mir - 302 d竞争性结合lncrna - 341的目标TLE4 SSC的过程中生成

文摘

小分子核糖核酸(microrna)家禽生殖过程的至关重要因素。在这里,我们发现mir - 302 d是一个潜在的鸡胚胎干细胞的分化和负面因素(的ESCs) spermatogonia干细胞(精原细胞)。竞争机制进行了初步探索确定关系mir - 302 d, lncrna - 341 (mir - 302 d进行互动),和目标基因TLE4。结果表明,lncrna - 341能竞争性结合mir - 302 d降低目标绑定mir - 302 d和TLE4促进鸡精原细胞的分化。此外,建议mir - 302 d通过TLE4 Wnt信号通路可能参与。

1。介绍

鸡的繁殖性能生产受到许多因素的影响,和遗传育种是最重要的因素之一。如何利用遗传改良,增加生产的鸡育种方向,许多学者都致力于。同时,在现代商业生产,人工授精技术(AI)已经取代了自然和人工辅助交配,大大提高了生产效率,适应现代化的发展;因此,如何有效地获得公鸡的男性生殖细胞已成为关键技术之一。

microrna构成一个内生的小RNA的长度约22元,广泛存在于人类,动物,植物,和病毒。成熟的microrna不参与蛋白质的编码,但它是一个重要的基因调节因子参与众多领域。microrna的一般实现由降解目标mRNA转录后的调控或阻塞的翻译目标mRNA影响发展,如在心血管形成(1,神经系统发育2干细胞分化[],3,细胞凋亡4),和肿瘤形成5]。

许多报道关于microrna在哺乳动物生殖细胞在性腺的性别决定中扮演重要角色,男性生殖干细胞减数分裂,精原细胞分化等方面。费尔南德斯的microrna的表达模式分析雄性和雌性老鼠胚胎原始生殖细胞(包括),以及性腺的细胞(6),发现差异表达的监管mir - 199 - 214, mir - 182 - 183 - 96, miR-34c-5p和其他关键microrna的集群在性腺的性别决定都有明确的作用。刘发现miR-34c可能调节男性生殖干细胞的减数分裂牛奶山羊和抑制其增殖的7]。microrna的也可以配合相关信号通路调节生殖细胞的生产。这个名为Hiromitsu RNA-seq数据进行分析,以确定具体的microrna (mir - 741 - 3 - p, mir - 871 - 3 - p,和mir - 880 - 3 - p)对小鼠生殖细胞,是连续的和X染色体上相互毗邻8)称为XmiRs (X护理联系microrna的)。mir - 871和mir - 880与WNT /β-连环蛋白信号通路调节睾丸生殖细胞的发生。福等人发现miR-31-5p调节扩散(9)、DNA合成和细胞凋亡的人类细胞通过pak1-jazf1-cyclin A2通路。

然而,鸟类microrna的函数的具体机制还没有完全理解它如何调节生殖细胞发展;因此,仍有许多关键的microrna在家禽生殖细胞被发现和探索。因此,仍有很多空白microrna的调节研究鸟类雄性生殖细胞的分化。

我们实验室的初步工作,建立了系统ESCs诱导分化的精原细胞在体外RA(视黄酸),一直致力于提高感应这一过程的效率。因此,我们需要探索的重要监管因素在这一过程中,执行RNA-seq在以往的研究中,和微分mir - 302 d被筛选出来。在这项研究中,mir - 302 d的功能和目标基因被证实在活的有机体内和在体外,对Wnt信号通路的影响也已初步探索。龙头、竞争机制也初步探索microrna的确定关系,lncRNA,目标基因的相互作用。本研究填补了缺口的microrna在调节鸟类雄性生殖细胞的分化,改善生殖建模效率。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

ESCs在特定的日子(第0天,第四天,第十天)RA诱导的收集,和RNA序列。根据RNA-seq数据微分microrna筛选( 筛选的标准)。mir - 302 d,在生殖细胞分化起着重要的作用,被确认为研究对象。的目标基因gga - mir - 302 d(称为mir - 302 - d)进行了分析和筛选网上bioprediction软件:http://www.targetscan.org/vert_71/ (Targetscan);http://www.mirdb.org/ (miRDB);我们进行了维恩的筛查结果分析这两个数据库,确定四个共同目标基因。lncRNA成绩单是由外显子筛选筛选数量、长度检查,注释筛查,表达量检查,和编码的潜在筛选CNCI (Coding-Non-Coding指数),中国共产党(编码潜在的计算器),包含了(pfamscan),等等,lncRNA和mir - 302 d交互分析在线bioprediction软件:http://www.mirbase.org/ (miRBase)。

