在缺氧条件下，核髓细胞条件培养基促进间充质干细胞分化为细胞核状细胞样细胞

抽象的

腰痛（LBP）是全球的主要物理和社会经济挑战。由于椎间盘（IVD）变性，核拷贝（NP）与LBP直接相关。IVD退化主要是由于在老化和变性期间发生的IVD中的结构和基质相关变化引起的。间充质干细胞（MSCs）可以在特定的刺激条件下分化为多个间充质谱系。该研究旨在评估核骨髓细胞（NPC）条件培养基的促进MSCs表达的有效性，并确认脊柱研究兴趣组最近推荐的健康NP表型标志物的表达。在常氧和缺氧条件下使用定量聚合酶链反应（QPCR）和蛋白质印迹研究表达。QPCR和Western印迹显示在缺氧条件下培养的MSCs中NP标记表达的显着上调，并与在常氧条件下培养的那些相比，用50％或100％NPC条件培养基处理。在与对照组（Aggecan，）相比，在100％NPC条件培养基存在下最高（ ；Brachyury， ；胶原蛋白II, ；KRT8， ；KRT19, ；嘘, ）.用50％NPC条件培养基处理的MSCs中基因的表达水平也显示出与对照组相比的上调（胶原II， ；KRT8， ；KRT19, ）.这些发现表明，NPC条件培养基刺激了MSC分化成具有不同特征的NP样表型。结果可以为IVD再生的策略提供信息。

1.介绍

下腰痛(LBP)是全世界致残的主要原因[1，超过84%的人在一生中至少会受到一次影响[2］．虽然可能是多因素，但LBP的潜在病因未知。椎间盘（IVD）变性是主要的临床介绍。椎间盘退化的主要原因是组织分解，主要是由于衰老，饮食差，遗传遗传或伤害[3.］．IVD退行性变是一个过程，通常由IVD内的生物力学变化引起。IVD变性的原因尚未完全阐明，但估计包括环境和遗传因素[4］．椎间盘退变过程中，常驻细胞发生各种稳态改变，导致降解的组织合成代谢和升高的组织分解代谢[5］．椎间盘退化可以由椎间盘组织脱水，蛋白质苷e损失，纤维化组织形成和椎间盘高度减少引起[3.，6］．胶质细胞外基质分解，导致纤维组织形成，使髓核细胞(NPCs)应变[7，8］．

目前的治疗策略提供症状性疼痛浮雕，而不是IVD退化的潜在病因的解决方案。脊柱融合和椎间盘切除术是LBP最广泛使用的手术治疗方法。在这些外科手术过程中，去除退化或突出的椎间盘，附近的盘与金属棒和骨水泥融合;后者用于椎体成形术和气球脑膜成形术[9，10.］．虽然手术的目的是缓解疼痛，但患者最终会经历持续的疼痛和脊柱活动减少[11.］．由于生物力学变化，这些手术可能会加速某些IVD节段的退行性变[12.，13.］．由于目前治疗的远期疗效较差，IVD退行性变的患病率越来越高，需要解决IVD退行性变的潜在发病机制，恢复正常的IVD功能，而不是简单地达到减轻疼痛的目的。因此，生物和细胞为基础的治疗是必要的替代治疗IVD退行性变。

基于细胞的疗法包括在退化盘中植入自体NPC或干细胞，目的是通过在IVD变性早期取代NPC来恢复IVD代谢稳态和减少炎症。间充质干细胞（MSCs）是基于细胞疗法的重要选择。MSCS是最常见的和广泛使用的细胞用于再生目的[14.］．研究表明，MSCs可分化为np样细胞，可能为IVD再生提供良好的细胞来源。此外，有研究表明MSCs与NPC条件培养基共培养可分化为np样细胞，并获得与NPC相似的表型[15.］．此外，在脊索细胞条件培养基中培养的MSCs在IVD内合成高水平的蛋白多糖，可能是通过代谢物、生长因子和细胞外基质蛋白刺激NPCs [16.- - - - - -18.］．因此，MSCs对IVD再生具有很高的容量[19.］．

