移植网站影响脂肪干细胞治疗视网膜变性的结果

文摘

脂肪干细胞(对asc)显示一个强大的保护作用在视网膜退行性疾病(抽样)移植到视网膜下空间后在动物模型。最近,一些临床试验已进行抽样intravitreal移植的干细胞,包括对asc。然而,临床试验的结果并不令人满意。调查如果移植网站改变干细胞治疗抽样的结果,我们对asc孤立的老鼠(rASCs)和用绿色荧光蛋白标记。自体rASCs被移植到老鼠的玻璃室或视网膜下空间抽样模型引起的碘酸钠(SI)。电响应被ERG记录。观察视网膜的解剖结构在老鼠的眼睛cryosections posttransplantation周1,2,4。视网膜神经细胞凋亡和外层膜- (ERM)像疣状结构形成进行调查。intravitreal移植rASCs导致了扑灭电气响应,虽然神经视网膜的玫瑰形成和细胞凋亡减少。然而,rASCs嫁接在视网膜下空间保护视网膜免受SI造成的损害,包括电响应的部分恢复和减少玫瑰的形成。 Intravitreally grafted rASCs formed a membrane, resulting in retina folding at the injection site. Müller cells, retinal pigment epithelial cells, and microglial cells migrated from the retina to the rASC-formed membrane and subsequently formed an ERM-like structure. Furthermore, vitreous fluid promoted rASC migration, and rASC-conditioned medium enhanced Müller cell migration as indicated by in vitro studies. These data suggested that the vitreous chamber is not a good transplantation site for ASC-based therapy for RDD and that a deliberate decision should be made before transplantation of stem cells into the vitreous chamber to treat RDD in clinical trials.

1。介绍

视网膜退行性疾病(抽样),包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP),是全球失明的主要原因之一(1,2]。进步和最终的功能障碍和死亡的视网膜色素上皮(RPE)细胞和感光细胞的主要病因是抽样(1,2]。很长一段时间,这是一种无法治愈的疾病。

最近,干细胞疗法治疗抽样显示巨大的治疗潜力(3]。脂肪干细胞(对asc)高增殖率和自我更新能力,可以分化成不同的细胞类型,包括骨,软骨,脂肪细胞(4]。对asc在适当的条件下,甚至可以从其他细菌层transdifferentiate进入细胞,如神经细胞和视网膜细胞(5- - - - - -7]。因此,对asc可以替代受损细胞移植后体内。此外,对asc可以分泌许多细胞因子和生长因子直接或液受益受损组织的再生8,9]。这些特性使得对asc抽样的合适的候选人进行治疗。发表论文数对asc报道,延缓视网膜下空间移植术后视网膜变性过程碘酸钠- (SI)诱导动物抽样模型(10,11]。我们组表明,人类对ASC延迟视网膜变性过程在RCS大鼠视网膜下空间移植后,ASC旁分泌功能,如血管内皮生长因子(VEGF)的生产,主要对他们的治疗功能12]。

除了对asc外,其他类型的间充质干细胞治疗抽样也表明有前途的结果在动物抽样模型(13- - - - - -15),促使科学家和医生进行临床试验。几个临床试验的结果表明,一些病人intravitreal移植的人类有密集的玻璃体出血的眼睛也严重增生性玻璃体视网膜脱离(PVR)和二次外层膜(ERM)形成(16,17]。这些并发症有时与手术有关。然而,更多的研究表明,intravitreal其他类型的干细胞移植也导致ERM形成(18- - - - - -20.),这表明,不仅手术过程,而且移植网站可能影响治疗结果。干细胞用于治疗抽样时,细胞可以被移植到视网膜下空间或玻璃室。大多数已发表论文证明当干细胞,包括对asc,被移植到视网膜下空间,移植细胞在视网膜下空间和显示保护功能(12- - - - - -15]。然而,先前的临床试验的首选玻璃室作为移植网站(http://www.clinicaltrials.gov,NCT02016508,NCT01518127,NCT03772938,NCT01920867,NCT03011541,NCT02024269,NCT0106856,NCT01560715,NCT01531348,NCT02280135)。因此,如果视网膜下空间,而不是玻璃室,是适当的移植现场抽样的干细胞疗法,患者接受玻璃体室移植的干细胞将处于明显劣势。因此,有必要澄清的最佳网站移植治疗在临床试验抽样。

有两种类型的汇率机制,即特发性和二级类型(21,22]。特发性类型涉及神经胶质细胞迁移的病因从内部限制膜破裂和视网膜表面扩散和蔓延。二级ERM是眼科疾病的并发症,如视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变,和葡萄膜炎;尤其是视网膜脱离发生率有一定的干细胞移植过程中(23]。除了神经胶质细胞,从视网膜撕裂RPE细胞迁移和增殖,导致二次ERM形成(24,25]。ERM高度到视网膜,合同和扭曲了视网膜(26]。以前的研究已经表明ERM形成的患者接受intravitreal来源于干细胞的移植骨和对asc17,19]。然而,欧洲汇率机制的形成过程,ERM蜂窝组件和干细胞ERM的贡献形成在这些患者尚不清楚。

