铜不诱导Tenogenic分化但促进迁移和增加脂肪间充质基质细胞赖氨酰化氧活动

文摘

背景。铜属于基本微量金属在细胞过程中起关键作用保持整个身体的内稳态。随着越来越多的兴趣移植间充质基质细胞(msc)的网站改善受损的再生肌腱受伤,这项研究的目的是验证补充铜是否起到了积极的作用在人类脂肪tissue-derived msc的属性(hASCs)可能有助于改善肌腱愈合。结果。细胞呼吸的hASCs随着硫酸铜浓度降低后5天的孵化。治疗与CuSO₄没有积极的影响与tenogenesis相关的基因的表达(COL1α1,COL3α1,类似MKX,SCX)。然而,COL1水平α1蛋白的转录控制相比,下降后上升25 5天的博览会μM CuSO₄。类似MKX的内容和SCX蛋白质hASCs暴露硫酸铜的未经处理的控制细胞相比,减少和COL3的水平α1蛋白质保持不变。加入硫酸铜hASCs”中增加了活动的赖氨酰化氧的浓度呈正相关,CuSO₄。此外,高水平的CuSO₄刺激细胞内超氧化物dysmutase的作用。hASC分泌概要文件后5天暴露在50μM硫酸铜不同于未经处理的细胞和类似于人类tenocytes分泌概要文件。此外,硫酸铜hASCs CXCL12分泌增加。此外,博览会CuSO₄显著增加人类剂量依赖性的方式对asc的定向迁移。结论。硫酸铜补充有益影响肌腱再生不能诱导tenogenic分化,但通过改善损伤的msc的招聘网站,在那里他们可以分泌生长因子,细胞因子和趋化因子,并防止氧化应激的影响在炎症,以及提高胶原纤维的稳定,从而促进肌腱愈合的过程。

1。介绍

病变,或肌腱损伤,是一种常见的医学问题主要与他们的过度使用和老化有关。不幸的是,尽管治疗和长期的康复,肌腱受损很少达到完整的机械效率和强度(1]。这是由于胶原蛋白的交联纤维和更高比例的III型胶原(小直径)在再生胶原蛋白I型组织与正常肌腱(相比2]。由于目前治疗是不够的,新的肌腱障碍的有效治疗方法不断地搜索和旧的方法正在开发中。越来越多的兴趣移植间充质基质细胞(msc)的网站改善受损的再生肌腱受伤。msc具有分化成多种细胞类型的能力如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞。也可以诱发tenogenic通路在这个人口(3]。除了他们的分化潜能,msc可以促进肌腱愈合通过分泌生长因子(TGF等许多溶性因素β和HGF)和白细胞介素(il - 6、引发和il - 10) [4),现场受伤的化学引诱物参与组织再生的细胞(5,6]。msc可与各种组织,即。,the bone marrow, adipose tissue, skin, and heart, and they possess the ability to regulate immune response which is useful in the case of inflammation occurring locally after injury of the tendon [7]。

铜属于微量金属(铜)是必不可少的身体内稳态的维护和扮演关键角色在许多基本细胞功能调节新陈代谢(8]。众所周知,铜参与生长和发育过程中,血管生成,铁代谢、细胞呼吸,防止氧化应激(9,10]。铜的一些生理功能与地位有关细胞酶的辅因子,如铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)。铜体内平衡的重要性表现在多种疾病与损伤相关的新陈代谢,即。神经紊乱,心肌病,肿瘤发生,威尔逊氏病,MEDNIK综合症(11- - - - - -14]。有证据证明铜补充改变msc的生物过程。罗德里格斯et al。15)报道,它限制人类BM-MSCs扩散,促进其分化为骨细胞和脂肪细胞,而李et al。16)表明,铜鼠BM-MSCs抑制成骨分化。因此,它是可能的,铜也向tenocytes msc分化的影响,特别是考虑到这是一个代数余子式的赖氨酰化氧(LOX)——酶参与交联胶原纤维(17]。