2.2。向量构造

mir - 302 d慢病毒表达载体和干扰向量由Genomeditech提供公司(上海,中国)。表达载体被评为mir - 302 d模仿,名叫miRNA-inhibitor和干扰向量。序列支持表中列出1和表2。TLE4 3的施工方法UTR野生型及突变pMIR-REPORT向量参考向量系统协议。pMIR-REPORT向量购买从应用生物系统公司(http://www.appliedbiosystems.com)。序列支持表中列出s8。

2.3。ESC隔离和感应文化

ESCs分离得到新鲜的受精卵(如前所述)(10,11]。ESCs被诱导介质包含10⁵mol / L RA,病毒的效价 D0感应。每2天,观察细胞形态和细胞收集从第0天、第四天,收集细胞RNA和第十天,第四天,第十天的免疫荧光(如果)和流式细胞术(FCM)。每治疗30鸡蛋3独立重复实验。

2.4。胚胎注射实验

为2.5天,当鸡胚发育正常的钝端与70%乙醇消毒,和胚胎了显微镜下注射到血管。每个胚胎被注射 病毒稀释剂2μL。注射后,20μL 1%的青霉素和链霉素投进注射部位,用医用胶带密封,在正常条件下孵化。胚胎生殖山脊在4.5天,收集和睾丸分离18.5天后孵化RNA,周期性Acid-Schiff染色(PAS), FCM、免疫印迹等测试。

2.5。荧光素酶报告实验

DF-1细胞与pMIR-REPORT cotransfected™重组质粒和pRL-TK比10:1。24小时后,删除旧的媒介,与PBS洗,加入胰蛋白酶消化,collec细胞。细胞被暂停1×被动裂解缓冲和进入96 -孔不透明/轮底部,enzyme-labeled盘子。萤火虫荧光素酶测定基质添加之前读者分析酶荧光值的决心。阻止进一步的荧光值的缓冲区添加相应的肾脏。具体操作,请参考说明Promega双荧光素酶报告实验设备的公司。最后,萤火虫的相对荧光活动价值/肾值的计算。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

使用试剂盒提取总rna, FastQuant RT工具包(gDNase),和SuperReal预混料+ (SYBR绿色)(TIANGEN北京)。7500中存在仪器系统从应用生物系统公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)其次是使用Microsoft Excel软件对数据进行分析相对量化方法。

2.7。免疫荧光(如果)

细胞被固定为4%甲醛在室温下10分钟(RT)和PBS洗3次5分钟,特里同x - 100 10分钟0.1% RT,阻止了60分钟1% BSA在RT,孵化在初级抗体在一夜之间解决方案在4°C, rabbit-CVH(稀释浓度1:400),mouse-ITGβ1(1):500)(从Abcam,剑桥,英国),洗3次与PBS 5分钟,孵化在二级抗体解决方案2小时在黑暗中,RT山羊anti-rabbit免疫球蛋白(TRITC贴上,1:1000),山羊anti-mouse免疫球蛋白(TRITC贴上,1:2000)(从Abcam,剑桥,英国)和PBS洗3次,与DAPI染色,持续15分钟。与荧光显微镜图像被抓获。

2.8。流式细胞术(FCM)

细胞和抗体染色CVH,评估PGC-related基因表达的变化。评估SSC-related基因表达水平,与ITG细胞被染色β1(从Abcam,剑桥,英国)。样品被BD流式细胞仪分析咏叹调流式细胞分析仪(BD生物科学,扬州大学测试中心提供的)。

2.9。PAS染色

胚胎固定之前执行与不同的乙醇浓度梯度脱水。胚胎与二甲苯进一步使透明,沉浸在石蜡,用石蜡和嵌入。石蜡切片与二甲苯脱蜡、水化不同乙醇浓度,然后沾PAS染色工具包(Solarbio,北京)根据制造商的指示。在我们之前的文章中可以找到更多的细节(10]。