在这项研究中,一只老鼠抽样模型建立了SI的静脉输液,对ASC和鼠(rASCs)自体进入玻璃室或视网膜下空间澄清移植网站是否会影响ASC治疗抽样的结果。外层膜的形成也调查证明ASC的潜在继发性并发症治疗抽样,从而为未来的临床试验提供重要的信息。

2。材料和方法

2.1。动物

6 Sprague-Dawley (SD)大鼠(同济大学动物中心)被用于这项研究。动物实验是按照下午进行的(在视觉和眼科学研究协会)声明中使用动物在眼科和视觉研究。进行动物实验动物设施的同济大学。动物协议制度动物保健和使用委员会批准的同济大学,上海。

2.2。制备rASCs

大鼠皮下脂肪组织和修改(通过手术如前所述27]。简单地说,老鼠被2%戊巴比妥钠麻醉,皮肤被70%的酒精消毒,打开一把剪刀。皮下脂肪组织被收获,广泛用磷酸盐(PBS)。组织与10卷的胶原酶消化I型(5毫克/毫升低葡萄糖DMEM (1 g / L),表达载体,卡尔斯巴德,CA) 60分钟37°C,断断续续的震动。中和完成后ASC介质(低葡萄糖DMEM (1 g / L), 10%的的边后卫,50 U /毫升青霉素、链霉素50毫克/毫升(所有从英杰公司)),消化组织在300×g离心5分钟,漂浮的脂肪细胞和血细胞被离心分离基质分数。细胞颗粒resuspended完整rASC介质和过滤70μ米网。获得的rASCs培养在37°C, 5%的公司₂。

2.3。Muller细胞培养

河鼠Muller细胞(rMC-1细胞)请提供Vijay Sarthy(埃文斯顿西北大学IL)。细胞保持在高葡萄糖(4.5 g / L) DMEM包含10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin在37°C公司为5%₂在湿润孵化器。

2.4。诱导脂肪形成、骨和软骨形成

rASCs被诱导分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞。对于脂肪形成,在脂肪形成的诱导培养基培养细胞(DMEM补充10%的边后卫,10⁷M地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州),100年μΜ消炎痛(σ),100年μM 3-isobutyl-1-methyl-xanthine(σ),10 mg / L胰岛素(表达载体),介质是每2天更新。两周后,这些细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA)和沾油红O(σ)。骨生成,细胞保持成骨诱导介质(DMEM补充10%的边后卫,10毫米β甘油磷酸(σ,CA), 50μM L-ascorbate-2-phosphate(σ),5 ng / mL重组人骨形态形成protein-2 (HumanZyme,芝加哥,IL))和媒介改变了新鲜每2天。一周后,这些细胞被检查为碱性磷酸酶(AKP)活性向量蓝色碱性磷酸酶底物装备III(向量,伯林盖姆,CA)。软骨形成,细胞培养在chondrogenic感应介质包括DMEM补充10%的边后卫,10 ng / mL TGFβ1 (HumanZyme,芝加哥,IL), 0.1 mol / L地塞米松(表达载体),50 mg / L L-ascorbate-2-phosphate(σ),和50 g / L(表达载体)。两周的细胞培养和固定在4% PFA和甲苯胺蓝染色四硼酸钠(σ)。

2.5。流式细胞术

rASCs分离,分离单个细胞用0.25%胰蛋白酶/ 0.53毫米EDTA缓冲区,然后在PBS resuspended含有1%牛血清白蛋白(BSA)和FITC-labeled抗体CD29, CD90、CD11b、CD45、(BD生物科学,圣何塞,CA),分别为30分钟冰。FITC-mouse IgG1被用作控制同形像。这些细胞被洗两次与PBS和分析在FACScan仪器使用CellQuest软件(BD生物科学)。

2.6。慢病毒包装和感染

HEK293T细胞培养至70%融合在10厘米菜然后转染10μg FG12质粒携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和5μ每个VSVG g、牧师和PRRE包装质粒脂质体2000(表达载体)。12小时后,媒介完全刷新。60 h后,上层的收集和过滤0.45μ米孔隙大小的过滤器(微孔,波士顿,MA)。对于标签rASCs, 细胞被播种在10厘米培养皿一天,然后,媒介是新鲜培养基+浮在表面的“(分泌物)和8所取代μg / mL聚凝胺(σ),其次是12小时的潜伏期。GFP-labeled rASCs按流式细胞仪,用于自体移植。

2.7。自体rASC移植

长大后3个月大的SD大鼠被用来建立抽样模型并得到了自体rASC移植与修改(之前报道12]。开始考虑到视网膜细胞凋亡早在一天后注入SI (28),我们在第一天后注射移植rASCs SI抑制视网膜细胞的凋亡。此外,如果是在数十分钟内代谢体内29日,30.];因此,移植的细胞不会被损坏,如果在这个时间点。简单地说,老鼠通过静脉注射SI(50毫克/公斤,σ)诱导抽样模型,24小时后,老鼠被2%戊巴比妥钠麻醉。一个通道是由插入30-gauge针,异色边缘,玻璃室。intravitreal移植,33-gauge针插入到玻璃室,3毫升的自体GFP-labeled rASC悬浮液( 细胞/μL)注入视网膜的中心附近的玻璃室。视网膜下移植,33-gauge针被插入的视网膜下空间中央视网膜和自体rASC停赛3毫升( 细胞/μL)注入。收到了虚假的注入PBS的眼睛被用作控制。