这项研究的目的是验证是否补充铜对MSC的属性可能有积极影响可能导致改善肌腱愈合。首先,我们有检查CuSO的影响₄治疗msc分化成tenocytes的能力。我们也调查了铜对细胞内超氧化物dysmutase的活动,负责保护细胞免受有害影响的活性氧(ROS) [18)和赖氨酰化氧,参与稳定的弹性蛋白和胶原纤维细胞外基质(ECM) (19]。自努力MSC移植到受损的肌腱为了改善他们的治疗,我们也旨在验证如果MSC预处理铜与铜化合物或同时补充可能有益影响MSC运动性/ chemoattraction为了方便他们迁移到损伤。

2。材料和方法

2.1。人类脂肪Tissue-Derived基质细胞(hASC)分离和培养方法

人类对asc成员去教授Zygmunt Pojda组孤立的细胞使用先前描述的协议(3]。脂肪组织是来自健康的捐赠者通过抽脂。研究中使用的样本后获得患者的知情同意。使用的协议,我们组人体脂肪组织基质细胞鉴定之前详细描述(3]。获得细胞被播种在细胞培养皿中( 细胞/厘米²在生长介质(通用):DMEM-low葡萄糖(擤鼻涕)补充10%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕)和antibiotic-antimycotic解决方案(两性霉素B Penicillin-Streptomycin 1.0%和0.5%;英杰公司)。在标准条件下细胞培养(37°C, 5%的公司₂,95%的湿度),直到他们到达subconfluency。之后,细胞被使胰蛋白酶化(0.25% Trypsin-EDTA解决方案;英杰公司)和镀( 细胞/厘米²),随后的通道。识别后的msc进行4^th通过流式细胞仪分析和multilineage分化。剩余的细胞在液态氮冷冻,msc在5 - 6通道用于进一步的实验。实验一直是进行细胞分别从每个捐赠者。细胞从不同的捐赠者没有集中在这项研究中,使检测个人间的差异。

2.2。人类Tendon-Derived细胞隔离和文化

肌腱部分获得了在非功能性肌腱部分切除手术(修正的不稳定,如肱二头肌的腱肌)。片段收集只从一个病人,不管这个项目,需要一个腱交点及其修正,以便收集样本的考试并不影响病人的健康状况。过程是依照当地生物伦理委员会批准后,获得患者的知情同意。肌腱片段交付后细胞培养实验室被切割成小碎片(约1 - 2毫米³)和留在Ø60毫米培养皿(BD Primaria™)在标准通用和培养标准培养条件。中部分取代每2 - 3天不动组织碎片。10天之后,组织碎片收集,清洗,放置在一个额外的7 - 10天的新菜。肌腱细胞迁移的擦伤从培养皿中收获和受移植者新菜的密度 细胞/厘米²为进一步增长。细胞培养到通道3,然后收获和低温贮藏。

2.3。脂肪形成的分化

诱导脂肪形成的分化,细胞培养3周脂肪形成的介质组成的DMEM-high葡萄糖(擤鼻涕)补充10%的边后卫,1μ地塞米松,500μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 10μ60克/毫升胰岛素,μM Penicillin-Streptomycin吲哚美辛和1%。脂肪形成的介质是改变每隔两天。分化是评估使用油红O染色使可视化脂滴。细胞与4%多聚甲醛固定10分钟后跟5分钟孵化和60%异丙醇15分钟孵化与油红O的解决方案。洗后细胞与蒸馏H₂O,累积光显微镜下细胞内脂滴是可视化。

2.4。成骨分化

诱导成骨分化,细胞培养3周成骨的介质组成的DMEM-low葡萄糖(擤鼻涕)补充10%的边后卫,100 nM地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐,50μPenicillin-Streptomycin M L-ascorbic酸2-phosphate, 1%。成骨的介质是改变每隔两天。钙沉积的区别被可视化评估用茜素红染色。10分钟后用4%多聚甲醛固定和染色,细胞用蒸馏H₂O和细胞外矿床可视化光学显微镜下。