骨科研究协会脊柱研究兴趣小组表示HIF-1稳定表达α.、glut1、骨胶蛋白/胶原蛋白II ( ），SHH，BRACHYURY，KRT18 / 19，CA12和CD24对于脊柱健康是必要的[20.］．然而，需要在基因和蛋白质水平进一步研究，以更好地了解MSC向np样细胞的分化。因此，本研究的目的是确定鼻咽癌条件培养基对常氧和缺氧条件下培养的MSCs表达的影响。采用定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹(western blotting)检测mRNA和蛋白水平，以探索可能促进间充质干细胞分化为np样细胞的基因和蛋白表达的变化，从而帮助治疗IVD变性。

2.材料和方法

2.1。NPC的分离与培养

东南大学动物保护与使用委员会批准了本研究中所有的动物实验。20只雄性sd大鼠(8周龄，200 ~ 300 g)行CO安乐死₂．如我们之前的研究所述，分离出NP组织[21.］．NPCs在含10%胎牛血清的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)/F-12中培养;Gibco, Grand Island, NY, USA)和5% CO下1%青霉素-链霉素溶液₂和21%啊₂在37°C。使用0.25%胰酶- edta (1 mM)溶液(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)收获细胞并进行传代(1:2);在第1-3代收集细胞。每隔3天更换一次培养基。实验使用NPC条件培养基(第3段)。

2.2。MSC培养在50％或100％NPC条件培养基中

Sprague-Dawley大鼠骨髓间充质干细胞购自Cyagen Biosciences(中国苏州)。MSCs在含10%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12培养液中培养。所有细胞均在5% CO下培养₂和21%啊₂在37°C。每隔3天更换一次培养基。来自第5段的细胞在我们的研究中使用。实验组MSCs在50%或100% NPC条件培养基中培养7 d，对照组MSCs在含10%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12培养液中培养。对照组培养基和实验组条件培养基每周更换2次。

2.3。缺氧条件下的细胞培养

npc在缺氧环境中培养(3131培养箱;Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)在93%氮的条件下₂，5％的co₂，2％o₂在37°C (22.］．NPCs在添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的新鲜DMEM/F-12中培养，缺氧3 d。如上所述，实验中使用了NPC条件培养基(第3段)。MSCs也在缺氧环境中培养(3131培养箱;在93%氮的条件下₂，5％的co₂，2％o₂在37°C (22.］．实验组MSCs在50%或100% NPC条件培养基中培养7 d，对照组MSCs在含10%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM/F-12培养液中培养。对照组培养基和实验组条件培养基每周更换2次。

2.4。定量聚合酶链反应

从NPC和MSC中提取总mRNA，两者在6cm的平板下，在6厘米的常氧和缺氧条件下分别在第3天和7天。使用通用RNA提取试剂盒进行mRNA提取（9767; Takara，大连，中国）进行。使用Primescript RT试剂盒与GDNA橡皮擦（RR047; Takara）的指令进行逆转录进行逆转录。使用Sybr Green PCR主混合物（Roche Applical Science，Penzberg，Germany）进行了QPCR分析（roche应用科学，德国）（应用生物系统，福斯特城，USA，USA）。QPCR测定混合物含有0.5 μ.反向引物的L (10μ.m），2 μ.l c cDNA模板，0.5 μ.L正向引物(10μ.m），10 μ.L Sybr绿色解决方案，7 μ.我的dh₂O.基因特异性引物序列列于表中1．靶基因表达水平被标准化为β-actin使用2^-ΔΔCt循环阈值方法。

2．5．蛋白质提取和Western Blotting

在常氧和缺氧条件下培养的npc和MSCs分别放在冰上，收获，并在第3天和第7天用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液清洗。用全细胞裂解试验缓冲液(KeyGen，中国南京)提取总蛋白。蛋白质浓度的测定采用双氰菊酯酸法(Beyotime，中国，江苏)。蛋白通过10% SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)。用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞膜1.5小时，然后用一抗孵育过夜(见表)2）在4°C，温和摇晃。随后，将膜与二抗（AB6721,1：5000; ABCAM，剑桥，英国）一起温育，将其在室温下在5％BSA中稀释1小时。使用Supersignal West Femto化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）检测免疫标签。通过定量密度分析测定相对蛋白表达水平并标准化为水平β肌动蛋白。