2.8。网膜电图(ERG)考试

细胞移植后,ERG b-wave振幅测量每周4周posttransplantation,鸟纲- 2000电生理仪(Kanghuaruiming科技,重庆,中国)如前所述[13,14]。强烈的6.325 - - - - - -2 cds / m应用,使得响应的记录光感受器的刺激。

2.9。制备视网膜Cryosections

老鼠被杀死的过量戊巴比妥钠在周1,2,4 posttransplantation。眼球被立即PFA和固定在4%。嵌入组织切片(10μ沿垂直厚度)子午线的眼球从鼻颞侧,和cryosections用于分析。评估视网膜的失真,脾组织的核与DAPI染色。

2.10。终端原位脱氧尿苷三磷酸尼克结束标记(TUNEL)测定

眼睛样本收集在周1、2和4 posttransplantation PFA和固定在4%,然后,cryosectioned样本准备。TUNEL分析进行的原位检测细胞死亡工具包(罗氏、诊断、瑞士),根据制造商的指示。核与DAPI复染色。细胞凋亡视网膜外核层(筒),内部核层(INL)和神经节细胞层(GCL)评估是基于每个字段TUNEL +细胞的计数。凋亡细胞的百分比计算并显示在一个蜘蛛图(31日]。

2.11。疣状

免疫荧光分析,cryosections眼睛permeabilized 0.25% Triton x - 100(σ)5分钟,用PBS洗净,然后屏蔽2% BSA在PBS(σ)。部分是主要SLC1A3抗体孵育,Ezrin Iba-1,αsma (Abcam,剑桥,英国)在1:500一夜之间在4°C。他们然后用PBS洗了三次,其次是孵化二次荧光标记抗体(1:1000年,英杰公司)在一夜之间。DAPI被用来表示原子核。样本然后由荧光显微镜检查(奥林巴斯IX73、东京、日本)。

2.12。玻璃液的制备

眼睛从三月大的老鼠,用酒精棉擦拭;与PBS洗后,角膜和晶状体被移除,玻璃液是由微量吸液管吸气。较低的玻璃液在稀释葡萄糖(1 g / L) DMEM(1: 10) 0.22和过滤μ米微孔膜。

2.13。抓分析

rASCs增长到100%融合48-well文化板块和饥饿在低葡萄糖(1 g / L) DMEM含有0.5%的边后卫12 h。细胞单层刮在一条直线与一个p1000移液管提示创建一个“。“单层洗DMEM去除细胞碎片和培养DMEM包含0.5%的边后卫没有或有10%玻璃液24 h。细胞被固定在4% PFA和沾染了染色。划痕区域测量使用显微镜和ImageJ 1.8.0软件(美国国立卫生研究院)。结果表示成比例的减少划痕区域((划痕区域后立即测量刮,刮伤面积测量刮后24 h) /划痕区域后立即测量刮×100%)如前所述[32]。

2.14。制备rASC-Conditioned介质

rASCs增长80%的融合,培养高葡萄糖(4.5 g / L) DMEM 24 h,上层的收集和被用作rASC-conditioned媒介。

2.15。Muller细胞迁移

Muller细胞融合增长至80%,在高葡萄糖饥饿(4.5 g / L) DMEM包含0.5%的边后卫。细胞分离胰蛋白酶/ EDTA, resuspended高葡萄糖(4.5 g / L) DMEM和添加到参议院24-transwell板(8μm孔隙,BD生物科学) 细胞/。DMEM或ASC-conditioned介质添加到众议院。细胞被允许迁移4 h在37°C的5%股份₂。迁移细胞,下腹膜相连,与染色染色。显微镜下的图像被抓获。结果表示为每个字段迁移细胞的数量。

2.16。统计分析

所有实验至少重复三次。数据分析GraphPad棱镜6软件。所有的值被表示为 并受单向方差分析之后,图基的测试。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。识别rASCs

rASCs皮下脂肪组织中分离的显示纤维母细胞形态。rASCs确认潜在的分化能力,我们培养rASCs脂肪形成的下成骨,和chondrogenic分化条件,和rASCs分化成脂肪细胞(油红O染色),成骨细胞(AKP染色),软骨细胞(甲苯胺蓝染色(图)1(一))。流式细胞仪分析表明,对asc CD29阳性,CD90 CD45和CD11b(图和消极1 (b))。这些结果表明,孤立的细胞间充质干细胞。