2.5。Chondrogenic分化

15毫升管Chondrogenic分化了。 细胞悬浮在chondrogenic介质组成的DMEM-high葡萄糖补充0.5%的边后卫,100 nM地塞米松,insulin-transferrin-selenium解决方案(其),100年的1%μL-ascorbic酸2-phosphate, 100μg / ml丙酮酸钠,10 ng / ml TGFβ2,通过离心1% Penicillin-Streptomycin和颗粒状。两天之后,形成一个细胞球体结构底部的管观察。chondrogenic介质是每三天更换一次。经过3周的文化,与4%多聚甲醛固定细胞球体结构为30分钟,浸入石蜡进一步进行组织学分析。

2.6。流式细胞术分析

后4^th通道,流式细胞术分析(正)的细胞表面抗原的概要进行以确定msc。抗原CD44, CD73 CD90、CD105和缺乏CD11b CD19、CD34、CD45、HLA-DR评估使用人类的MSC分析工具包(BD树干茎流)BD FACSCanto二流式细胞分析仪(正)。

2.7。细胞呼吸的评估

细胞生存能力估计使用3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。转基因的细胞培养与不同浓度(5、10、25、50、100、500年和1000年μ米)的CuSO₄(Sigma-Aldrich) 5天在96孔板( 细胞/)和MTT的解决方案(最终浓度为0.5毫克/毫升)被添加到每个实验结束前2 h。接下来,媒介是吸气和显色反应product-formazan-was随着二甲亚砜(DMSO,σ)。相对应的吸光度线粒体脱氢酶活性的测定在BioTek PowerWave XS标在波长570纳米。

2.8。评价细胞的生存能力在氢Peroxide-Induced氧化应激

细胞被播种在96孔板( 细胞/)和高度为24小时。随后5天后hASCs预培养的通用汽车与CuSO补充₄(浓度:0μ50米,μ米,100μ米),细胞受到氧化应激引起的过氧化氢(最终在生长介质浓度1毫米)。24小时后,细胞生存能力评估与MTT测试如上所述。

2.9。RNA分离和定量实时PCR

基因表达分析,对asc人类被播种Primaria™细胞培养菜(Ø60毫米)的密度 细胞/厘米²在通用。一旦他们达到大约80%的融合,他们暴露在通用25μ或100μM CuSO₄5天。隔离的总RNA进行使用RNeasy迷你包(试剂盒)。RNA浓度和纯度进行评估spectrophotometrically NanoDrop nd - 1000 (NanoDrop Technologies, Inc .)。的转换进行总RNA cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类)根据制造商的指示。实时PCR是一式三份ABI棱镜7500序列检测系统(应用生物系统公司)使用预混料Taq交货(豆类)主混合实时PCR和特定TaqMan引物和探针(应用生物系统公司):胶原蛋白I型α1 (COL1Α1)Hs00164004_m1 III型胶原α1链(COL3A1)Hs00943809_m1 scleraxis (SCX)Hs03054634_g1,莫霍克同源框(类似MKX)Hs00543190_m1。酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白泽塔(YWHAZ)Hs03044281_g1用作看家基因。每个样本重复进行了分析。计算的相对基因表达是2^−ΔΔCt方法。参考样品总是同一捐献者的未经处理的细胞培养的并行执行。细胞从3捐助者被用于每个执行的两个独立的实验。

