Mettl3介导的m^6.RNA改性调节角膜损伤修复

摘要

恒星干细胞对于连续的角膜再生和损伤修复至关重要。MetT13催化的N6-甲基腺苷（m^6.A) mRNA修饰参与了许多生物学过程，并在干细胞再生中发挥特定的作用，而m^6.角膜损伤修复的修改仍然未知。在这项研究中，我们生成了一个突然干细胞特异性MetT13敲除鼠标模型，并研究了M的作用^6.修复碱烧伤引起的角膜损伤。结果表明，在角膜缘干细胞中敲除metttl3可促进体内细胞增殖和迁移，导致角膜损伤的快速修复。此外,米^6.修饰谱鉴定干细胞调控因子AHNAK和DDIT4为m^6.一个目标。我们的研究揭示了m的基本功能^6.RNA修饰在调节损伤修复中的作用，为角膜疾病的临床治疗提供了新的见解。

1.介绍

角膜的完整性和功能依赖于角膜上皮的自我更新性质。角膜缘位于角膜，结膜和巩膜的交界处。正常的角膜上皮细胞和结膜上皮脚卵细胞源自止血性干细胞[1］．峰值干细胞的误解往往导致视觉缺陷，并且肢体干细胞再生的调节是治疗眼部疾病的有希望的策略[2那3.］．角膜缘干细胞维持角膜的生理和生物化学，调节其营养、免疫反应和完整性。角蛋白14 (Keratin 14, K14)是角膜缘干细胞的标志^recer.从角膜缘向心迁移到角膜中央。干细胞命运的决定取决于来自生态位的细胞外信号与细胞内信号级联和转录程序的相互作用[4.］．因此，研究扩散，分化和止血杆菌细胞的调节机制可以提供新的方法和洞察治疗各种眼部疾病的角膜缺陷。

MetT13（甲基转移酶如3，也称为MTA70）最初鉴定为负责M的甲基转移酶^6.信使rna的修饰[5.］．METTL3-mediated米^6.修饰调节多个mRNA处理事件，包括剪接、输出、翻译和稳定性[6.］．生理上,米^6.调控不当与发育性疾病和DNA损伤修复密切相关[7.-9.］．我们团体和其他人的研究揭示了m^6.通过NANOG, SOX2, NR5A2和MYC修饰影响胚胎干细胞和不同组织祖细胞的干细胞命运决定[7.-9.］．此外，MetT13的敲低显着延迟了紫外线响应性DNA损伤修复[10.］．尽管越来越高的升值^6.mRNA改性途径的生物学意义，何种方法和机制^6.A可能调节止血干细胞，角膜损伤修复仍然明白很差[11.-13.］．

在这项研究中，我们建立了一个肢体干细胞特异性MetT13敲除鼠标模型。我们调查了MetT3介导的M的作用^6.碱燃烧模型对角膜损伤修复调控的修饰。我们的研究确定了METT3作为角膜损伤修复的关键因素，并提出了MetT13和M的操纵^6.这种改良可能是治疗角膜疾病的一种有前途的治疗策略。

2.材料和方法

2.1。材料

兔子反Mettl3.(Abcam, ab195352)和小鼠抗细胞角蛋白14 (Abcam, ab7800)抗体。使用小鼠抗ki67 (Therm)、兔抗细胞角蛋白10 (Abcam, ab76318)、抗细胞角蛋白5 (ab53121, Abcam)、抗细胞角蛋白1 (ab93652, Abcam)和抗cd31 (bs-20322R, Bioss)抗体。PAS染色试剂盒(G1008-100, Xiangbo)， H&E染色试剂盒(G1120-100, Solarbio)，免疫组化试剂盒(SA102, Boster)， OCT冷冻切片包封剂(4583,OCT)， AHNAK抗体(sc-390743, Santa Cruz Biotechnology)， REDD1抗体(10638-1-AP, protetech)， GAPDH抗体(60004-1-Ig，蛋白技术)在本研究中使用。