3.2。rASCs不恢复视力丧失,当移植到玻璃的SI-Induced抽样老鼠

评估的影响rASCs嫁接到SI-induced损伤视网膜的玻璃室,我们建立了一个老鼠抽样模型通过静脉注入硅,和rASCs自体玻璃室。ERG测量证明大鼠4周posttransplantation rASCs视觉功能。在对照组,PBS注入玻璃室。b-wave是与功能感光细胞的数量(PRs)和被用来评估公关光刺激的反应。PBS组b-wave显著降低了基线SI输液一个星期后,在接下来的几周维持在低水平(数字2(一个)和2 (b))。对asc可以产生营养因素和视网膜保护功能(12]。然而,b-wave振幅rASC治疗组没有增加,类似于PBS组(数字2(一个)和2 (b))。这些结果表明,ASC治疗并不能提高大鼠的视觉功能与PBS组相比。

以前的工作表明,视网膜下空间移植对asc延迟抽样进步通过旁分泌功能在动物模型12]。这促使我们调查intravitreal移植是否rASCs减少硅诱导的损害视网膜的解剖结构尽管rASCs不受益的视觉电反应。我们首先准备cryosections视网膜调查如果rASCs保护从SI-induced损伤视网膜的解剖结构。神经视网膜由SI注入扭曲,形成了许多玫瑰公安局组织结构。GFP-labeled rASCs观察玻璃室,和部分神经视网膜的褶皱形成rASC注射部位的玻璃室。然而,rASC治疗减少nonfolded莲座状结构形成的神经视网膜的一部分,保持正常的层内观察到的时间点(图2 (c))。我们进一步检查视网膜神经元的凋亡nonfolded部分的神经视网膜有或没有rASC移植。如图2 (d),TUNEL-positive凋亡细胞被发现在GCL, INL, PBS组和视网膜的辊筒,和凋亡细胞的数量增加从星期1到星期4。这些神经元细胞凋亡是解释电反应的消失SI-induced抽样老鼠。与PBS组神经细胞凋亡增加,intravitreal移植rASCs有效减少凋亡细胞的数量和比例在GCL, INL和辊筒(数字2 (d)和2 (e), )。这些数据都表明,rASCs自体进入玻璃室减少视网膜结构变形和抑制细胞凋亡,但他们诱导视网膜褶皱,没有改善SI-induced老鼠的电反应。因此,玻璃室可能不是一个合适的移植网站ASC抽样。

我们下一个调查如果视网膜下空间是适当的移植干细胞治疗抽样。在SI-induced rASCs自体入视网膜下空间抽样老鼠。b-wave振幅明显增加rASC治疗组比PBS组(数字3(一个)和3 (b)),和视网膜移植rASCs保持更好的解剖结构与PBS组(图3 (c))。这些结果表明,视网膜下空间,而不是玻璃室,抽样的合适的移植网站ASC治疗。

3.3。rASCs形成一个玻璃ERM-Like结构室

以前的研究已经表明ERM形成的患者接受intravitreal来源于干细胞的移植骨和对asc17,19]。我们下一个调查如果对asc的玻璃室触发和/或参与汇率机制的形成,我们观察到的分布GFP-labeled rASCs玻璃室。如图4rASCs迁移从注射部位,睫状体,他们形成了一个膜(ERM-like结构)和覆盖整个视网膜玻璃体posttransplantation第1周室。此外,rASCs保持膜结构在整个观测期间。rASCs ERM-like结构与形成折叠的部分神经视网膜在注射部位的玻璃室。为了确认是否玻璃液能够促进rASC迁移,形成一层膜,我们进一步进行体外rASC迁移试验,发现玻璃液显著提升rASC迁移(图5)。然而,当rASCs被移植到视网膜下空间,细胞聚集和分布在视网膜下空间的一部分。没有形成的玻璃膜室(图3 (c))。因此,这些结果表明,对asc容易形成一个玻璃ERM-like结构室和诱导神经视网膜的褶皱,随后导致电反应下降。

3.4。rASC-Formed ERM-Like结构包含几种类型的视网膜细胞

ERM的蜂窝组件包括RPE细胞、胶质细胞和myofibroblasts,这些细胞增殖和迁移到视网膜的表面,形成欧洲汇率机制。识别的细胞组件rASC-formed ERM-like结构玻璃室,我们进行免疫染色。ERM SLC1A3 + Muller细胞,他们显示一个守时分布沿rASC-formed膜在星期1 posttransplantation并逐渐形成了一个连续层附着在ASC-formed膜(图4周内6)。Ezrin + RPE细胞也被附加到rASC-formed膜,其中大多数分布rASC-formed膜和视网膜之间(图6)。Iba-1 +小胶质细胞被认为是与炎症相关的(33]。许多小胶质细胞迅速渗透到rASC-formed膜在星期1 posttransplantation并留在膜在整个观测期间(图6)。rASCs SLC1A3没有表达,Ezrin Iba-1体外(补充图(可用在这里)),证实SLC1A3 +穆勒,Ezrin + RPE细胞,Iba-1 ERM-like膜+小胶质细胞是来源于视网膜。αsma + myofibroblasts细胞被认为是主要的组件,导致收缩ERM [34),随后导致视网膜折叠或超然。如图6对asc,分化成myofibroblasts,几个GFP-labeled rASCs coexpressedαsma,进一步证实了体外免疫染色,rASCs表示的一部分αsma(补充图)。ERM的肉瘤RPE细胞和Muller细胞也表达αsma。的GFP-negativeαsma +细胞可能来源于Muller细胞和/或RPE细胞(图6)。这些结果表明rASC-formed ERM-like结构包含Muller细胞,RPE细胞和小胶质细胞,这些细胞在一起形成一个ERM-like结构在视网膜上。

