呈正相关CD47激活和自噬在脐带血液间充质干细胞衰老

文摘

自噬发挥了至关重要的作用干细胞维护和相关细胞生长和细胞衰老。重要的是要找到一个质量控制预测衰老细胞的标志。本研究证实CD47可能候选人选择有效的间充质干细胞(msc)提高干细胞疗法的疗效分析抗体表面数组。CD47表达显著减少在msc在体外的扩张( ),与降低CD47表达式与加速衰老表型,细胞生长的影响。UCB-MSCs转染与CD47 siRNA显著的差别引发了对这些和upregulation pp38,伴随老化标记。ATG12,此外,autophagy-related标记,ATG5 Beclin1, LC3B,透露与CD47差别明显对这些核转染。此外,自噬流量与自噬诱导治疗后,雷帕霉素,表明CD47衰老是一个关键的球员在自噬和维护和调节msc的增长,这表明CD47可能是一个至关重要的关键标志的选择有效的干细胞在细胞疗法。

1。介绍

自噬是一种天然的细胞内的降解机制,维持细胞内稳态交付到溶酶体(1]。协调应对饥饿和代谢压力引发自噬功能的招聘和胞质蛋白和细胞器的降解去除和回收任何故障或不必要的组件2]。在病理条件下,包括神经退行性疾病、癌症和炎症性疾病,自噬也诱导和调节。很明显,自噬作用在控制炎症和密切与人类疾病(1,3,4]。自噬,细胞内自甘堕落系统,负责清除受损的细胞器或畸形蛋白质,为了再生更新的和更健康的细胞。自噬与细胞间隙的功能,这对发展是至关重要的,分化,和组织重建5- - - - - -8]。因此,了解自噬功能阐明疾病的原因是很重要的。自噬具有双官能团的作用在细胞生存和死亡,可能是通过清除潜在的有毒蛋白质聚合。阻断自噬抑制线粒体细胞色素c的释放和激活半胱天冬酶和诱发细胞生存能力9]。

老化,影响干细胞的再生潜力的下降,加上在逐步减少监管的细胞和组织的互动。它导致衰老,使不可逆逮捕的细胞分裂。间隙不足积累在老化损坏组件主要是描述生物。交溶酶体降解系统和减少自噬活动被老化了。通常,受损和老化细胞自噬缺陷已被确认10,11]。下降的数量和功能的干细胞老化可能导致再生下降。据报道,自噬与年龄相关性变化干细胞具备干细胞和分化能力的维护(12]。此外,免疫抑制性能更高的通道间充质干细胞(msc)下降,尽管稳定的msc表型(13,14]。有自我更新能力大幅下降增加供体的年龄和体外扩张(15- - - - - -17]。有趣的是,高老捐助者通过细胞和细胞显示更少的增殖能力。此外,从少增殖细胞分泌的细胞因子和生长因子与senescence-associated分泌表型,这是与衰老相关的(18,19]。因此,重要的是要找到关键的调节机制衰老标记来确定质量的体外细胞的干细胞疗法。

CD47,称为integrin-associated蛋白(IAP),是一种细胞表面糖蛋白在人类细胞中表达,结合配体血小板反应蛋白- 1 (TSP-1)和α(SIRP signal-regulatory蛋白质α)[20.]。临床上,抑制CD47是一个潜在的治疗策略用于治疗各种癌症。没有CD47导致吞噬T-cell-mediated适应性免疫针对CTLA和PD-1 [21]。最近的研究集中在中CD47,肿瘤细胞在免疫反应中发挥着关键作用[22- - - - - -24]。

除了免疫反应,CD47参与一系列的细胞过程,包括细胞凋亡、增殖、粘附、迁移。激活的CD47与增强癌细胞扩散通过P13K / Akt通路(25]。另一方面,激活CD47 TSP-1抑制增殖和抑制的干细胞转录因子的表达,如Sox2 Klf4, Oct4 [26]。CD47也会导致细胞死亡在正常和肿瘤细胞通过细胞凋亡或自噬。然而,CD47和自噬或衰老之间的关系有一个功能意义,这还不清楚。本研究报道,CD47是自噬和衰老的主要监管机构维护和编排msc的老化。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

