示治疗促进肝脏再生潜力和骨折愈合和再生和治疗皮肤条件。然而,血小板供应很少满足临床需求上升。其他问题,包括短保质期,严格的储存温度,和同种异体免疫引起的血小板输血频繁,已成为严峻的挑战,需要发展高收益替代血小板的来源。人类多能干细胞(hPSCs)是一个无限的替代来源再生医学和patient-derived则可以提供小说研究模型来探索一些疾病的发病机理。许多研究把重点放在了建立和修改协议生成功能从hPSCs诱导血小板(iPlatelets)。达到高效生产和消除外源性抗原,媒体补充剂和矩阵优化。此外,一些重要的转基因产品的引入,如原癌基因,BMI1,BCL-XL,还可以显著增加hPSC-derived血小板生产;然而,这可能会带来一些安全隐患。此外,许多小说文化系统已经开发iPlatelets扩大生产,包括二维流系统、三维旋转系统和垂直往复运动液体培养生物反应器。新的基因编辑技术的发展,如CRISPR / Cas9,可以用来解决同种异体免疫的血小板输血敲门的表达B2M。此外,iPlatelets的功能也从多个方面进行评估,包括但不限于形态、结构、细胞骨架组织,颗粒含量、DNA含量和基因表达。尽管iPlatelets接近的生产和功能满足临床应用要求在这两个数量和质量,仍有很长的路要走规模化生产和临床应用。在这里,我们总结了不同方法的血小板iPlatelets的生产和更新进展。此外,我们强调最近的进步我们理解关键转录因子或分子确定血小板分化方向。
1。介绍
在哺乳动物中,血小板是由成熟的巨核细胞(MKs)在骨髓和分化的多能干细胞造血组织。血小板的主要功能是凝血和止血;一旦发生血管损伤,血小板迅速激活,坚持伤口,聚合形成血小板凝块。因此,他们被称为“创可贴”的血液。血小板发挥管理作用的临床治疗血液疾病,如急性髓系白血病、免疫血小板减少,特发性血小板减少性紫癜(1]。血小板免疫监管者忽视了;他们扮演着重要的角色在炎症和感染2),因为他们可以识别外部病原体和生产很多化学引诱物激活和招募白细胞的网站感染和炎症,从而提高他们的杀伤力病原体(3]。
血小板的作用在协助肝脏再生,骨再生,治疗皮肤疾病的,还增加对血小板在临床治疗的需求4- - - - - -6]。发现血小板源血清素参与肝再生和血小板和受损肝细胞增殖之间的相关性表明,血小板发挥重要作用在肝脏再生(7,8]。血小板输血可以改善CCl4-induced严重联合免疫缺陷小鼠的肝纤维化(9]。血小板之间传输的编码和监管RNA和肝细胞能促进肝细胞增殖和肝再生(10- - - - - -12]。肝切除术后,血小板与肝脏内皮细胞和枯否细胞通过正弦协调各种生长因子的释放,包括人类生长因子、胰岛素样生长因子,血管内皮生长因子(VEGF),或通过直接接触肝细胞(13- - - - - -15]。血小板在许多疾病的治疗作用研究,应用富含血小板血浆(PRP)在再生医学产品获得了广泛的关注。PRP是一种自体血液和生物产品来源于离心法或apheresis与高浓度血小板(一个解决方案16,17]。PRP治疗利用血小板丰富的生物因素和chemoattractive细胞因子与组织再生和重构。
此外,激活PRP的水凝胶特性使它成为一个合适的药物运载工具(7,8,18]。血小板动态调节骨重塑的过程通过释放促炎细胞因子激活的炎症阶段早期骨愈合,然后加强维修阶段的愈合过程19,20.]。PRP治疗被广泛研究骨科和口腔、颌面部损伤援助止血和肌肉骨骼再生(5,18,21,22]。PRP已经报道,此外,在审美皮肤病有疗效在治疗脱发引起的雄性遗传脱发(23]。血小板结合分数激光或脂肪移植可以改善疤痕修正(24,25),可能在皮肤复兴提供福利和真皮增大26,27]。因此,血小板疗法有望成为一种新的治疗途径再生医学和组织工程。
以前,donor-derived血小板是主要血小板源用于治疗某些临床疾病如特发性血小板减少性紫癜(ITP)。然而,全球捐赠血液供应不足限制了其应用。周围的复杂性和怀疑血小板捐献也打消了许多捐助者和当前血液供应不能满足临床需要,造成严重短缺(28]。除了这个问题,还有几个在血小板输血不可避免的挑战。第一个是血小板保存;血小板只能储存在室温下在短时间内;否则,有一个显著的细菌污染的风险。尽管冷藏可以减少血小板的细菌繁殖,延长保质期,它还改变血小板结构,分子,和新陈代谢29日]。第二,外生血小板可能导致过度血小板接受者的免疫排斥。频繁的血小板输血会导致同种异体免疫,结果从多个抗体的生成,如人类白细胞抗原(HLA)抗体和人类血小板抗原抗体的病人。剩余红细胞(红血球)血小板输血后也能导致红细胞抗体生产(30.]。探索安全、高质量的替代来源的血小板临床使用再生医学领域将明显受益。