对asc可以产生许多影响细胞迁移的细胞因子和生长因子(35]。调查如果对asc促进视网膜细胞迁移和随后提高ERM-like结构形成,我们执行一个体外迁移实验transwell文化板块。ASC-conditioned媒介显著提升Muller细胞迁移(图7)。

4所示。讨论

之前的临床试验表明,ASC移植到玻璃室密度导致玻璃体出血的眼睛,与严重的PVR所有病人视网膜脱离,形成二级ERM在一些病人16,17]。此外,移植的CD34 +干细胞从骨髓进入玻璃室还导致ERM形成(19]。然而,intravitreally移植干细胞是否直接启动ERM形成或加重现有ERM仍然未知。在目前的研究中,我们没有观察到ERM形成SI-induced抽样在PBS组和老鼠rASC视网膜下空间移植组。rASC玻璃室移植导致ERM-like结构形成。rASCs形成膜作为支架的玻璃室,它导致视网膜折叠注射部位,沿着脚手架和视网膜细胞迁移导致ERM-like结构的形成。

玻璃液含有多种细胞因子和生长因子,如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素- 6、interleukin-8碱性纤维母细胞生长因子(bFGF), VEGF,血小板源生长因子(PDGF)和肝细胞生长因子(HGF) [36,37]。这些因素的水平升高在玻璃体视网膜脱离患者的液体,被认为有助于PVR的发作(37,38]。HGF,体外迁移分析表明,PDGF和bFGF,趋化现象的刺激,促进ASC迁移(39]。我们还证实,玻璃液促进rASC迁移体外研究中。因此,可想而知,玻璃液促进intravitreally移植ASC迁移和膜的形成。此外,玻璃体包含一个细胞外基质,包括胶原蛋白(40),已证实促进ASC迁移(39]。因此,玻璃体内可能提供脚手架ASC的迁移,促进ERM-like结构形成。

有两种类型的汇率机制,即特发性和二级类型(21,22]。特发性类型涉及神经胶质细胞迁移的病因从内部限制膜破裂,视网膜表面扩散和蔓延。二级ERM是眼科疾病的并发症,如视网膜脱离、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎。除了神经胶质细胞,从视网膜撕裂RPE细胞迁移和增殖,从而导致膜的形成(24,25]。ERM附加到视网膜,合同和扭曲了视网膜(26]。在这项研究中,汇率机制形成中没有观察到PBS组和rASC视网膜下空间移植组。然而,intravitreal移植ERM-like rASCs诱导形成的结构,这表明对asc ERM-like结构形成的可能是致病因素后移植到玻璃室。对asc ERM-like结构形成的可能机制可能涉及附加到视网膜注射部位,从而诱导视网膜折叠和扭曲。同时,对asc传播沿玻璃体和形成一个膜支架。视网膜细胞,如Muller细胞,RPE细胞和小胶质细胞,从扭曲的视网膜迁移和扩散或渗透ASC膜,形成一个ERM-like结构。因此,对asc ERM-like结构的形成和视网膜细胞应该占ERG电响应的快速下降。

视网膜神经胶质细胞的异常增殖和迁移是重要的诱发因素的形成ERM [41]。神经胶质细胞通过内部限制膜和在视网膜表面迁移。趋化因子和生长因子的玻璃室是吸引神经胶质细胞迁移的关键(42]。据报道,胶质瘤体外刺激Muller细胞迁移(43]。我们观察到,Muller细胞和小胶质细胞出现在玻璃室和迁移或渗透到rASC-formed膜,随后形成一个ERM-like结构。对asc可以分泌多种生长因子和趋化因子,如胶质瘤、PDGF, VEGF和bFGF,这些因素直接参与ERM形成(42]。它是合理的,这些因素形成一个梯度适应症促进神经胶质细胞迁移。在目前的研究中,rASC-conditioned媒介显著提升transwell板Muller细胞迁移。睫状体被认为包含视网膜干细胞(44]。移植rASCs玻璃腔形成一层膜,附着在睫状体。视网膜干细胞可能沿着rASC-formed膜玻璃室和迁移分化成胶质细胞和ERM-like RPE细胞结构。

Myofibroblasts产生细胞外基质,它们负责ERM收缩(34]。ERM Muller细胞发生表型改变,成为myofibroblasts,和表达αsma是必不可少的细胞外基质收缩,和TGF -β促进这个过程(45]。的其他重要起源myofibroblasts被认为是RPE细胞。TGF -β触发epithelial-mesenchymal RPE细胞的过渡和移植αsma表达(46]。的确,对asc也可以转变成myofibroblasts [47]。我们发现对asc GFP-labeled表示的一部分αsma。然而,GFP-negativeαsma + myofibroblasts可能来自Muller细胞或RPE细胞。此外,对asc可能产生TGF -β,从而促进Muller细胞和RPE细胞转变成myofibroblasts。