的机构审查委员会MEDIPOST有限公司批准这项研究(mp - 2014 - 07 - 1 - 1)。文化UCB-MSCs,联合商业银行在血液收集袋含有柠檬酸磷酸葡萄糖腺嘌呤(CPDA-1),抗凝剂,在24小时内从母亲给了知情同意。人类单核细胞(跨国公司)与Ficoll-Hypaque隔绝的联合解决方案(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。孤立的跨国公司是悬浮在最低必不可少的媒介α(卡尔斯巴德Gibco大岛,纽约,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)和庆大霉素(Gibco) 37°C 5% 05年有限公司₂孵化器。媒介是改变每三天。不依从细胞被洗出介质的变化。贴壁细胞,msc、亚文化在70%的融合。细胞扩张进行了分析采用台盼蓝排斥法。雷帕霉素(10μM, Sigma-Aldrich),自噬的诱导物,也是对待UCB-MSCs(通道6,P6) 3 h。

2.2。流式细胞术和细胞表面与Lysoplates抗体筛查

检测CD47和干细胞的标记msc (P5) fluorescence-activated细胞进行排序。细胞分离和洗涤DPBS然后孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭人类CD47, CD14、CD45、CD146,和人类白细胞抗原(HLA)抗体博士(美国BD生物科学,圣地亚哥,CA)和藻红蛋白(PE)共轭人类CD49b CD73, CD166 CD274,表皮生长因子受体(EGFR;BD生物科学),CD90、CD105抗体(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 20分钟。同形像统计图控制还包括(27]。细胞被洗DPBS和4%多聚甲醛固定。MSC immunophenotypes流式细胞术测定在mac定量流式细胞分析仪(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国),和细胞表面抗原的表达计算10000年gated-cell事件。为筛选细胞表面标记, 细胞分离出两组(组1和2)分发到96孔圆底板块(BD Lysoplates, BD生物科学),这是冻干与242年人类细胞表面标记抗体。染色细胞被洗,随后沾一个Alexa萤石647 -共轭goat-anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(热费希尔科学,尤金,或者美国)。表面标记测量通过流式细胞术FACSCalibur仪器(BD生物科学)通过计算细胞每10000事件的百分比。

2.3。人类自噬数组

由人类自噬数组C1 Autophagy-related蛋白质含量进行了分析(美国GA RayBiotech, Norcross)使用20个不同的抗体。短暂2毫克细胞溶解产物孵化与抗体在4°C数组膜。后的第二天,反复洗涤物提供缓冲区进行。每个膜与生物素化的抗体孵化鸡尾酒2 h,紧随其后的是治疗HRP-Streptavidin 2 h。进一步洗涤后,膜被孵化与检测缓冲区和发现ChemiDoc成像系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。蛋白质阵列的强度是规范化与积极的控制。

2.4。SAβ加染色

使用一个衰老细胞衰老进行了分析β牛乳糖染色工具包(细胞信号技术、马、美国)。UCB-MSCs段落4、7和13汇合的70%。细胞被固定修复解决方案5分钟在rt与DPBS洗两次后,细胞被染色孵化工作48小时解决方案在37°C在黑暗中。细胞检测使用一个倒置显微镜(日本尼康)。染色细胞的平均百分比计算从四个字段。

2.5。西方墨点法

细胞细胞溶解与radioimmunoprecipitation分析缓冲区(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。总共15μg的每个蛋白质提取产物以钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶,然后转移到硝化纤维膜。屏蔽膜是孵化主要抗体(反Beclin1、反Atg5反Atg12,反phospho-p38 MAPK (Thr190 / Tyr182 pp38)和phospho-Rb (Ser780、复审委员会、细胞信号、丹弗斯马,美国);反LC3B (Sigma-Aldrich);反CD47(美国Abcam、剑桥、马);和反GAPDH(美国纪念,罗福斯生物有限公司))在一夜之间在4°C,然后用辣根探测peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。化学发光免疫印迹系统(通用电气医疗集团生命科学,白金汉郡,英国)被用来可视化和分析。

2.6。小核RNA)