多能干细胞(已经),包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能),具有无限自我更新的优点和多个定向分化能力,已经成为可靠的血小板源再生医学。大量研究表明,万能干细胞可以分化成各种功能细胞类型,如心肌细胞,肾元祖细胞,肾瀑样,少突细胞祖细胞,黑色素细胞(31日- - - - - -34]。系统生成诱导血小板(iPlatelets)从人类已经被(hPSCs)也建立了使用各种方法(35- - - - - -38]。使用基因编辑技术,如CRISPR / CAS9,已经可以开发的基因可操作性;这使已经被更方便和有用的克服目前遇到的一些困难的血小板的使用,如同种异体免疫。因此,hPSC-derived iPlatelets可以克服限制在当前血液donor-dependent系统在血小板生产和解决一系列的问题在不久的将来临床应用。然而,仍有许多挑战需要克服。
本文总结了当前方法生成hPSC-derived iPlatelets,介绍了现状,比较了优缺点,限制,和缺陷,并建议未来的研究方向。
2。iPlatelets的进展和当前的方法
许多先前的研究报道,MKs期间必不可少的中间产品hPSC分化成血小板,为研究提供一个新的视角和输血医学。这些研究是列在表中1;他们描述可体外分化和血小板生成(图1)。
早在2006年,白肢野牛和他的团队建立了一个基因易处理的系统来区分人类的ESCs(为)MKs [39]。coculture OP9基质细胞和为其被用来探索首次在体外可生产。它也被称为传统的方法或multiround金属堆焊的方法。天7和11个,单个细胞来源于分化hESC殖民地转移到新鲜OP9细胞,进一步培养了17天。荧光分析显示,大约有20 - 60%的浮动和松散附着细胞表达CD41a / CD42b,巨核细胞谱系的特征。然而,这个系统几乎不产生血小板。此外,造血祖细胞(手持电脑)源自hPSCs分化成MKs通过添加细胞因子自洽场,Flt3L,传真照片51,52]。然而,血小板生产能力仍有限。从那时起,在试图解决低收益率,已经建立了不同的分化系统获取hESC-derived血小板。等生长因子VEGF和ESC / iPSC-derived囊(ES / iPS-sacs)分化成手持电脑,从而诱导的发展成熟的MKs和释放血小板(35]。在此系统中,为其与10 t1/2 cocultured OP9基质细胞。在14天的文化,ES / iPS-sacs收集集中手持电脑,而后者被转移到新鲜10 t1/2或OP9基质细胞和培养26天。通过这个协议,有效地获得大量成熟的血小板。
另一个成功的系统建立了陆等人谁发现hemangioblasts /爆炸细胞(BCs)作为中间体在hPSC-derived血小板进一步生产和大规模生产功能性MKs [40]。在细节,为其培养在超低连接板的多种细胞因子组合,包括BMP4, VEGF,自洽场,传真照片,无血清培养系统和FLT3L四天。这个过程涉及到身体(EB)形成胚状体,显示良好的工业潜力iPlatelet差异化生产和提高效率(40,53]。EB阶段产生的单个细胞的无血清培养系统中添加了多种细胞因子为8天爆炸集落形成和自洽场的存在,进一步分化成MKs传真照片,IL-11 10 - 14天。血小板生成、OP9基质细胞和细胞因子,包括自洽场、传真照片,和肝素使用22天(40]。血小板的数量来自这些方法是相当大的。它已经表明,血小板产生hESC-derived MKs显示可比血小板超微结构和形态与自然和有相似的特征属性的血小板功能(54,55]。
自从馈线细胞和血清添加用于上述文化系统有潜在风险引入外国病原体和诱导免疫反应的患者,用馈线细胞和血清研究。Salvagiotto等人用胶原IV和无血清培养基诱导feeder-free万能早期造血祖细胞,显示可血统特征(36]。进一步技术创新,“自旋胚状体的身体”的方法,建立了hESC分化无血清培养系统可在feeder-free血统和分化培养基(41]。在这个协议,为其与BMP4无血清培养系统的补充,VEGF,自洽场,FGF2形成EBs和提交细胞造血作用。细胞在无血清培养系统额外增加3 - 10天传真照片,自洽场,IL-3刺激megakaryopoiesis [41]。这种血清,feeder-free文化系统启用的形成可从hPSCs祖细胞生成,然后诱导platelet-like粒子;然而,血小板产生在这个方法没有提供。