2.10。免疫印迹分析

对细胞进行蛋白质含量的分析,对asc人类被播种在Primaria™细胞培养菜(Ø100毫米)的密度 细胞/厘米²在通用。一旦他们达到大约80%的融合,他们暴露在通用25μ或100μM CuSO₄5天。未经处理的同一捐赠者的细胞培养在并行控制。为了获得完整的细胞溶解产物,里帕缓冲区(Sigma-Aldrich)蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。蛋白质浓度溶解产物是由Bio-Rad蛋白质测定染料试剂按照制造商的指示(Bio-Rad实验室Inc .)。相同数量的蛋白质每样例(50μg)是应用于凝胶,通过sds - page来解决。蛋白质被转移的PVDF膜。后续阻塞后膜与脱脂奶粉5% TBST缓冲区,一夜之间,膜被孵化与适当的主要抗体解决方案:兔多克隆抗体anti-collagen我(Abcam ab34710 1: 500),兔多克隆抗体anti-collagen三世(Abcam ab7778 1: 500),兔多克隆抗体anti-Mohawk (LSBio aa46 - 75 1: 1000),兔多克隆抗体anti-Scleraxis (pa5热费希尔科学- 23943,1:1000),或兔多克隆抗体anti-actin(圣克鲁斯生物技术、sc - 1616 r, 1: 250)。接下来,膜被洗3次15分钟TBST孵化和二次抗体(稀释1:5000)与近红外(IR)共轭荧光团(IRDye 800连续波或IRDye第680位)。分析了膜使用ChemiDoc议员成像系统(Bio-Rad实验室Inc .)和集成光密度(IOD)每个乐队的量化使用图像实验室软件(Bio-Rad实验室Inc .)。细胞从3捐助者被用于每个实验。免疫印迹分析从三个独立执行实验一式三份。

2.11。分泌活动的相对水平的确定(蛋白质组分析器)

比较之间的细胞因子分泌的概要文件控制hASCs,铜sulfate-treated hASCs,和人类tendon-derived细胞(TCs)使用蛋白质组执行分析器,膜基抗体阵列,使同时确定102个人类细胞因子的相对水平在不同的生物材料。对于这个实验,细胞培养有/没有50μM CuSO₄5天。在过去的48小时的实验中,替换为无血清培养基生长介质,即。,DMEM-low glucose supplemented with 3.5% bovine serum albumin and antibiotic solution (1.0% Penicillin-Streptomycin) with/without cupric sulfate. In parallel, tendon-derived cells were cultured in the same conditions (without CuSO₄)。上层清液被收集并冻结在-80°C整除。进行蛋白质组分析器,ASC上层清液从两个独立的捐助者是汇集和进一步措施根据制造商的指示进行。

2.12。Transwell迁移分析

CuSO的影响₄治疗hASCs定向迁移的研究用细胞培养插入8μ孔隙大小(Thincert™,长葛)。这个协议是基于先前所描述的方法我们组(20.]。在基底室(24-well板的底部),无标号从每个捐赠者对asc ( )分别播种的浓度 。播种后第二天,细胞CuSO对待₄在浓度的25、50或100年μm细胞培养在通用汽车作为控制。测试是在重复执行。3天后,插入被放置在每一个。细胞从两个不同的ASC人口集中和沾染了红色荧光染料DilC18 (5) - ds (1,1 - - - - - -dioctadecyl-3 3 3 ,3 ,tetramethylindodicarbocyanine-5 5 - - - - - -二磺酸,), 和 (AAT Bioquest)。这个池构成人口迁移实验和样品是一样的。这些细胞被播种的浓度 在每个插入。板插入在37°C和5%孵化有限公司₂在接下来的48小时,允许细胞迁移从插入到基底隔间。之后,插入被移除,井与4%多聚甲醛固定细胞(10分钟,RT)和细胞核可视化与DAPI染色(20 ng / ml的DAPI解决方案4分钟,RT)。此外,细胞迁移使胰蛋白酶化从底部的插入;他们允许附加在一夜之间并固定,与DAPI染色。的细胞可视化成像阅读器Cytation™1 (BioTek)和计算Gen5 3.04软件。计算迁移/刺激细胞的数量从6个不同的领域来看,在每一个。迁移细胞被确定基于红色荧光(染色)。刺激人口评估是基于核的数量- DID-stained细胞的数量。迁移细胞构成之和,从插入的底部和这些脱离底部插入。字段的观点有相同的位置在所有井和之前任意选择分析。 The ratio of migrating cell numbers (with red fluorescence, FigureS1A”)刺激细胞数(无标号,图S1A”)是计算根据以下方程:

DIDf迁移细胞的数量(沾)从插入,经久不衰是迁移细胞的数量(彩色),脱离底部的插入、和DAPI是细胞核的数量(与DAPI染色)。刺激细胞的细胞核和DIDf细胞数。

至少有5000人迁移细胞每治疗纳入分析。

2.13。SOD1活动分析

细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性是评价使用商用比色试验(超氧化物歧化酶比色活动设备;英杰公司)和黄嘌呤氧化酶根据制造商的协议。黄嘌呤氧化酶产生超氧化物阴离子,促进形成一个紫色的产品。这个反应是抑制超氧化物歧化酶。总之,hASCs被播种密度 细胞/厘米²在通用Primaria™细胞培养菜(Ø100毫米),CuSO对待₄当他们到达大约80%汇合。5天后hASC暴露在25μ或100μM硫酸铜,细胞细胞溶解使用缓冲区里帕没有洗涤剂(50毫米三、150毫米氯化钠)蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。衬底的解决方案是添加到细胞溶解产物在96孔板和标准,以及在450纳米测量吸光度值为空白板。接下来,黄嘌呤氧化酶的解决方案是添加到分析井的比率1:2的衬底。20分钟后在室温下孵化,吸光度测定无限200 PRO标(Tecan)在450海里。SOD的活性成反比的吸光度值和引用标准曲线。在每个示例中,蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂(Bio-Rad实验室Inc .)为了规范化SOD活性。分析了标准和样品一式三份。

2.14。LOX活性测定

赖氨酰化氧酶活性估计使用商用荧光测定(赖氨酰化氧活动试验设备;Abcam)根据制造商的指示。简单地说, 细胞/厘米²被播种在Primaria™细胞培养菜(Ø100毫米)和在达到约80%融合和25他们培养吗μ或100μM CuSO₄5天。收到细胞溶解产物使用缓冲区里帕没有洗涤剂(50毫米三、150毫米氯化钠)蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich),应用于96孔板在一式三份。液态氧的反应已经准备和添加到混合细胞溶解产物1:1的比例。30分钟后孵化(37°C,从光保护),荧光强度测量无限200 PRO微型板块读者(Tecan) 。在每个样本,LOX的活性是规范化使用Bio-Rad蛋白质测定蛋白质浓度测定染色试剂(Bio-Rad实验室Inc .)。细胞从3捐助者被用于三个独立的实验。

2.15。统计分析

所有统计分析进行了使用STATISTICA软件(StatSoft®)。首先,分析了数据分布群体内部使用Shapiro-Wilk测试。相关数据和异常的组织分布进行了分析使用Wilcoxon配对符号秩检验。学生的 - - - - - -测试是用来比较值组与证实了正态分布。意义是 ,和图表给出了 (SEM)。

3所示。结果

脂肪tissue-derived细胞收集从三个健康的捐赠者和播种塑料培养皿中。细胞坚持这道菜的表面,形成殖民地。的意思是表达CD44、CD73 CD90、CD105达99.6%,97.8%,83.9%,和99.7%,分别为( 捐助者)。的意思是表达造血标记(CD11b的鸡尾酒,CD19、CD34、CD45、和HLA-DR)达1.98%。Multilineage分化能力的孤立hASCs已经被成功证实分化为脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞(图1)。

3.1。硫酸铜在hASC呼吸的影响

细胞呼吸的hASCs随着硫酸铜浓度降低后5天的孵化,这是CuSO显著降低₄浓度的10μM和所有的浓度更高。细胞生存能力的下降10、25、50、100年、500年和1000年μ米的CuSO₄达7.6%,14.6%,20.2%,26.9%,53.3%,和90.9%,分别控制相比,未经处理的细胞(图2)。