2.6。免疫荧光染色显微镜

将NPC在12孔板中涂覆，并在缺氧和常氧条件下保持3天。然后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟。在玻璃底部载玻片（Cellvis，山景，CA，USA）上的NPC在含有5％BSA和PBS中的0.1％Triton X-100的缓冲液中封闭20分钟。然后，将NPC洗涤三次并用一抗抗体在4℃下温育过夜（表2）.细胞洗涤后，用二抗(Alexa Fluor 594山羊抗兔，1:10 00;Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)室温下1小时。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在室温下放置15分钟，并使用荧光显微镜观察(Olympus，东京，日本)。

2.7。统计分析

结果表示为 来自三个独立实验。使用RappPad Prism软件（Ver。7.04; GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行统计分析，并使用未配对的学生分析团体之间的差异 -测试。差异与 被认为具有统计学意义。

3.结果

３.１.常氧和缺氧条件下培养npc的基因表达

进行QPCR分析以表征在常氧和缺氧条件下培养的Sprague-Dawley大鼠NPC中的基因表达。结果表明，推荐的年轻健康NPC表型标志物在常氧和缺氧条件下表达。缺氧条件下，NPC的基因表达通常在常见氧化条件下显着高，虽然HIF-2α.在常氧条件下表现出更高的表达( ）.Ca3基因的表达水平低于Krt19，Shh，Eggecan，Brachyury，胶原II和HIF-1的表达水平α.在缺氧条件下（ ）(图1）.相比之下，CA12、CD24、Glut-1、KRT8和KRT18在缺氧条件下表达显著升高( ）(图1）.

３．２．常氧和缺氧条件下培养npc的蛋白表达

Western blotting分析了在常氧和缺氧条件下Sprague-Dawley大鼠NPCs中是否也表达了这些蛋白。值得注意的是，推荐的年轻健康鼻咽癌表型标记也在常氧和缺氧条件下表达。western blotting分析结果与qPCR结果一致，缺氧条件下表达量高于正常条件下。缺氧条件下KRT18、KRT19和Shh的表达水平较低( ），虽然胶原蛋白II，CD24，HIF-2α.， Glut-1, brachyury, HIF-1α.，ca3，krt8，聚糖和ca12不是（图2）.此外，CA12和aggrecan表达水平显著上调( ）在缺氧条件下(图2）.

３．3.免疫荧光染色显示npc蛋白表达模式

免疫荧光分析NPCs中的蛋白表达。所有推荐的年轻健康NP表型标记均在常氧和缺氧条件下培养的npc中表达。免疫荧光染色显示缺氧条件下表达水平显著升高。Aggrecan, brachyury，碳酸酐酶3,CD24, collagen II, Glut-1, HIF-1α., HIF-2α.、KRT8、KRT18、KRT19和Shh在缺氧条件下表现出广泛的染色(图)3.）.

3．4．常氧和缺氧条件下间充质干细胞的基因表达

进行QPCR分析以表征在常氧和缺氧条件下培养的Sprague-Dawley大鼠骨髓源MSC中的基因表达。与常规氧化条件相比，将MSCs的基因表达在缺氧条件下，50％或100％NPC条件培养基。与对照组相比，100% NPC条件培养基中表达上调最大(aggrecan， ；Brachyury， ；胶原蛋白II, ；KRT8， ；KRT19, ；嘘, ）.与对照组相比，还上调了50％NPC条件培养基条件的表达水平（胶原蛋白II， ；KRT8， ；KRT19, ）.然而，KRT18的表达水平与其他各自基因的表达水平相反，在50%或100% NPC条件培养基中，在常氧和低氧条件下，KRT18的表达水平均低于对照组(图)4）.

3．5．常氧和缺氧条件下间充质干细胞的蛋白表达

Western blotting分析了在缺氧和常氧条件下，这些蛋白是否也在大鼠骨髓来源的MSCs中表达。重要的是，50%或100% NPC条件培养基处理后，表达水平上调。western blotting结果与qPCR结果一致，缺氧条件下表达量高于常氧条件下。与对照组相比，100% NPC条件培养基中表达上调最大(aggrecan， ；Brachyury， ；胶原蛋白II, ；KRT8， ；KRT19, ；嘘, ）.与对照组相比，还上调了50％NPC条件培养基条件中的表达水平（聚集Checan， ；胶原蛋白II, ；KRT19, ；嘘, ）.此外，KRT18的表达水平与QPCR分析的结果一致，因为它在与对照组相比的50％或100％NPC条件培养基中的常氧和缺氧条件下较低（图5）.