2．2.metttl3敲除小鼠模型

Mettl3.^{fl / wt}如前所述产生小鼠。Mettl3.^{fl / wt}小鼠与K14交叉^recer.小鼠获得K14^克里尔/ Mettl3^{FL / FL.}（CKO）小鼠。用他莫昔芬注射MetT13 CKO和对照小鼠，然后进行角膜碱烧伤处理。右眼是实验的眼睛，左眼是对照眼睛。在损伤后24小时，7天，14天，35天和56天处死小鼠。从每个时期取六只小鼠。两只眼睛都被除去，在OCT冷冻（ )，固定在4％多聚甲醛，并嵌入常规石蜡中（ )．

2．3.碱烧伤模型

三溴乙醇12-14 μL /g经腹腔注射全身麻醉。局部麻醉时，在右眼加Erkain滴眼液。10分钟后，用棉签拭除结膜囊内多余液体;左眼用甲基纤维素维持眼表湿润。小鼠完全麻醉后，置于微操作平台上平卧位。将直径为2mm的圆形滤纸浸入1 mol/L氢氧化钠溶液中10 s，用眼科微镊子取出。用干纱布擦去多余的液体，然后将滤纸置于小鼠角膜中央15 s。取下滤纸后，立即用生理盐水冲洗眼睛10分钟，在小鼠右眼涂抹红霉素眼药膏。

2．4．角膜荧光素染色评估

一滴生理盐水用于湿荧光素钠试纸，10 μ将L荧光素钠滴入小鼠角膜中心，使荧光素钠进入角膜损伤部位。这些老鼠被要求眨眼三次，以使它们的眼睛充满荧光素钠。用棉签在结膜囊处拭去多余的荧光素钠染色液。在显微镜下用钴蓝光观察角膜并拍照。角膜被均匀地分成4个象限。分别对各象限进行评分后，相加得到角膜荧光素钠染色评分。各象限评分方法如下:无染色为0分;少量染色点，但少于30个点，分配1分;点状染色的点数大于30，但没有片状或阻断染色分配2点;弥漫性片状或块状染色分为3点。

2.5。苏木精 - 曙红染色

小鼠组织用4%多聚甲醛(中国上海圣工)固定，清洗，脱水，透明，浸蜡，切片。干燥后的切片浸泡在含有二甲苯I和二甲苯II的染色容器中进行脱蜡。切片依次浸入不同浓度的酒精、双蒸馏水(用于水合作用)、HE染色、脱水和密封。制备的组织切片在光学显微镜下观察，用显微成像系统拍照。

2.6。免疫荧光染色

切片脱蜡后进行抗原修复法，PBS冲洗3次。用5%正常山羊血清在室温下封闭1小时，然后用一抗在4℃下孵育过夜。PBS洗涤后，切片与合适的二抗在室温下孵育1小时。切片用DAPI (Beyotime，海门，中国江苏)染色15分钟，PBS冲洗3次5分钟后，在荧光显微镜(Olympus/BX51)下观察。对于双免疫荧光，切片用成对的一抗和二抗连续孵育。切片在荧光显微镜下(Olympus/BX51，东京，日本)检查。利用ImageJ评估Ki67、K14、K5、K10、K1、CD31的荧光强度。

2.7。PAS染色结膜脚卷细胞

作为PAS染色方法的定期酸无色品红色染色是常用于在石蜡截面技术中检测中性粘液的染色方法之一。通过PAS染色（PAS染色试剂盒）可以观察结膜脚卵细胞的密度和分布。

2.8。RNA-seq

用三粒萃取总RNA，并用纳米光计和Agilent 2100生物分析仪评估。使用Illumina的NebNext，UltraTRM RNA库预备套件制备测序文库。构建图书馆后，使用qubit2.0荧光计用于初步定量，其在稀释至1.5 ng /的文库上进行。μl.使用Agilent 2100 BioAnalyzer检测文库插入大小，文库验证后进行Illumina测序。参考基因组和基因模型注释直接从genome网站下载。利用HISAT2 V2.0.5构建参考基因组指数，并利用HISAT2 V2.0.5与参考基因组比对配对端clean reads。

2.9。MeRIP-seq

总RNA（500 ng-20 μg）用三苯醇提取。可以使用最新的RRNA去除技术同时检测mRNA，LNCRNA和CircrRNA的甲基化改性光谱。FASTQC用于分析测序数据质量以获得诸如测序质量分布，基础内容分布和重复测序片段率的信息。本研究使用HISAT2软件与HG38参考基因组比较过滤的有效测序数据，然后计算比较率。分析m的一个重要步骤^6.通过峰值呼叫的A水平是使用外显子组峰值数据的标准质量测试。基于已识别的m^6.一个峰，一个元基因图被绘制出来。采用HOMER软件对峰进行motif分析。带有m的基因^6.根据GO数据库中的生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)，用基因本体论(GO)对分析得到的修饰进行注释。Fisher检验计算了显著性水平(值)，以筛选出有意义的项。在select m上进行路径注释^6.基于KEGG数据库的基因。Fisher检验计算了显著性水平(值)筛选具有m^6.一个修改。

2.10。RT-QPCR.