3.2。硫酸铜的影响hASCs Tenogenic分化

经过5天的博览会在硫酸铜(25μ米和100μ米)的表达COL1α1hASCs相比减少未经处理的控制细胞(平均下降21.7%和27.1%,分别 )。同时,没有明显的差异与tenogenesis相关的其他基因的表达,也就是说,COL3α1,类似MKX,SCX(图3)。另一方面,COL1的蛋白质水平α5天治疗后1略升高hASCs硫酸铜和这对25增幅显著μM CuSO₄( 与控制, )。类似MKX的SCX蛋白质含量和脂肪tissue-derived基质细胞暴露在硫酸铜降低相比,在未经处理的控制细胞(25 MKX-mean下降16.3%μM CuSO₄处理细胞,SCX-mean在100年下降26.8%μM CuSO₄治疗细胞与对照组,分别p< 0.05)。然而,COL3α1蛋白质水平保持不变(图4)。

3.3。硫酸铜hASCs分泌的细胞因子的变化

一般人类tendon-derived细胞显示明显低分泌活动相比,治疗和铜sulfate-treated hASCs。只有8 102分析细胞因子的分泌是未经处理的hASCs相比tenocytes高。他们VCAM-1 ( ),RBP-4 ( ),relaxin-2 ( ),MIP-3β( ),抵抗素( ),肿瘤坏死因子-α( ),I-TAC ( ),和IL-17A ( )。有趣的是,所有上述细胞因子的分泌,除了VCAM-1,也提升hASCs暴露5天到50μM硫酸铜相比控制的细胞。此外,CuSO₄治疗SDF-1的分泌增加α( 与控制)和激肽释放酶3 ( 与控制)。另一方面,tenocytes和CuSO₄对待hASCs显示显著减少分泌白细胞介素,il - 6 ( 分别为0.04与控制)和引发( 分别为0.14与控制)(图5)。

3.4。硫酸铜hASCs的迁徙能力增加

Transwell迁移试验表明,博览会硫酸铜人类脂肪tissue-derived基质细胞的刺激他们的能动性和它与CuSO的浓度呈正相关₄。迁移细胞的数量与刺激人口硫酸铜处理提高21%和56%相比,控制CuSO未经处理的细胞₄50 - 100的浓度μ分别为M(图6)。低浓度(25μ米)的硫酸铜没有改变hASCs的迁移能力。

3.5。硫酸铜积极调节超氧化物歧化酶的活性SOD1 hASCs

在高浓度硫酸铜(100μ米)5天的文化导致刺激细胞内超氧化物歧化酶(SOD1)活动( 与控制)而CuSO₄在低浓度(25μ米)不改变铜酶的活动(图7(一))。定义是否SOD1活动增加与高浓度的CuSO hASCs治疗₄与抗氧化应激增加,24小时后我们决定细胞生存能力与1毫米h孵化₂O₂。peroxide-induced氢氧化应激显著降低细胞呼吸治疗hASCs ( )。细胞内氧化应激下的生存能力下降preincubated以前50μM硫酸铜是稍微不那么深刻,但仍显著控制细胞培养相比,通用汽车没有暴露在H₂O₂( )。与100年的预培养细胞μM CuSO₄导致更高的抗氧化强调这些细胞的生存能力没有明显低于未经处理的细胞的生存能力( );然而,它也没有明显高于无预培养细胞的可行性与硫酸铜和暴露于H₂O₂(图7 (b))。

3.6。硫酸铜刺激的活动赖氨酰化氧hASCs (LOX)

治疗与硫酸铜hASCs 5天的文化导致了赖氨酰化氧活动增加和呈正相关,CuSO的浓度₄(图7 (c))。骨髓间充质低剂量的硫酸铜的博览会(25μ米)导致LOX活性增加了73% ( )相比,控制细胞与高浓度的CuSO而治疗后₄(100μ米),酶活性增加2.13倍( )。