正如前面提到的,则提供了一个有前途的机会学习造血作用的个体发生;然而,韩国帝王组件,如馈线细胞或外国物种的血清,限制iPlatelets的临床应用。因此,兰扎和他的团队建立了一个三步的协议,它可以提供可伸缩的和功能齐全的血小板临床使用38]。执行这个协议在feeder-free和xeno-free文化条件下,大大减少了污染和外国血清免疫原性造成的。人类万能(hiPSCs)停牌和播种人类胶原蛋白IV-coated盘子和孵化24 h在37°C在常氧条件下在一个特定的媒介。第二天,细胞被转移到低氧条件和培养4天,normoxia紧随其后。中包含BMP4, VEGF和FGF。细胞培养在培养基含有传真照片,自洽场,FLT3L, IL-3, il - 6,肝素生成可7天祖细胞(MKPs)。最后,收集MKPs和培养可成熟中包含传真照片,自洽场,il - 6, IL-9,肝素钠在超低附件盘子39°C可成熟和血小板的形成。这个feeder-free系统产生大约30血小板/ iPSC-derived可(38]。在这个文化方法,CD41a比例+CD42b+double-positive成熟MKs高达80%。随后产生血小板的纯度高,具有更大的优势,MKP细胞可以冻存38]。
快速突破的技术操作,血小板的安全性和纯度有所改善。同时,方法稳定输出仍然需要探索临床或商业用途。这些开发协议表明,馈线为血小板生成体外和细胞是可有可无的补充强调媒体的重要性和矩阵优化未来的调查。
2.1。关键在iPlatelet代遗传因素
除了改进微分方法上面所提到的,特定的基因改造直接影响血小板的生产。先前的研究已经表明,各种组织血统可以从hPSCs分化通过调节主转录因子的表达(56]。因此,通过操纵hiPSCs的基因表达,高山等人发现的表达模式原癌基因是一个至关重要的因素在确定血小板生产hiPSC分化成MKs体外(57]。瞬态的激活原癌基因紧随其后的是原癌基因表达式是可成熟和功能的关键血小板减少生产。如果没有这种干预,常数的表达原癌基因减少的表达GATA1和核因子erythroid-derived 2单位下岗通知(p45NF-E2),导致生产功能受损血小板(57,58]。2014年,伊戈尔Slukvin和他的团队发现转录因子GATA2和TAL1诱导hESC分化成红细胞MKPs通过指定hemogenic内皮中间体(43]。两年后,男人和他的同事发现的超表达GATA1,FLI1,TAL1促进了MKs的增殖和分化。细胞产量和纯度很高的MKs完全可以通过使用化学定义nonheterogeneous培养条件(45]。
同样的,永生的巨核细胞祖细胞系(imMKCLs)后产生的外源基因的超表达BMI1,BCL-XL,原癌基因Tet-on系统的控制下,已经被这些imMKCLs扩大了很长一段时间,可以冻结和解冻44]。尽管这些方法涉及病毒转导可能有特定的安全担忧关于clinical-grade制造、遗传操作提供新颖的见解megakaryopoiesis背后的机制;帮助开发临床安全协议、病毒或非整合方法或选择在未来应该使用小分子化合物。
CD42b (GPIba)血小板功能的一个重要标志,可以绑定到vWF然后最初调解循环血小板的粘附受伤的网站(59,60]。在费城儿童医院的一项研究表明,CD42b的表达与可成熟(48]。MKs可以分为三个子集:低粒度的MKs (LGMKs)、高颗粒MKs (HGMKs) CD42b表达式,和HGMKs CD42b表达式。逐渐减少的百分比LGMKs和HG / CD42b+MKs和凋亡HG / CD42b积累- - - - - -MKs表明血小板的减少产量,凋亡抑制细胞凋亡起着保护作用在可CD42b剥落。研究还发现,HG / CD42b相同+MKs更有可能导致血小板反应催化剂。这些MKs可能接近峰值的成熟和有能力向alpha-granules吞噬凝固因子阵线。有趣的是,CD42b高/艘渔船+MKs代表HG / CD42b的族群+MKs和更大的规模和粒度;这表明阵线吸收可能是一个完整的最后标记可成熟。FV-labeled MKs可以释放功能血小板输注后的NOD / Shi-scid / IL-2Rγ零(NSG)小鼠,同样的现象可以在iPSC-derived MKs [45]。此外,实验阵线增加了血栓形成和血小板聚集能力相比,血小板没有阵线。这些结果提供了新的见解的特定阶段可成熟和PSC分化成血小板的实验基础。阵线标签可能是一个有用的工具来筛选HG / CD42b成熟+MKs iPlatelet期间生成和促进血小板高收益率如果进一步结合生物反应器(42,61年]。