细胞转染CD47小干扰rna (siRNAs)和炒核(100 nM, Dharmacon,拉斐特有限公司,美国)48 h使用DharmaFECT试剂根据制造商的建议。人类CD47 siRNA序列5 - - - - - -GCAUGGCCCUCUUCUGAUU-3 ,5 - - - - - -GUACAGCGAUUGGAUUAAC-3 ,5 - - - - - -CAGAGAAGGUGAAACGAUC-3 ,和5 - - - - - -UAACUGAAGUGAAGUGAUG-3合成了。小干扰rna序列5炒 - - - - - -UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ,5 - - - - - -UGGUUUACAUGUUGUGUGA-3 ,5 - - - - - -UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA-3合成了。

2.7。免疫细胞化学

检测CD47 LC3B,细胞被播种在两院的幻灯片。与PBS洗涤后,细胞被固定为4% PFA然后阻塞Triton x - 100年的0.1%。细胞被孵化主要CD47抗体(1:500年,Abcam)和二级抗体(anti-mouse Cy3-conjugated二级抗体,1:700年,杰克逊ImmunoResearch欧洲有限公司纽马克特,英国)。LC3B检测使用一只兔子主要单克隆抗体(1:1000年,Abcam)后跟一个anti-rabbit Alexa萤石®488(1:700年,ImmunoResearch欧洲有限公司)。图像使用LSM 800年收购共焦显微镜(蔡司、从、德国)。

2.8。统计分析

所有的数据都是呈现的 。统计分析与单向方差分析(方差分析)对以上两组实验图基紧随其后的HSD测试使用GraphPad棱镜(美国圣地亚哥,CA)。所有实验至少重复三次。数据被认为是具有统计学意义 。

3所示。结果

3.1。UCB-MSCs CD47影响细胞过程

确认细胞表面蛋白在衰老msc控制衰老的过程,242年人类细胞表面抗体筛查。我们先前的研究发现,黑素瘤细胞粘附分子(MCAM / CD146)在242年人类细胞表面标志物表达下调与长期体外扩张,与细胞衰老相关(26]。在衰老UCB-MSCs的筛选结果,细胞表面标记,CD47, CD146, CD49b, CD274,表皮生长因子受体,显示早期和晚期的段落之间的显著差异,有选择性地选择。增殖率UCB-MSCs (P5)在相同条件下测定在10个不同的MSC许多验证衰老状态的影响。msc的基本特征,如具备干细胞,干细胞表面标记(表确定S1)。msc被积极CD90、CD73 CD166和CD105 (≥85%)。CD14、CD45和HLA-DR MSC标记为负(≤1%)。分化能力是由ALPase染色和冯Kossa染色。

根据增殖率,UCB-MSC很多分为两组(组1、组2)。第二组有较高的累积人口翻倍(PD)通过5相比,组1(图1(一))。热图分析显示表达下调表面蛋白(CD47 CD146, CD49b、CD274和表皮生长因子受体)在组1(图1 (b))。流仪分析显示,只有CD146和CD47蛋白表达显著抑制组1,用更少的增殖能力。有显著差异CD47组1、组2(数据之间的水平1 (c)和1 (d))。评估衰老之间的细胞过程和自噬与autophagy-related蛋白进行免疫印迹,ATG5, ATG12 Beclin1, LC3B组(图1和21 (e))。同时,组1、组2显示,autophagy-related显著差异蛋白质。ATG5表达的增加,ATG12 Beclin1,和LC3B进行了分析,表明衰老细胞可能调节自噬活动通道。

3.2。CD47和细胞衰老之间的关系通过UCB-MSCs末

评价细胞衰老和细胞表面标记之间的关系CD47, CD47表达式分析了在组2段P13 P4。直到第七页,没有重大变化在msc CD47表达式。然而,CD47表达显著减少在段末,P13(图2(一个))。代表共焦显微图像CD47-positive细胞在段末(P13)显示显著降低CD47表达式( ,图2 (b))。总体而言,使的msc下调细胞表面CD47表达式。细胞生长的褶皱变化逐渐减少从P4 P13(图2 (c))。澄清一般细胞衰老过程、SAβ加活动期间监测使从P4、P7 P13。SAβ加阳性细胞逐渐增加P13 P4。P13,细胞衰老活性显著增加相比,早期的段落(P4和P7)(图2 (d))。此外,免疫印迹显示从P4 P13 CD47蛋白含量下降。复审委员会,一个伴随老化蛋白质,P13明显减少。相反,pp38,伴随老化的蛋白质,在P13显著增加( ,图2 (e))。总的来说,结果表明,UCB-MSC扩张增加衰老进程,符合表达下调CD47表达式。