4所示。讨论

密集的研究工作在间充质基质细胞的特性已经进行了许多年。自从发现他们分化成多种细胞类型的能力,它们的免疫调节特性和分泌各种细胞因子和生长因子,msc已经开始被视为一个有前途的治疗用的工具,包括组织和器官再生。如前所述,msc可与各种组织,其最常见的来源是骨髓和脂肪组织。在我们的研究中,我们使用的脂肪tissue-derived间充质基质细胞,由于这个细胞类型更容易获得,微创,和更有效的比从骨髓msc的隔离(21]。相信除了他们的证据确凿的能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞,细胞必须满足的标准之一,同时被认为是msc (22),这些细胞也可以分化成其他类型的细胞,例如,tenocytes。然而,到目前为止,标记特定的仅供tenocytes尚未建立。tenocytes的特征是生产大量的细胞外基质(ECM),特别是,I型胶原蛋白,在少量,III型胶原蛋白。然而,这些在许多类型的细胞蛋白质表达。也有一些转录因子,肌腱的发展中扮演着重要角色,包括scleraxis (Scx),这是参与ECM的分化和组织肌腱,(23)和莫霍克(类似Mkx),在肌腱的过程是至关重要的增长和胶原纤维的成熟(24]。我们有5天的治疗后的效果评估基于文献数据表明,基因和蛋白质表达的变化检测的3^{理查德·道金斯}和7^th天tenogenesis [3,25]。

在提出研究中,我们审查的影响,铜补充tenogenic分化hASCs通过确定转录因子的表达(SCX和类似MKX)和胶原蛋白类型我和III转录和蛋白质水平的产品。硫酸铜治疗不积极影响与tenogenesis相关分子的表达(图3)。然而,I型胶原蛋白的水平,他的记录是减少控制相比,后被提升至25日为期5天的博览会μM CuSO₄(图4)。同样,Heraud等人已经证明,人类铜补充胶原蛋白合成增加关节软骨细胞(26]。我们假设下胶原蛋白表达变化的影响铜化合物可能与赖氨酰化氧活性的影响。众所周知,液态氧稳定ECM结构开始交联的胶原纤维的过程19]。此外,历史数据表明,有一个积极的饮食铜剂量依赖性关系和鸡骨和肌腱(赖氨酰化氧活动27]。事实上,我们的研究结果清楚地表明,在hASCs LOX的活性显著升高的影响下CuSO₄和它的浓度呈正相关,(图7 (c))。有趣的是,Atsawasuwan等人直接与TGF表明液态氧β1和抑制信号通过SMAD3 [28]。此外,Havis等人表明TGFβ/ SMAD2/3信号参与鼠标中胚层干细胞的分化对肌腱血统体外和体外29日]。这些结果综合起来可能是一个线索的解释类似MKX下降和SCX生产由hASCs CuSO的影响₄在这项研究中观察到。有可能增加液态氧抑制TGF的活动β信号(msc分泌TGFβ行动在一个自体和旁分泌的方式)。这种抑制会导致抑制tendon-associated转录因子的表达。然而,这只是一个假设需要进一步验证。另一方面,液态氧活动增加后CuSO的影响₄可以促进胶原蛋白的稳定过程中产生的愈合肌腱受伤。即使移植不会分化成tenocytes也分泌液态氧能作用于胶原蛋白形成的其他细胞。这可能加速肌腱修复的过程。