2.10。统计分析

组之间的差异检查使用学生的统计学意义 - - - - - -测试或单向方差分析。值< 0.05被认为是重要的,值< 0.01被认为是极其重要的。

3所示。结果

3.1。筛选microrna - 302 d在RA-Induced ESC分化成细胞

探索的microrna RA-induced ESC分化成细胞,ESCs, ESCs和精原细胞,与RA治疗10天。细胞RNA序列的处理。发现的microrna涉及分化过程分为四类(数据1(一)和1 (b))。识别特定群体参与SSC分化,去分析,我们发现的microrna Cluster1可以大大丰富了相关项目的生殖细胞(图发展1 (c))。与其他组相比,microrna在Cluster1主要参与细胞的形成。进一步阐明microrna的功能在不同的团体,我们进行了KEGG通路富集分析。我们发现的microrna Cluster1显著富集的SSC形成相关的信号通路,如Wnt信号通路(12),JAK-STAT信号通路(13),和MAPK信号通路14)(图1 (d)),显示在四个microrna的集群,microrna在Cluster1更有可能参与SSC形成过程。与此同时,我们发现这些信号通路是由miRNA302d目标基因。ESCs miRNA302d的存在表明,表达高于精原细胞(图1 (e)),这表明miRNA302d SSC形成起着重要的作用。

3.2。mir - 302 d抑制鸡ESCs的分化细胞

进一步确定microrna - 302 d的作用在调节ESC分化成细胞,我们也使用RA诱导系统可能诱导ESC分化成细胞。每2天,我们观察到细胞形态学和标记基因被发现在胚胎的身体(EBs)和(图SSC-like细胞的形成2(一个))。EBs以来出现在第四天,SSC-like细胞出现在第十天在体外这两个时间点,我们选择。简要描述:我们对待ESCs microrna - 302 d抑制剂或microrna - 302 d模拟和测量基因表达。EBs抑制剂组明显超过其他群体,但模仿组(图显示了相反的结果2 (b))。生殖标记基因的表达在细胞治疗显著增加microrna - 302 d抑制剂和减少细胞处理microrna - 302 d模仿(图2 (c)、表s1)。如果,模仿组标记蛋白质的表达减少,而在抑制剂组增加(图3(一个))。流式细胞仪(FCM)分析表明,模拟组的阳性细胞率明显低于对照组,而抑制剂组与对照组相比没有显著差异,但有一个上升趋势(图3 (b))。上述结果表明,mir - 302 d抑制鸡ESCs的分化细胞体外。

然后注入microrna - 302 d抑制剂或microrna - 302 d模拟病毒到2.5天的鸡胚胎血管(图4(一))。4.5天的鸡胚对保护区的收获。生殖器山脊观察正常和发达。抑制剂组包括数量的增加和减少模拟组与对照组相比(图4 (b))。我们收获4.5天的生殖器山脊和18.5天的睾丸和检查reproduction-related基因的mRNA的表达cvh,c - kit,整合素α6,integrinβ1。mirna - 302 d模拟显著抑制这些标记基因的表达(图4 (c)、表s2)。同样,FCM表明marker-protein-positive细胞的数量在模仿组明显低于对照组(图4 (d))。上述结果表明,mir - 302 d在鸡对SSC分化有抑制作用。

3.3。mir - 302 d可以绑定到3UTR TLE4及调控其表达的目标基因

根据gga - mir - 302 d (MIMAT0003360)序列,UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUU,我们使用多个在线生物软件来分析目标基因,并按成绩排序(图5(一个))。其中,确定了四种常见目标基因:MYT1L,ELAVL2,TLE4,HLF(表s3)。TLE4,96分的最高目标,是一个维护的目标基因干细胞多能性。我们推测它可能扮演重要的角色在鸡SSC分化的过程。因此,我们进行了有针对性的验证TLE4。

根据表达谱结果(图5 (b)),mir - 302 d和TLE4ESCs显示相反的表达趋势、热解色谱和精原细胞。mir - 302 d ESCs表达最高,但TLE4表达更多的精原细胞比ESCs和热解色谱。在dual-luciferase报告分析(图5 (c))。结果表明,mir - 302 d抑制TLE4 mRNA的表达,但当mir - 302 d的结合位点TLE4被删除,减少mir - 302 d的绑定和TLE4和弥补的抑制TLE4信使rna表达。总之,TLE4 mir - 302 d的目标基因,和mir - 302 d抑制其表达。