用TRIzol提取总RNA。从1μg总RNA by Roche 11483188001试剂盒定量pcr (qPCR)采用KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix with 2μ引物500 nMμl.反应开始于95°C初始变性10分钟。45个循环:95°C 10 s, 60°C 30 s, 72°C 15 s。运行熔化曲线来检测所需的放大器。用ECO Real-time PCR仪(Illumina)验证扩增子大小。管家基因β-actin用于归一化。qPCR引物为metttl3 (F: TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT and R: ccagatcagaggtggtgtag)、DDIT4 (F: TGAGGATGAACACTTGTGTGC and R: CCAACTGGCTAGGCATCAGC)、AHNAK (F: TACCCTTCCTAAGGCTGACATT and R: TTGGACCCTTGAGTTTTGCAT)和β-actin (F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC和R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT)。

2.11。免疫印迹

蛋白经12% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜(Immobilon)上。一抗(1:20 00)在4°C孵育过夜后，使用二抗AHNAK (sc-390743, Santa Cruz Biotechnology)、REDD1 (10638-1-AP, Proteintech)或GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech)(1:20 00)和ECL检测试剂盒(Immobilon)对靶蛋白进行成像。

2.12。统计分析

数据表示为 标准误差(SE)。所有统计分析均使用Excel或GraphPad软件进行。意义被设定为 那 那 那和 由双尾学生评估 -方差的检验或单向分析。

3.结果

3．1.metttl3敲除促进角膜损伤修复

我们首先使用角膜缘干细胞特异性metttl3条件敲除小鼠建立碱烧伤模型(图)1（a）和1（b）)研究mettl3介导的m^6.角膜缘干细胞功能调节与角膜损伤修复的改变。角蛋白14 (K14)和METTL3免疫荧光染色证实角蛋白14阳性细胞中METTL3缺失(图)1（c）和1 (d))．建立碱烧伤模型，采用荧光素钠不同时间处理metttl3 cKO小鼠和野生型小鼠。通过小鼠角膜细胞层的荧光素钠染色，我们发现损伤后一天，WT小鼠的眼睛出现了广泛的弥漫性斑片染色，说明角膜损伤导致排除染料渗透功能缺陷。第7天和第14天染色强度下降，但仍能在眼内检测到明显的荧光素钠染色。第56天，可见少量荧光素钠染色，说明角膜功能已成功恢复，排除了荧光素钠。有趣的是，在角膜干细胞中敲除metttl3可以更快地恢复眼功能，排除荧光素钠，提示metttl3的缺失促进了碱烧伤模型的角膜损伤修复(图)1 (e))．

在损伤后不同时间点，观察野生型小鼠与metttl3 cKO小鼠的表型差异(图)1 (f))．第1天，WT和cKO小鼠的角膜上皮细胞层和前弹力层均被碱烧伤破坏，角膜基质层排列疏松。损伤后7天，WT小鼠的角膜上皮层基本恢复;角膜基底层仍松散排列;大部分新生血管排列整齐、致密;血管生长旺盛。metttl3 cKO组小鼠角膜上皮完整，基质层致密，新生血管稀疏，血管数量少。第14天，WT小鼠角膜上皮细胞层完整，基质层新生血管减少。相反，Mettl3的角膜上皮细胞层^{- / -}小鼠比例相对完整，在基质层中没有观察到新血管形成。5六天后，WT和MetT1的角膜上皮细胞层^{- / -}小鼠正常，间质层无新生血管(图)1 (f))．统计分析表明，MetT13 CKO小鼠中的损伤修复率略微快于WT小鼠（图1 (g))．总的来说，我们的数据显示，在角膜干细胞中敲除metttl3促进角膜损伤修复。