3.3。之间的关系CD47,自噬通过UCB-MSCs末

CD47之间的相关性和自噬在文章末表型UCB-MSCs证实了免疫印迹LC3B autophagy-related标记和荧光染色法。评价自噬在使从P4 P13 UCB-MSCs, ATG5, ATG12 Beclin1, LC3B表达水平在P13 UCB-MSCs明显降低(图3(一个))。共焦显微镜图像显示明显LC3B-positive细胞密度减少,自噬体标记,在通道(图3 (b))。结果是符合表达下调UCB-MSCs autophagy-related标记的蛋白质含量。这些结果表明,衰老UCB-MSCs自噬较低,可降低CD47相关的表达式。

3.4。CD47击倒减少UCB-MSCs自噬和加速衰老

调查的角色CD47在自噬和衰老,细胞轮廓的CD47击倒UCB-MSCs和正常UCB-MSCs评估。细胞表面标记CD47,通道6,是沉默的。msc与100 nM转染CD47 siRNA或炒控制核48 h。CD47 siRNA治疗显著抑制CD47蛋白水平,通过流式细胞术结果(图所示4(一))。

人类自噬在LC3A数组结果显示显著差异和LC3B蛋白质含量之间爬控制siRNA-transfected和CD47 siRNA-transfected msc。60%的蛋白质含量LC3A LC3B, autophagy-related标记,在CD47 siRNA-treated msc表达下调。除了LC3A和LC3B、ATG3 ATG5, ATG7, ATG13, Beclin LAMP1, autophagy-related蛋白质,发现20%抑制CD47蛋白水平的封锁。图中所描绘的一样4 (b)和4 (c)、LC3A的显著变化和LC3B CD47 siRNA治疗后与CD47蛋白水平的改变。总的来说,CD47 UCB-MSCs减少自噬通过LC3A和LC3B击倒。

有趣的是,免疫印迹结果证明和pp38水平,伴随老化蛋白质,也受到CD47击倒。与小干扰rna转染CD47,蛋白质被抑制,而pp38蛋白水平揭示CD47 siRNA-transfected msc(图14倍增加4 (c))。相对褶皱的变化CD47,复审委员会、pp38 ATG5, ATG12, Beclin1, LC3B匆忙之间的显著差异,分析控制核和CD47 siRNA-transfected msc(图4 (d))。为了验证CD47细胞增殖的作用,CD47-transfected MSC数量在第五天了。表达下调CD47表达式也抑制UCB-MSC扩散(图4 (e))。代表immunofluorescent染色牵连LC3B和CD47之间的关系。LC3B-positive细胞明显减少,与CD47蛋白水平,与小干扰rna转染CD47(图4 (f))。因此,CD47可能影响LC3B表达式,积累自噬和触发器衰老年末UCB-MSCs的段落。

3.5。在UCB-MSCs CD47影响衰老

自噬在CD47通量siRNA-transfected UCB-MSCs估计处理的诱导物,雷帕霉素。自噬诱导期间使msc将LC3BI LC3II和诱发LC3B的增加。雷帕霉素,自噬的诱导物,间接抑制mTOR信号通路,它会使自噬溶酶体所需的负调节基因的转录功能。雷帕霉素诱导自噬的调节LC3BII表达式炒对照组(图5(一个))。然而,免疫印迹结果表明Beclin 1和小干扰rna转染组LC3B-II水平下调CD47增强雷帕霉素治疗。自噬流量测量,必须确定程度LC3BII lysosome-dependent地退化,多少LC3 puncta是由荧光染色法决定的。的数量的增加LC3 puncta幼稚细胞炒对照组中雷帕霉素的存在代表自噬小体的数量。LC3B招募自噬体形成点状的结构,显示的绿色。然而,CD47-transfected组显示数量减少的LC3B-positive puncta雷帕霉素(图的存在5 (b))。在一起,这些结果证明CD47通过LC3B-related溶酶体的关键调节自噬流量监管。