几个因素,包括细胞质量、免疫监视和安全,应考虑在干细胞治疗从板凳上诊所。先前的研究已经报道,intravitreal自体血细胞导致ERM管理形成的玻璃腔白化兔子(18];AMD或RP病人intravitreal注入骨骨髓来源干细胞发达ERM [19]。甚至注入碳颗粒的玻璃导致兔子(ERM的形成48];我们也观察到当人类脐带间充质干细胞被移植到视网膜下空间,如果细胞被泄露到玻璃腔,ERM开发(数据没有显示)。这些报告连同本研究进一步表明,移植网站是另一个重要因素可能导致不同的干细胞疗法的病人治疗效果;至少,视网膜下空间而不是玻璃室是适当的移植干细胞疗法的抽样。

5。结论

在目前的研究中,rASCs自体成老鼠的玻璃室,和玻璃液提升rASC迁移形成一层膜。此外,视网膜褶皱形成的rASC注射部位,rASC-formed膜作为支架,促进神经胶质细胞和RPE细胞迁移,形成一个ERM-like rASCs和视网膜细胞组成的结构。尽管intravitreal移植rASCs减少视网膜花结的形成,减少神经视网膜细胞的凋亡,ERM-like结构和视网膜褶皱形成的主要原因可能是导致眼睛的扑灭电气响应。考虑到视网膜下空间移植rASCs恢复电反应在某种程度上,我们的结论是,移植部位影响ASC-based治疗结果和玻璃室移植并不是一个好网站ASC-based治疗抽样。因此,深思熟虑的决定之前应移植的干细胞治疗在临床试验中抽样的玻璃室。

缩写

AMD公司:	年龄相关性黄斑变性
正义与发展党:	碱性磷酸酶
下午:	在视觉和眼科协会研究
bFGF:	碱性纤维母细胞生长因子
BSA:	牛血清白蛋白
ERG:	网膜电图
ERM:	外层膜
GCL:	神经节细胞层
绿色荧光蛋白:	绿色荧光蛋白
HGF:	肝细胞生长因子
INL:	内部核层
辊筒:	外核层
PBS:	磷酸盐
PDGF:	血小板源生长因子
PFA:	多聚甲醛
PRs:	光感受器
PVR:	增生性玻璃体
rASCs:	大鼠脂肪干细胞
抽样:	视网膜退行性疾病
总机:	色素性视网膜炎
RPE:	视网膜色素上皮
SD:	Sprague-Dawley
如果:	碘酸钠
TGFβ1:	转化生长因子β1
TUNEL:	终端原位脱氧尿苷三磷酸尼克结束标签
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现是可用的,包括在文章和文件的补充信息。

信息披露

渝胡、Huanzhi洛杉矶,和魏宣城co-first作者同样这项研究做出了贡献。

的利益冲突

所有作者表明任何潜在的利益冲突。

作者的贡献

渝胡、Huanzhi La,宣城魏设计研究中,进行了实验,和草稿纸;悦周和清涧人或者进行实验;陈和奢靡朱担任英语和汉语教师进行数据的统计分析和解释;静,彩霞金、芙蓉高,胡安Wang Jingfa张,和张Jieping讨论了实验和审查和编辑手稿;历下陆Guo-Tong徐的构思和设计研究和讨论和修订后的手稿;海滨田领导和项目资助,整体监督项目和设计的一些实验,讨论和修订完成手稿提交批准。

确认

这项工作是获得赠款支持中国科技部(2015年2016 yfa0101302 2017 yfa0104100, cb964601),国家自然科学基金(81770942,81770942,81570852),上海市委员会卫生和计划生育项目(201640229),由上海科学技术委员会授予(17 zr1431300)和格兰特从上海东方医院(zj2014 - zd - 002)。

补充材料

rASCs组织化学染色。rASCs增长到了80%融合在PFA 24-well培养板和固定在4%,permeabilized Triton x - 100为2分钟,0.25%用PBS洗净,然后用2% BSA在PBS阻塞。然后,细胞分别主要SLC1A3抗体孵育,Ezrin Iba-1,αsma,每个稀释1:500一夜之间在4°C。他们然后用PBS洗了三次,其次是孵化二次荧光标记抗体在一夜之间(1:1000)。DAPI被用来表示原子核。这些细胞被荧光显微镜下检查(奥林巴斯IX73、东京、日本)。(补充材料)