３．２．metttl3在角膜上皮损伤修复中的作用

我们进一步对角蛋白Ki67，K14，K10，K1和CD31进行了谱系追踪和免疫组化分析，以研究MetT13在角膜损伤修复中的作用。我们的研究结果表明，与MetT13 CKO小鼠相比，WT小鼠的斜纹上皮和角膜上皮在WT小鼠中的ki67表达较低（图2(一个)-2 (d))．K1与K10表达呈显著正相关。Ki67表达较低，K1与K10表达存在相关性，提示角膜损伤时角蛋白K1/K10表达增加是角膜上皮细胞增殖加速的原因之一。此外，K1/K10在WT小鼠角膜上皮中的表达水平低于Mettl3 cKO小鼠(图)2 (e)和2 (f))．

在体外谱系示踪显示tdTomato的表达水平⁺来自K14的细胞⁺在正常生理条件下，WT小鼠和metttl3 cKO小鼠的细胞无明显差异。在损伤条件下，与野生型小鼠相比，tdTomato的表达水平⁺来自K14的细胞⁺metttl3 cKO小鼠细胞明显增加(图3(一个)和3 (b))．为了探讨metttl3在角膜损伤后修复中的作用，我们应用CD31免疫荧光技术评估角膜缘损伤部位的血管面积。WT小鼠的血管面积大于metttl3 cKO小鼠(图)3 (c))．此外，WT小鼠的杯状细胞数量少于metttl3 cKO组(图)3 (d))．以上结果表明，metttl3的缺失加速了损伤后角膜上皮的修复速度。

3．3．METTL3靶向角膜缘AHNAK和DDIT4

识别MettL3针对M mettl3的潜在mRNA^6.角膜上皮修复，RNA测序和m中的甲基化^6.在MetT13敲低HES3细胞中进行测序。产生差异表达基因的火山地图（图4(一)），表示不同样品中的多种基因表达的变化。在MetT13敲低后，明显下调59个基因，并且显着上调了47个基因（图4(一))．接下来我们表演m^6.一种识别m^6.HCES3细胞中的一个靶点。宏基因分析表明，m^6.A主要位于编码序列(CDS)区域附近(图)4 (b))．从M中鉴定了序列图案^6.A峰，并发现它们在特定motif GGAC中持续富集(图4 (c))．甲基化差异基因用氧化石墨烯分析。与m^6.进行修改，进行分析以评估来自BP，MF和CC透视的样本。在图中列出了第一份富集的每种富集组的甲基化基因4 (d)，显示前20个氧化石墨烯分析中显著富集的甲基化基因。我们还发现，富集的基因涉及细胞增殖和迁移(图4 (f))．通过MeRIP-seq分析，我们发现AHNAK和DDIT4在m^6.metttl3敲除后的a修饰峰。推测AHNAK和DDIT4是METTL3的下游靶基因。接下来，我们使用整合基因组Viewer (IGV)来检测和绘制m^6.在MetT13敲低鼠标3细胞中丰富的Ahnak和Ddit4转录物（图4 (e))．western bolt和RT-qPCR检测结果显示，经shmetttl3处理的HCES3细胞AHNAK和DDIT4表达明显下调(图)4 (g)和4（h）)．综上所述，AHNAK和DDIT4是潜在的m^6.Mettl3的目标。

4.讨论

在角膜损伤修复中的MetT3功能问题上发现了很少。角膜上皮使其在损伤后的再生能力和稳定性，导致角膜不透明度，这损害了视觉功能。我们的研究发现，敲除MetT13促进了肢杆菌细胞增殖和迁移。此外，MetT13 KO小鼠与野生型小鼠相比，较快的角膜损伤修复。这些结果证实了在敲击MetT13促进细胞生长和自我更新中的大量工作的调查结果14.］．