因为不匹配的HLA抗原血小板输血失败的一个原因,建立了一个新系统来解决alloimmunity。使用CRISPR / Cas9技术敲除的表达β2-microglobulin基因(B2M),一个重要组成部分HLA分子,我表达在细胞表面HLA是成功地消除(38,50]。因此,能逃脱抗体介入细胞毒性产生的血小板功能在体外和体内。
2.2。扩大iPlatelet生产系统
血小板的效率生产从体外的细胞则低于静态文化条件下观察到体内。许多生物反应器或小说文化系统已经开发和提炼iPSC-derived血小板生产规模。一个二维流文化系统提出了中川et al。42),这是一个仿生人工血管系统组成的生物可降解支架与有序阵列排列的孔通过盐浸出模拟体内骨髓。的方法,两种不同的流动(夹角是60°代替90°)帮助MKs施加适当的压力和剪切应力,从而促进血小板生产。血小板源自为或hiPSCs 60°角通过生物反应器显示完整的整合素αIIbβ3受体激动剂刺激后激活。
旋转式细胞培养系统的开发和应用,加强megakaryopoiesis,大大增强血小板生成(62年]。这个3 d动态文化系统提供剪切力优势,模拟微重力和更好的营养和氧气的扩散。通过筛选化合物、生长因子和扶轮悬浮培养系统,血小板产量∼在静态条件下高出3.7倍。
湍流能量,有趣的是,作为一个物理调节器在体内血栓形成,可应用于生产体外血小板。伊藤等。49)成功地生成高效iPSC-derived血小板使用另一个新开发的垂直往复运动液体培养生物反应器,蠕虫类。最优水平的湍流能量和剪切应力是包含在这个系统,改善血小板的产量1000亿年一代的血小板功能从一个8 L hiPSC-MKs蠕虫类独立的种植规模大小。iPSC-derived血小板的形态和功能与donor-derived血小板。可能的解释是,湍流能量可能促进proplatelet通过细胞自动脱落机制IGFBP2溶性因素,MIF, NRDC (49]。
血小板示踪技术已经进一步细化。发现水平的分子微管组件β1-tubulin (TUBB1)的主要成分MKs的细胞质,逐渐增加MKs的成熟。因此,使用CRISPR / Cas9β1-tubulin标记可以帮助监测可开发和platelet-like粒子的生成。CRISPR / Cas9可以应用于高通量鉴定和验证新型抗病诱导剂的大规模生产体外血小板(63年]。这些高效和可控的方法代表了一个相当大的飞跃在大型血小板生产未来生物医学和临床应用。
2.3。iPlatelets的功能
许多研究被设计来评估是否hPSC-derived MKs和血小板有良好的纯度和适当的质量正常的人类血小板并确定其基本功能在体外和体内。评估标准体外血小板功能和安全的验证包括,但不限于,形态、超微结构、细胞骨架组织,颗粒含量、倍性,基因表达,和生物标志物表达64年]。超微结构/形态分析表明,imMKCLs或其他iPSC-derived MKs有类似人类MKs多倍体状态为主(44]。作为血液血小板iPlatelets有相似的表面标记;然而,他们有更少的血小板颗粒和较大的细胞大小(38,44]。iPSC-derived MKs表示许多功能特定的标记如CD41a CD42b, CD61,可用于血小板识别(35,41]。此外,相对的巨核细胞的标记基因mrna的表达,如原癌基因,GATA1,TAL1,RUNX1在hPSC-derived MKs(高41,43,44]。通常,血小板聚合反应后激活的受体激动剂二磷酸腺苷(ADP)因为有网站血小板可以绑定到ADP和导致整合蛋白构象变化αIIbβ3 (35]。流式细胞仪分析显示高绑定iPlatelets起始位点的能力在ADP的缺失。激活后,iPlatelets固定化纤维蛋白原聚合展出,板状伪足,丝状伪足,肌动蛋白纤维应力,诱导细胞骨架重组(44,57]。