3.4。TLE4促进鸡精原细胞的分化

我们检查的功能TLE4在体外,在体外和在活的有机体内。我们对待ESCs病毒表达和抑制。然后我们观察细胞形态学每两天,标记基因检测。EBs在过度(OE)组明显比其他组(图6(一))。中存在的结果还表明,OE组标记基因的表达显著高于其他组,而SH组显著下调(图6 (b)、表s4)。如果,标记蛋白的表达在SH组减少,虽然这个OE组增加(图7(一))。FCM表明CVh的数量⁺和整合素⁺细胞SH组明显低于对照组和OE集团虽然OE组显著高于对照组10天(图7 (b))。上述结果表明,TLE4促进鸡的ESCs的分化成精原细胞在体外。

我们收获4.5天的鸡胚PAS染色。高倍镜下,包括增加OE组和减少SH组与对照组相比(图8(一个))。我们reproduction-related基因的mRNA表达检测,结果表明,SH组显著地抑制标记基因的表达,而OE集团提升表达式(图8 (b)),是显示在表中存在数据s5。同样,FCM显示的速度marker-protein-positive细胞SH组明显低于OE组(图8 (c))。上述结果表明,TLE4在鸡SSC分化有积极的影响。

3.5。mir - 302 d可以影响节点基因的表达直接或间接相互作用TLE4 Wnt信号通路

它已被证明TLE4扮演着一个重要的角色在生殖细胞分化相关的信号通路15]。蛋白表达在特定的节点Wnt通路已经被证明在老鼠身上直接或间接绑定到TLE4蛋白(15- - - - - -17]。探索mir - 302 d能否目标TLE4和影响节点信号通路中的基因的表达,选择相关节点基因在Wnt信号进行分析,包括Tcf,中位数,β-catenin,Axin1,Apc。

为期4天,10天的细胞被收集和分析mRNA和蛋白表达涉及mir - 302 d功能验证体外。在第四天,的表达中位数和β-catenin显著调节mir - 302 d模拟组与对照组相比,Apc明显下调模仿组与对照组相比,然后呢Tcf和Axin1没有显著差异(图9(一个);表s6)。免疫印迹显示的表达β连环蛋白模拟组比对照组(图9 (e))。10天,Tcf,中位数,β-catenin明显调节抑制剂组与对照组相比,但Axin1和Apc没有显著差异(图9 (b);表s6)。免疫印迹试验表明的表达β连环蛋白模拟组远低于控制(图9 (f))。

体内,胚胎生殖山脊收获中存在测试4.5天,Tcf,中位数,β-catenin,Axin1明显下调抑制剂组与对照组相比,但Apc没有显著差异(图9 (c);表s7)。免疫印迹分析显示β连环蛋白表达抑制剂组低于对照组(图9 (e))。睾丸在收获中存在测试18.5天;Tcf,中位数,β-catenin明显调节抑制剂组与对照组相比,但Axin1和Apc没有显著差异(图9 (d);表s7)。免疫印迹分析显示的表达β连环蛋白模拟组低于控制(图9 (f))。因此,mir - 302 d可以影响节点基因的表达直接或间接相互作用TLE4 Wnt信号通路,mir - 302 d的超表达的表达中位数,β-catenin,Axin1,Tcf波动在ESCs的分化的细胞。

3.6。lncrna mir - 302 d - 341与TLE4绑定目标基因

经过进一步RNA-seq数据库分析,发现共有269 lncRNAs与mir - 302 d的差别,对这些基因的表达(图S1A)。我们预测,分别分析了这269 lncRNAs,发现两个lncRNAs互动mir - 302 d: lncrna - 341和lncrna - 1784(图印地)。我们验证这两个lncRNAs和没有发现差异表达的趋势lncrna ESCs - 1784之间,包括,精原细胞。趋势lncrna - 341表达的差别,对这些的ESCs之间,包括,精原细胞与测序结果是一致的,表明lncrna - 1784表达的调控机制可能不一致的在体内和体外实验。因此,我们选择lncrna - 341作进一步调查。

ESCs lncRNA -341显著下调,包括细胞,符合时间体外(图的趋势9 (g))。进一步阐明如果lncrna - 341可能影响目标的监管TLE4 mir - 302 d,我们进行了一次lncrna - 341表达载体cotransfected,分别,mir - 302 d模拟和TLE4 double-luciferase记者向量系统。双荧光素酶报告中分析,两组设置。3UTR -wt-miR-lnc341组相比显著调节3UTR-wt-miR组(图9 (h))。结合前面mir - 302 d绑定目标基因的3UTR实验分析,结果表明,lncrna - 341可以绑定mir - 302 d和阻断其目标绑定TLE4,因此移植TLE4表达式。