引用

1. a .乔戈l .马赫迪,o . Musat”年龄相关性黄斑变性”,罗马尼亚眼科杂志》卷,59号2、74 - 77年,2015页。视图:谷歌学术搜索
2. b·p·哈”,临床进展遗传视网膜一种退化:基因治疗临床试验和基因测序的进步,”视网膜,37卷,不。3、417 - 423年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. p·e·路德维希、s c·弗里曼和a·c·Janot”小说干细胞和基因治疗在糖尿病性视网膜病变,与年龄有关的黄斑退化,色素性视网膜炎,“国际期刊的视网膜和玻璃,5卷,不。1,p。2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. p·a·祖克m·朱h .美津浓et al .,“Multilineage从人类脂肪组织细胞:细胞疗法,”组织工程,7卷,不。2、211 - 228年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. h·萨利希:Amirpour、a . Niapour和s .哈”的概述神经分化人类脂肪提取干细胞的潜力,”干细胞的评论,12卷,不。1,26-41,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 美国Vossmerbaeumer s Ohnesorge s .屈尔et al .,“视网膜色素上皮表型在人类脂肪tissue-derived间充质基质细胞,诱导”Cytotherapy,11卷,不。2、177 - 188年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. h . Aboutaleb Kadkhodaeian、a . Salati和a . Lashay”高效人类脂肪中提取干细胞分化成视网膜色素epithelium-like细胞中含有小分子诱导用一个简单的方法,”组织和细胞卷,56 52-59,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. s·k·卡普尔和a·j·卡茨,”回顾检查参与组成分泌腺脂肪衍生干细胞。”Biochimie,卷95,不。12日,第2228 - 2222页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. p, h·杨,y,和z唐,k . Li“液的功能和临床应用潜力来自脂肪间充质干细胞:一个全面的审查,”干细胞研究与治疗,10卷,不。1,p。242年,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a . Barzelay s Weisthal寒冷,a Niztan et al .,“脂肪间充质干细胞迁移和救援RPE在氧化应激的设置,“干细胞国际卷,2018篇文章ID 9682856, 11页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. h . Aboutaleb Kadkhodaeian, t . Tiraihi h . Ahmadieh h . Ziaei Ardakani, n . Daftarian t·塔,“生存和迁移的脂肪中提取的干细胞移植视网膜受伤,”实验和临床移植,16卷,不。2、204 - 211年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 高z, j . Wang f . et al .,“人类脂肪干细胞延迟在皇家外科学院的大鼠视网膜变性通过抗凋亡和VEGF-mediated神经保护作用,”当前分子医学,16卷,不。6,553 - 566年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. p . l . Wang, y田et al .,“人类脐带间充质干细胞:亚种群及其细胞生物学上的差异和影响在RCS大鼠视网膜变性,”当前分子医学,17卷,不。6,421 - 435年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. p, h .田,z . et al .,”亚种群的骨髓间充质干细胞具有微分效应在延缓视网膜变性,”当前分子医学,16卷,不。6,567 - 581年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h·l .黄z . Li田et al .,“成人牙周ligament-derived干细胞延迟视网膜变性和维护在RCS大鼠视网膜功能,“干细胞研究与治疗,8卷,不。1,p。290年,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a . e . Kuriyan t . a . Albini j·h·汤森et al .,“intravitreal注入自体后视力丧失“干细胞”AMD。”新英格兰医学杂志》上,卷376,不。11日,第1053 - 1047页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. s . s . Saraf m·a·坎宁安a . e . Kuriyan et al .,“双边视网膜脱落后intravitreal注射脂肪中提取的干细胞渗出性黄斑变性患者,”眼科手术,激光和视网膜成像,48卷,不。9日,第775 - 772页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 河野t, t . Kohno, h . Inomata”外层膜的形成:光和电子显微镜研究在实验兔模型中,“眼科档案,卷113,不。3、359 - 363年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j.y.金,y s .你,s . h . Kim和o . w . Kwon”外层膜形成后Intravitreal自体干细胞移植在色素性视网膜炎病人,”视网膜病例和简短的报告,11卷,不。3、227 - 231年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r·m·侯赛因s . r . Dubovy a . e . Kuriyan x y, h·w·弗林Jr .)和t . a . Albini“临床病理的相关性视网膜膜与intravitreal干细胞注射,”眼科手术,激光和视网膜成像,50卷,不。2、125 - 131年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. d·j·麦卡蒂b·n·穆克什诉Chikani et al .,“视觉障碍患病率和外层膜协会项目,“美国眼科杂志》,卷140,不。2、288. e1 - 288页。e8, 2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. a . Uemura h . Ideta h .长崎,盛田昭夫,h . k .伊藤,“黄斑视网膜脱离手术后,眼科手术,23卷,不。2、116 - 119年,1992页。视图:谷歌学术搜索
23. e·h·梁h·w·弗林Jr . t . a . Albini和c·a·梅迪纳视网膜脱离视网膜下干细胞移植后,“眼科手术,激光和视网膜成像卷,47号6,600 - 601年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 郑胜耀Oberstein, j . Byun Herrera d, e·a·查宾s . k . Fisher和g·p·刘易斯,“人类外层膜:细胞增殖细胞类型和相关疾病的特征条件和持续时间,“分子的愿景,17卷,第1805 - 1794页,2011年。视图:谷歌学术搜索