4所示。讨论

本研究证明CD47扩散的关键中介和自噬维持和控制MSC衰老。基于各种有益的功能,包括具备干细胞、分化潜能,旁分泌作用,低免疫原性、致瘤性,msc已经广泛应用于广泛的疾病细胞试验。获得足够的细胞数量足够的治疗效果,必须扩展msc在体外长期文化,其次是过早衰老。细胞衰老可能诱发不良临床结果通过逮捕生产增长和减少干细胞的能力。因此,msc的过早衰老是一个主要问题需要解决在细胞疗法取得更好的成果。

细胞表面标记被确定为质量控制指标选择功能msc、所显示以前的报告。我们的研究结果表明,表皮生长因子受体和CD49f蛋白表达的变化与细胞的大小有关msc (28]。CD142,此外,表面标记,包括CD264 CD274,已报告的新标记分离msc (29日- - - - - -31日]。这些标记可以用于质量控制干细胞表型特征注定治疗治疗。其中,CD264表面标记选择老化msc与捐赠者的实足年龄无关;细胞表达这种蛋白质展览senescence-associated增加β牛乳糖(SA)β加)活动和减少分化潜能和克隆形成CD264相比^{- - - - - -}msc (29日,32]。确认衰老细胞表面蛋白质msc控制老化过程,表面抗体筛查。之前发现黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM / CD146)在242年人类细胞表面标志物表达下调与长期体外扩张,与细胞衰老相关(27]。此外,表面标记CD47, CD49b CD274,和表皮生长因子受体选择性地选择,显示早期和晚期的段落之间的显著差异。验证5表面标记和增长率之间的关系,这些表面标记的蛋白质含量UCB-MSCs(早期阶段,P5)从10捐助者测量在相同的条件下,可分为两组CD47蛋白水平或增长潜力(1组和2组),特别是细胞组1已经停止增殖很快和观察到的速度衰老较低累积PD。显著降低CD47表达式也获得1组。总的来说,结果提供的证据CD47作为选择高增长的候选人表面标记细胞或晚衰老细胞。

自噬在维护生物能量学内稳态中发挥着关键作用通过调节分子间隙或细胞器营业额(33]。不稳定的自噬可以导致细胞死亡或细胞衰老。自噬逐渐下降与衰老细胞调制,导致效率损失的细胞(34]。有趣的是,自噬是必要的msc的生长和分化,自噬可以限制的差别表明对这些msc的治疗效果12]。因此,我们推测,自噬可能雇佣后衰老控制细胞生长或衰老处理在msc。衰老细胞识别和衰老表型特征,引发E2F-target基因的稳定的镇压和压抑一些促进增长的基因通过招聘视网膜母细胞瘤(Rb)肿瘤抑制或p38增殖作用(35,36),证明了结果p38和Rb的蛋白质含量。张等人表明,自噬在衰老中起着保护作用,自噬激活老化前有可能延缓衰老MSC。ROS /物/ p38机制在自噬通路中发挥着关键的调节作用和延迟衰老MSC (37]。自噬使用大量蛋白质和细胞器退化系统,是主要的自我平衡的细胞回收过程。三种类型的自噬过程包括以下:macroautophagy, microautophagy -,即使伴娘自噬。通常,macroautophagy被认为是自噬的主要形式。自噬是由double-membrane-bound结构称为自噬体(1,3,38]。