4所示。讨论

在过去的几十年里,鸡被广泛用作模型动物在两个商业育种和科学研究,导致全球家禽业的发展和为基础研究提供丰富的信息。提高质量和生产率的男性生殖细胞能给商业生产带来巨大的好处,可以广泛应用于其他物种,包括人类。尽管许多研究已经表明RA可以引起不同的干细胞捐赠者分化成精原细胞在体外(18,19),效率不稳定是由于不同的文化和感应系统。男性生殖细胞生产的监管机制是复杂的,呈现这一挑战收获诱导雄性生殖细胞与高纯度和质量不断体外,这使得它很难应用于实际生产。在先前的研究中,我们发现许多关键基因,这可能是受一些非编码rna,如lncRNA和microrna。因此,有必要探索这些因素,描述机制和潜在的诱导效率的提高。

众所周知,KIT受体表达在精子形成过程中被激活。在小鼠未分化的精原细胞,miR-221/222聚集在X染色体的功能损害将转换工具包^{- - - - - -}对装备⁺并导致精子在干细胞再生能力的损失20.]。在精原细胞,工具包信使rna和蛋白质丰度是影响miR-221/222,尽管RA可以减少miR-221/222丰富诱导未分化的精原细胞工具包⁺。然而,过度的miR-221/222抑制RA诱导的过程,导致体内的精原细胞分化的能力,表明miR-221/222起到了至关重要的作用在维护哺乳动物精原细胞的未分化状态通过抑制工具包的表达。除了生殖细胞分化,大部分mir - 302家庭成员有关哺乳动物乳腺癌[21),生殖细胞癌(22),DNA损伤(23),而成纤维细胞分化[24]。这些研究表明,mir - 302家庭有很高的特异性或分化哺乳动物的ESCs的表达模式,是符合我们鸡RNA-seq数据显示了不同的高表达在鸡的ESCs mir - 302 d。少量的研究也表明,gga - mir - 181 - 5 - p, gga - mir - 2127, gga-miR-302/367集群发挥主导作用在禽流感扩散的规定原始生殖细胞(25]。gga - mir - 302 b和gga-miR-17-5p可以调节磷酸葡萄糖异构酶的扩散并影响热解色谱(26]这表明mir - 302 d可能扮演重要的角色在鸡男性生殖细胞的分化。在这项研究中,我们的结果证实了这一假说,mir - 302 d可以抑制分化的ESCs的精原细胞在体内和体外都和lncrna - 341与mir - 302 d可以减少目标绑定mir - 302 d和TLE4之间(图10),并针对监管的TLE4 mir - 302 d可以影响关键基因的表达在切口和Wnt信号通路。

然而,由于复杂的本质mir - 302 d的监管网络,尽管我们已经初步验证了lncrna - 341 - mir302 tle4关系是否受其他因素影响需要进一步探索。例如,RNA下拉可以用来检测是否涉及其他蛋白质监管机构。进一步探索必须阐明监管网络。总的来说,miRNA302d扮演重要的角色在鸡男性生殖细胞的分化,是一个重要的调节因子。

数据可用性

(数据类型)的数据用于支持本研究的结果中包括文章和补充信息文件(s)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

同样有张和文汇张了这项工作。

确认

这项工作是支持的关键研究和发展项目(2017 yfe0108000);江苏省研究生创新研究与实践项目(XKYCX18_100);扬州大学国际学术交流基金;国际联合研究实验室的安徽省农业和农产品安全的中国教育部,扬州大学;江苏省六大人才高峰计划;江苏科技项目(青年基金:BK20180918);自然科学研究项目和江苏省高等教育机构(18 kjb230008)。

补充材料

表s1:存在mir - 302 d函数的数据验证体外。s2:表中存在mir - 302 d函数的数据验证体内。表s3:大量的候选基因。表s4:存在体外TLE4功能验证的数据。表s5:存在体内TLE4功能验证的数据。表s6: Wnt信号途径中存在数据验证体外。表s7: Wnt信号途径中存在数据验证体内。表s8: TLE4 3的顺序UTR。图S1: lncRNA筛选和分析。269,lncRNAs与mir - 302 d的差别,对这些基因的表达。B、信息两个lncRNAs与mir - 302 d, lncrna - 341和lncrna - 1784。(补充材料)

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