4。讨论

关于IVD已有许多研究，但NP和npc的起源仍不清楚。然而，常规NP可以通过分子谱来表征。有证据表明，成熟的NPCs通过脊索谱系分化，而成人的所有细胞(如软骨细胞样细胞)在成熟过程中也从形态和大小不同的脊索谱系分化。这些研究还表明，某些标记对npc更有特异性[23.- - - - - -30.］．NPs位于缺氧环境中，适应IVD微环境。

MSCs是IVD再生的一种潜在细胞类型。在可用的细胞来源中，骨髓来源的间充质干细胞是常用的。许多研究报道，MSCs对NPC表型表现出强大的分化能力，这在临床试验中被证明是有用的。为了更好地了解间充质干细胞向np样细胞的分化，我们研究了50%或100% NPC条件培养基对间充质干细胞的影响。已有研究表明，脊索细胞和脊索细胞条件培养基对IVD退行性变有积极作用[31.，32.］．然而，这些积极作用是否适用于间充质干细胞尚不清楚。Aggrecan和collagen II表现出与健康鼻咽癌表型相关的增强表达，而MSCs暴露于脊索细胞条件培养基时表现出刺激作用(例如，上调蛋白多糖在IVD中的沉积)[33.］．

我们的研究是在常氧和缺氧条件下进行的。缺氧条件已显示出支持MSC向NPC表型分化的能力[34.］．我们在常氧和缺氧条件下培养了NPC和MSCs。我们使用50％或100％NPC条件培养基（第3段）用于治疗MSCs。用NPC条件培养基治疗对MSC分化具有更大的影响。在正常的NP中，仇杀蛋白和胶原蛋白II明显表达，并且在IVD退化中观察到聚集合成的丧失[35.］．也有证据表明HIF-1的常氧依赖性稳定α.驱动代谢糖酵解，可以有助于调节NPC中的聚集基因表达[36.］．在IVD变性期间，报告了增加的细胞衰老，以及减少的骨髓和胶原蛋白的产生[37.］．在我们的研究中，在50%或100% NPC条件培养基处理后，在缺氧条件下aggrecan和collagen II显示出明显的上调。总的来说，我们的研究表明，鼻咽癌条件培养基可能通过MSC分化向健康鼻咽癌表型促进再生。

我们的研究结果与关于据据据未生成的细胞的再生效果的其他研究的结果一致;具体地，预测NPC条件培养基含有某些营养成分和分泌生长因子[16.，38.］．我们以前的研究表明，MSCS通过维持生理过程来保存正常的NP组织稳定性来发挥至关重要的作用[39.］．然而，该研究也表明，鼻咽癌衰老导致IVD变性，而预防这种衰老可以减少IVD变性[40］．值得注意的是，我们的研究表明，在缺氧条件下，100% NPC条件培养基可以抑制间充质干细胞的衰老。

为了鉴定年轻健康NPC的推荐表型标志物，我们还在常氧和缺氧培养条件下检查了NPC标志物的表达。我们的研究表明，当NPC在缺氧条件下培养时，对NP标记的显着上调。Fox1，Pax1和Ca12在NPC中高度表达[30.]，而HIF-1α.在代谢上适应低氧和营养缺乏的条件[36.］．NP是IVD中最大的无血管组织，通过HIF-1的表达在生理上适应于在缺氧微环境中生存α.和HIF-2α.．HIF-2的表达α.是由NF-κ..B路，HIF-2α.在缺氧条件下降低水平[41，42］．我们的研究结果表明，MSC脱盐可以增强对IVD再生的NPC表型的分化。细胞外基质的减少是另一个重要的考虑因素。细胞外基质有组言和椎间盘纤维素介导的分解代谢的平衡受IVD变性期间促炎细胞因子不稳定性的影响[43，44］．因此，抑制这些炎性细胞因子的病理过程可能会刺激间充质干细胞的分化，导致细胞外基质沉积增强。值得注意的是，我们的结果显示aggrecan和collagen II的表达上调，这可以促进基质的形成。