既往研究表明，角膜缘干细胞显著抑制血管内皮细胞的形成，角膜缘干细胞的缺失将导致大量新生血管[15.那16.］．我们的结果表明，爆震UST3促进新生血管。肢体干细胞移植是修复止血组织缺陷并恢复干细胞数量的有希望的策略;因此，抑制角膜上皮的结膜和新生血管保持了角膜透明度并实现了眼表面的重建。进一步了解调节斜腹干细胞功能的分子机制是为角膜损伤的更好的解决方案是必要的。

m^6.mRNA的甲基化是涉及真核干细胞的命运的表观遗传改性。在正常的血液，m^6.a控制造血干细胞的分化而不影响其自我更新或增殖。MetT13的丧失导致对称自我更新细胞分裂的增加[17.］．ACTS是一种放大器，当metttl3被敲除时，可以选择性地促进胚胎干细胞中已经占优势的基因的表达。因此，上皮干细胞发生加速分化和细胞死亡[18.];在本研究中，我们的结果基于使用角蛋白14（K14）构建的碱燃烧模型^{reer +}/ Mettl3^{FL / FL.}结果表明，metttl3 cKO可促进角膜缘干细胞的增殖和分化。

越来越多的证据支持角膜上皮是由位于角膜周围边缘龛的干细胞再生的观点。角膜缘上皮干细胞培养长期以来被用于制备修复角膜上皮缺损的移植物;因此，探索角膜缘干细胞的生物学功能可能为改善角膜缘干细胞治疗奠定基础[19.-21.］．角膜林巴斯干细胞表达KI67，在维持细胞增殖方面发挥着至关重要的作用。然而，K14主要在角膜中心的基础上皮细胞和基层的基底上皮细胞中表达，并且是具有有丝分裂活性的基底上皮细胞的标记物，并参与细胞增殖和迁移过程。K14的表达和命运可以通过细胞中TDTOMATO的表达来跟踪。该结果表明，表达K14的止血杆菌从肢体迁移到角膜上皮，以增殖，分化和修复。K10及其配体K1通常用作正常末端分化的指标，主要存在于基层和基层上方的层中。K10和K1未在正常的止血和角膜上皮表达，其表达之间存在正相关性。该发现表明，角膜损伤中角膜素K1和K10表达的增加是角膜上皮加速增殖的原因之一。KI67，K14，K10和K1的免疫荧光数据表明，在MetT13 CKO小鼠中加速了受损细胞的增殖，分化和迁移率，而WT小鼠的这些速率远低得多。这些发现可能表明，MetT13敲除促进干细胞的增殖，自我更新，分化和迁移率在一定程度上，从而加速了损伤修复过程。

AHNAK和DDIT4参与干细胞的维持、增殖和分化[22.-25.］．先前的研究报告说，Ahnak的过度表达抑制胶质瘤细胞增殖，侵袭，Ki67表达和诱导的细胞凋亡[26.］．Lim等人。发现Ahnak抑制可以上调内源性C-myc，促进诱导多能干细胞的产生[22.］．和我们的结果一样，Ki67的表达在m^6.Ahnak的修饰，表明细胞增殖增加。DDIT4与间充质干细胞的分化电位直接相关[27.］．功能的增益和功能分析丧失表明，DDIT4活性与MTOR信号传导途径的调节直接相关，包括多能性基因的表达和分化[27.］．综上所述，metttl3可能通过调节AHNAK和DDIT4的表达来影响角膜缘干细胞的生长和代谢，而AHNAK和DDIT4在细胞再生中发挥重要作用，增强m的功能^6.在角膜损伤后的修复过程中。

5。结论

使用体内我们发现了mettl3介导的m^6.在肢体干细胞功能和角膜损伤修复调节中的修改，旨在瞄准MetT13和M.^6.一项工作的修改途径可能成为治疗角膜疾病的策略。

数据可用性

用于支持本研究结果的实验​​数据包括在文章中。

的利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

Yarong Dai负责研究设计，方法开发，执行，数据分析和稿件准备。茂盛成强负责鼠标实验。荣龙岭和思妍张为数据研究设计贡献。杰里文和逸凡成有助于该方法开发。BoSuan Huang和Wenjie Huang促成了图片处理。金荣丽负责HCES3细胞衍生。caifeng dai贡献到图形处理。水银林，​​黄轩沉，宜州江负责概念和研究设计，监督和稿件准备。Yarong Dai和Maosheng Cheng在这项工作中同样贡献。

致谢

深圳市孔雀计划(KQJSCX20170728150303243)、深圳市基础研究发展基金(JCYJ20180305124812444)、深圳市科技创新委员会(ZDSYS201505291525382)、深圳市科技创新委员会(JCYJ20170817093928508)资助。眼科国家重点实验室开放研究基金。

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