毫无疑问,最有力的证据来自体内实验。人类正常血小板和iPSC-platelets静脉注入到老鼠macrophage-depleted分析iPlatelet函数在活的动物。结果表明:iPSC-platelets纳入发展中鼠标血栓,类似于血液血小板(38]。也有证据表明,iPSC-platelet动力学是一样的新鲜血小板正常。高时空分辨率激光共聚焦显微镜,iPlatelets的行为在起始粘附受伤的血管壁动态观察到免疫缺陷NSG老鼠与2.0 Gy辐照诱导血小板减少症(57,65年]。几项研究已经评估iPlatelets的体内功能,它已被证明,iPlatelets坚持最初受伤的网站,导致血栓形成和血栓收缩(38,40,45]。然而,其中的一些研究显示iPlatelet血栓能力有限而正常血小板(44,45,57]。
2.4。优势,限制,和潜在的应用
由于hPSCs的无限的自我更新能力,iPlatelets可以为当前donor-dependent系统是一个理想的替代。此外,结合CRISPR / Cas9或其他基因编辑技术可以帮助减少同种免疫的拒绝(38,45]。在安全方面,iPSC-derived血小板可以辐射消除病原体和其他细胞污染。作为一个中间,imMKCLs可以扩大了很长一段时间,也可以在紧急情况下被冻结和解冻利用率(44]。iPlatelet生产,然而,仍然有局限性,如潜在的致瘤性、低收益、低功能,和高成本(37,38,42,44,45]。iPlatelets已经总结的优点和局限性,表中列出2。
缺乏适当的模型很大程度上限制了许多疾病的发病机理的探索。因此,patient-derived则可以提供巨大的研究模型,可以解决上述问题。例如,的感应已经从家族性血小板减少症患者/急性髓系白血病(aml)显示,他们手持电脑,MKs分化成影响的能力,这是相关联的RUNX1在这些疾病[种系突变68年]。此外,Paris-Trousseau综合征(PTSx)是由缺乏FLI转录因子,可分化过程中必不可少的因素。为了更好地理解的作用FLI在这种疾病,则来自PTSx患者的血小板生产能力与野生型万能的,建议FLI可能会影响可单独使用的生产潜力和血小板(69年]。
同样,因为MKs罕见的骨髓中,很难探索健康之间的差异和病理状态和它们对血小板的影响生产,特别是严重megakaryocytopenia患者,包括先天性amegakaryocytic血小板减少症(CAMT)。在这种情况下,则提供一个有用的模型,模拟CAMT患者血小板减少。虽然这些patient-derived则不能产生MKs和血小板,MPL的过度表达可以恢复其造血功能(70年]。
3所示。结论和未来的角度
稳定和可靠的干细胞是前进的理想来源基本科学发现和细胞疗法在megakaryopoiesis和血小板的背景下生产。许多研究表明,血小板源自hPSCs有一定的特性和功能类似于正常血小板,等起始位点绑定活动、表面标记表达式和粘附能力。
本文概述了有关的生产和使用的可能性和挑战hPSC-derived血小板。首先,自体iPlatelet转移成为避免同种异体免疫排斥反应的有效途径。此外,最新的基因敲除技术,CRISPR / Cas9,还可以有效地减少由于不匹配的HLA同种免疫的拒绝。然后,血小板生物反应器设计模仿体内血小板的生产,使血小板祖细胞暴露于本国的体系结构和血管内剪切应力特点微环境(61年]。万能的组合和3 d生物反应器是一个有用的工具为提高血小板收益率(49,66年]。工业化生产iPSC-derived血小板是临床应用的不可抗拒的趋势。在不断努力下,血小板来自已经在质量和数量都有显著的改善;安全评估和全功能评价iPlatelet输血仍至关重要,成本需要控制。仍有很长的路要走iPlatelets的大规模生产和临床应用。iPSC-derived血小板需要进一步技术创新来实现优化的可伸缩的生产和临床可行性。
的利益冲突
没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
LPL和YWZ构思和设计研究。MXX起草了手稿。LPL、YWZ MXX导致审查,讨论,修改手稿。所有作者同意最后的手稿。LPL和MXX同样这项工作。YML提供资源和材料。YML和YWZ高级作者和co-correspondents这项工作。
确认
我们感谢YX Zhang博士H太阳,博士和其他职员在我们实验室科学评论和有价值的讨论。这项研究支持部分由中国国家自然科学基金(82070638和82070638),教育部,文化,体育,科学,和日本技术,KAKENHI (18 h02866)和江苏省自然科学基金(BK20180281)。