Shh和Brachyury在开发的脊索中表达，在那里据诺奇鞘形成和NP Patterning需要它们[45- - - - - -47］．脊索表达的转录因子以及NP模式因子(Shh和brachyury)的存在指导着NPC的分化和生存。Shh和brachyury的表达水平是关于NPC本体论的信息[47］．Shh和brachyury水平随着年龄和IVD变性而下调[30.］．Brachyury，Eggecan和软骨素硫酸盐的表达水平增加是由老化盘中的Wnt信号激活引起的[48］．一些研究报告说，Brachyury也在一些成熟的NPS中表达[49，50］．在Tang等人的一项研究中，brachyury在正在发育的人类NP组织中表达[51］．因此，NP标记ShH和Brachyury的表达表明我们的研究中存在据据言细胞标志物，确认先前研究的结果[29.，30.，52］．此外，用100％NPC条件培养基处理的MSCs呈现出大量表达水平的Brachyury和SHH基因。假定这些结果表明MSC分化朝向类似NP样表型。

细胞角蛋白(KRT8、KRT18和KRT19)以前被鉴定为大鼠npc的标志物。这些基因也在正常的上皮细胞中表达，推测为人类脊索特异标记，尽管KRT19单独在人类npc中得到证实。然而，KRT19在衰老椎间盘中表达减少[24.，53，54］．Minogue等人的微阵列研究。鉴定了几种基因的NP特异性表达模式，包括KRT8，KRT18和KRT19，在牛NPC中[49］．细胞角蛋白具有独特的细胞骨架功能，有助于维持稳定的细胞结构，调节fas介导的凋亡，并调节细胞大小和蛋白质合成[55］．它们在组织发育和分化中也发挥着重要作用。KRT8、KRT18和KRT19在大鼠和人类npc中均被识别[24.，25.，56］．Rodrigues-Pinto等报道，KRT8、KRT18和KRT19在IVD脊索细胞中均有表达[57］．在最近的一项研究中，无论年龄还是退化，在NPC中检测到KRT8和KRT18，而KRT19表达在老年IVD中增强[29.］．事实上，KRT8、KRT18和KRT19在npc缺氧条件下表达显著升高。这些结果与MSC表达一致，除了KRT18。通过qPCR和western blotting分析，KRT18在常氧和低氧条件下表达均较低。IVD的缺氧环境促进个体发育和细胞功能的维持。

在这项研究中，我们评估了推荐的NP表型标志物，并研究了NPC条件培养基对常氧和缺氧环境中的NPC条件培养基的影响。我们得出结论，这些推荐的表型标志物在常氧和缺氧培养条件下表达，并且NPC条件培养基含有影响基因和蛋白质表达在MSC中的分泌因子。因此，分泌因子可能会促进MSC分化成NP样表型。

5.结论

我们的研究提供了有助于鉴定健康鼻咽癌表型的数据。我们的结论是，npc表达功能活跃的HIF-1α., HIF-2α.，在常氧和缺氧条件下，Glut-1，蛋白，胶原II，Shh，Brachyury，Krt8，Krt18，Krt19，Ca3，Ca12和CD24。此外，NPC条件培养基将MSC分化促进到NP样细胞中。最后，该研究表明，NPC和MSCs可以适应缺氧微环境，其中缺氧刺激这些细胞以保持其特定特征。我们的研究为治疗IVD退化的治疗提供了基于细胞的治疗的科学依据。

数据可用性

可根据要求提供数据（详细信息联系信息：Arjun Sinkemani，Sinkemani@hotmail.com）。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81572170, no . 81572190, no . 81702190, no . 81702203, no . 81702201);中央高校基本科研业务费专项资金和江苏省研究生科研与实践创新计划项目(no . KYLX16_0302, no . KYCX17_0182, no . 2242016k40149, no . 2242017K3DN06);江苏省卫生和计划生育委员会科研项目(H201533)。

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