很高的期望使用间充质基质细胞治疗的目的是不仅与multilineage分化的能力有关,而且还与分泌各种细胞因子作为化学引诱物存在的其他细胞组织再生过程中是必要的。虽然没有积极分子的表达变化与tenogenesis CuSO下直接相关₄治疗,分泌的hASCs后5天暴露在50μM硫酸铜与未经处理的不同细胞和类似于人类tenocytes的分泌剖面(图5)。增加分泌的细胞因子在脂肪tissue-derived基质细胞暴露于CuSO₄,有一个基质细胞衍生因子- 1α(SDF-1αCXCL12),众所周知,促进基质细胞的迁移能力30.,31日]。msc的能动性增加至关重要的招聘网站的伤病,我们检查了硫酸铜是否能够积极影响hASCs的迁移过程。事实上,transwell迁移试验证明CuSO₄刺激脂肪的能动性tissue-derived msc(图6)。可能这种效果是由于高分泌的CXCL12这些结果与趋化因子的分泌增加协议与CuSO治疗后₄(蛋白质组分析器分析,图5)。这些结果发现确认陈等人的最新研究结果表明,铜补充提高移民对骨骨髓来源间充质基质细胞(32]。作者表明,硫酸铜的作用与细胞骨架重塑相关引起的低氧诱导因子1α——(Hif1α-)依赖upregulationρ家族GTPase 3 (Rnd3)。我们的结果显示额外的解释这现象CXCL12分泌增加。有可能两个提到的机制发挥作用的提升MSC CuSO的迁移影响₄。我们的结果在这方面似乎特别有趣的作为CXCL12吸引不仅间充质基质细胞,而且其他干细胞和祖细胞(33]。这是证明当地CXCL12浓度增加促进肌腱受伤的治疗。沈et al。34]表明CXCL12纳入针织silk-collagen海绵支架加强肌腱再生的效率加快招聘的纤维母细胞和肌腱细胞外基质生产相比没有CXCL12脚手架。

有趣的是,另一个蛋白质分泌增加CuSO礼物₄治疗对asc和tenocytes治疗hASCs relaxin-2。虽然松弛素被认为是主要是妊娠相关激素,有证据表明它可能影响周边组织,例如,tendon-reducing胶原酶激活的刚度和减少组织胶原含量(35]。

硫酸铜建立也影响了另一个copper-dependent酶的活动在人类脂肪tissue-derived基质细胞。SOD活性测定表明,添加高水平的CuSO₄培养基的增加细胞内超氧化物dysmutase(图的作用7(一))——酶保护细胞免受活性氧发生的有害影响的炎症和组织损伤。这可以有利于肌腱损伤后愈合,ROS水平的增加可能诱导自噬在移植细胞进而可以切换从生存途径导致细胞死亡的路径在不利条件下36]。获得的结果和结果是一致的,无论是饮食和注入铜鼠红细胞中SOD活性升高(37),CuSO₄溶液注入大鼠肝脏SOD活性增加(38]。也观察到是硫酸铜的剂量越高,越高的存活率hASCs在氧化应激条件下,尽管这些结果没有达到统计学意义相比,细胞暴露于氧化应激没有与CuSO预孵化₄(图7 (b))。这可能是由于这样的事实:过氧化氢诱导的氧化应激是一个产品,不是一个衬底,超氧化物歧化作用,酶催化反应的SOD (39]。此外,在铜离子的存在,H₂O₂可以转化成氢氧自由基在芬顿反应(40]。

有越来越多的研究涉及使用MSC移植为了提高受伤的肌腱的愈合。总结我们的研究结果,我们不能说明硫酸铜积极治疗可以作为一个额外的因素影响人类脂肪tenogenesis tissue-derived基质细胞;然而,某些CuSO浓度₄可以刺激的迁徙能力hASCs可能增加它们的有效性达到受伤的网站,在那里他们可以通过他们的免疫调节特性导致肌腱愈合。此外,接触CuSO₄改变了分泌的脂肪tissue-derived msc和增加的活动copper-dependent enzymes-lysyl氧化酶参与胶原纤维和超氧化物歧化酶的稳定防止细胞氧化应激和炎症的影响。因此,硫酸铜补充可能有益影响肌腱再生不通过tenogenic分化的诱导,但通过改善人体脂肪基质细胞的招聘网站的伤害,在那里他们可以分泌大量的生长因子和细胞因子作为化学引诱物,从而加速愈合过程。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可以从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究由国家研究和发展中心的资助(批准号STRATEGMED1/233224/10 NCBR / 2014;项目开始)。

补充材料

图像自动成像阅读器Cytation™1:,“,“现在相同的视野。细胞迁移的上层舱插入沾了(红色);细胞核与DAPI染色(蓝色)。”和“演示的方法分析(核编号,和“迁移细胞编号);酒吧规模:1000μm。(补充材料)

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版权

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