自噬通路分为几个阶段:起始,泡伸长,成熟、融合和退化39]。Beclin1,酵母的哺乳动物直接同源蛋白质ATG6,已经知道自噬起始步骤中发挥着至关重要的作用[40]。Beclin1扮演了一个角色在phosphoinositide-3激酶途径激活自噬空泡的形成(41]。几乎所有Atg5和Atg12相互共价结合和现在作为细胞内Atg12-Atg5共轭,形成蛋白质复合体的胞质(42]。的一小部分Atg12-Atg5 phagophore外一侧的复杂的目标,这是一个中间结构在泡伸长(43]。LC3B是autophagosomal直接同源的酵母蛋白质ATG8和自噬体的形成是一个特殊的标记(maturation-fusion-degradation) [44]。LC3BI本地化在细胞质中,而LC3BII结合自噬小体。自噬的刺激导致的接合LC3II [45]。LC3BII结合自噬小体,由溶酶体水解酶降解后自噬体与溶酶体的融合46]。最近的数据表明,额外的膜来源于高尔基氏体,线粒体和质膜(47];然而,这个过程还没有承认。在这项研究中,各种autophagy-specific标记(Beclin1, ATG5, ATG12、LC3BI LC3BII)通过自噬途径进行了分析。此外,进一步检查CD47之间的细胞机制的关系表达式和自噬,autophagy-associated蛋白质被测试两组(1组和2组)。这些组织显示,CD47表达显著差异在早期(P5),这表明经济增长可能控制自噬活动的能力。接下来,我们提供的证据表明,CD47表达显著抑制期间使P13 (P4)的msc在体外老化。同样,自噬通过msc表型明显降低。调查CD47自噬和衰老的作用,是验证CD47 siRNA-transfected msc表现出加速衰老表型。这些数据表明CD47是一种积极的监管机构自噬细胞衰老期间处理。

此外,CD47的直接作用在控制使用蛋白质阵列自噬激活了。LC3B蛋白质的60%水平,中心自噬通路中的蛋白,它在自噬功能基质选择和自噬体生物起源,被封锁在CD47 siRNA-transfected msc。除了ATG3, ATG5、ATG7 ATG13, Beclin1, LAMP1, autophagy-related蛋白质透露与CD47抑制抑制蛋白质含量20%。雷帕霉素,自噬的诱导物,间接抑制mTOR信号通路,减少自噬溶酶体所需的负调节基因的转录功能(48]。正如预期的那样,雷帕霉素LC3BII表达增加了诱导自噬在炒对照组。然而,结果CD47 siRNA-transfected组证明Beclin1的水平和LC3BII被雷帕霉素治疗激活。分析自噬流量,至关重要的是确定的程度LC3BII lysosome-dependent地退化,多少LC3 puncta与免疫染色了。数增加的LC3 puncta对照组中雷帕霉素的存在代表自噬小体的数量,而CD47核组显示更少的LC3B-positive puncta雷帕霉素的存在。这些结果证明CD47通过LC3B-related溶酶体的关键调节自噬流量监管。集体,这些数据表明CD47可以是一个有用的候选标记预测msc的衰老状态或良好的增长。

事实上,结果表明CD47控制MSC增长中所起的作用,并抑制CD47下调MSC的衰老过程。此外,CD47导致细胞死亡在正常和肿瘤细胞通过自噬。例如,调节自噬的CD47也报道的模型横向主缢痕暴露左心室心力衰竭,这表明CD47的存在可以提高自噬在受伤的条件下心肌常会表达也增加(49]。重要的是,这项研究表明,导致差别CD47对这些自噬蛋白质含量下降。因此,这些数据提供了新的证据直接表明,自噬是下游的目标CD47 msc在细胞衰老的发展。在这里,我们看到一个小说CD47之间的相关性和自噬在衰老msc。获得足够数量的功能细胞,细胞衰老,不可避免地引起长期的文化,必须评估治疗标记。CD47,细胞表面标记,可以是一个有用的预测细胞衰老的标志和应用潜力的质量控制评估MSC-based疗法。然而,进一步的研究正在进行中,需要澄清下游通路中被CD47理解的积极调节自噬细胞衰老。

5。结论

CD47表达显著减少在MSC在体外扩张,增强加速衰老表型差别CD47对这些基因,细胞生长的影响。总的来说,这些数据表明CD47衰老是一个关键的球员在自噬和维护和编排MSC增长。总的来说,这些结果表明,CD47是一种新型的质量控制指标预测衰老或选择好msc和可能有价值的增长质量控制评估和增强MSC-based疗法的治疗效果。

数据可用性

生成的数据集在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者没有竞争的经济利益要申报的东西。

作者的贡献

Gee-Hye金正日和云Kyung Bae的贡献同样这项工作。

确认

这项研究受到了韩国卫生技术研发项目的资助通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI),由卫生部&福利,大韩民国(批准号:HI12C1821)。

补充材料

表S1: msc的特征。(补充材料)

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