25. m .植木s Morishita r . Kohmoto et al .,“比较特发性和二级外层膜之间的组织病理学发现,“国际眼科,36卷,不。5,713 - 718年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. p . Carpineto诉Ciciarelli,大肠重组、a . Aharrh-Gnama和r . Mastropasqua外层膜与vitreomacular牵引的眼睛,“视网膜,39卷,不。6,1061 - 1065年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 研究员合作y、m . Takenaga h a . et al .,“隔离低温贮藏脂肪组织的脂肪干细胞/基质细胞并移植到大鼠脊髓损伤,”国际分子科学杂志》上,19卷,不。7日,第1963条,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. y关,l .崔,z . et al .,“视网膜下移植大鼠msc和红细胞生成素基因改良大鼠msc在老鼠,保护和拯救视网膜退行性”当前分子医学,13卷,不。9日,第1431 - 1419页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j·沃尔夫和j . r . Walrey Thyroidal碘化运输:第四。离子大小的角色,”Biochimica et Biophysica学报卷。69年,58 - 67、1963页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. k·j·奥尔森,埃勒斯,n . f . Schonheyder”研究的处理retinotoxic碘酸剂量的兔子,“Acta Pharmacologica et Toxicologica,44卷,不。4、241 - 250年,1979页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. r . j .劳k . m . Daniello j·l·邓肯et al .,“眼睛色素对视网膜变性的影响在P23H和S334ter突变体视紫红质转基因老鼠,”眼睛的实验研究第107755条,卷。187年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a . Grada m . Otero-Vinas f . Prieto-Castrillo z Obagi,诉Falanga,”研究技术做简单:集体使用伤口愈合细胞迁移试验的分析,“《皮肤病学研究杂志》上,卷137,不。2,pp. e11-e16, 2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. n .王董和y”MiR-30a调节S100A12-induced视网膜小胶质激活和炎症通过瞄准NLRP3,”目前眼科研究,44卷,不。11日,第1243 - 1236页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. 海因茨b, g . Gabbiani纤维化:myofibroblast生物学的最新进展和新的治疗前景,”F1000生物学报告,2卷,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. k . m .月球黄懿慧公园,j·s·李et al .,“脂肪中提取干细胞分泌因子的影响对人类角质细胞,”国际分子科学杂志》上,13卷,不。1,第1257 - 1239页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j·g . Garweg Zandi,费斯,r . Rieben m . Skowronska和c . Tappeiner“细胞因子的人工晶状体眼眼睛phakic和原发性视网膜脱离,“Acta Ophthalmologica,卷97,不。4,pp. e580-e588, 2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. s . Rezar-Dreindl s Sacu k Eibenberger et al .,“眼内细胞因子概要和持久的新生血管性年龄相关性黄斑变性的治疗反应,”调查眼科及视觉科学卷,57号10日,4144 - 4150年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. j . c .牧师,j·罗哈斯,s . Pastor-Idoate s . Di Lauro l . Gonzalez-Buendia和s . Delgado-Tirado”增生性玻璃体:疾病发病机制的新概念和实际后果,”在视网膜和眼睛的研究进展,51卷,第155 - 125页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. m . w . Maijenburg w·a . Noort m . Kleijer et al .,“原产地细胞周期和组织有助于人类胎儿和成人的迁徙行为间充质基质细胞,”英国血液学杂志》,卷148,不。3、428 - 440年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. b . a .斐乐问:张先生,冈本r . j . y . b .水和d . c .毕比“酶促降解标识组件负责玻璃体的结构属性,“调查眼科及视觉科学,55卷,不。1,55 - 63、2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. a . Bringmann和p·魏德曼,”穆勒胶质细胞参与外层膜的形成,”Graefe眼科临床和实验的档案,卷247,不。7,865 - 883年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. c . Harada y Mitamura, t . Harada”的角色在外层膜细胞因子和营养因素:参与神经胶质细胞信号转导的”在视网膜和眼睛的研究进展,25卷,不。2、149 - 164年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. m . Hollborn c . Krausse i Iandiev et al .,”神经胶质细胞增生性疾病适应症肝细胞生长因子的表达,“实验室调查,卷84,不。8,963 - 972年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. Jasty和美国克里斯,”分析的DNA和组蛋白甲基化揭示epigenetic-based视网膜分化过程中基因表达的调控干细胞/祖细胞纤毛色素上皮的孤立的人类尸体的眼睛,“大脑研究卷,1651年,页1 - 10,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. s c·布鲁里溃疡,r . Kuijer r . j . van der Worp et al .,“免疫组织化学评价特发性外层膜;体外研究TGF -的影响βMuller细胞。”调查眼科及视觉科学卷,56号11日,第6514 - 6506页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. z Dvashi, m . Goldberg o . Adir m . Shapira TGF -和a·波拉克。β1 rpe细胞的诱导分化转移是由TAK1,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。4篇文章e0122229 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. 诉d·德赛h . c .夏朝,j . e . Schwarzbauer“可逆调制myofibroblast分化的脂肪间充质干细胞,”《公共科学图书馆•综合》,9卷,不。1,文章e86865, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. p . Algvere e·考克,“实验外层膜intravitreal碳颗粒引起的,”美国眼科杂志》,卷96,不。3、345 - 353年,1983页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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