Caspase-4的角色和NLRP1 MCF7细胞Pyroptosis hUCMSC-Secreted因素引起的

文摘

间充质干细胞(msc)被广泛研究小说的发展为不同的癌症治疗方法,包括乳腺癌,女性癌症的主要形式。我们之前的研究表明,人脐带msc分泌的因素(hUCMSCs)在乳腺癌细胞系诱导pyroptosis MCF7和核糖核酸测序研究显示pyroptosis-related基因的表达增加caspase-4 (CASP4)和nucleotide-binding富亮氨酸重复pyrin domain-containing蛋白1 (NLRP1)pyroptotic MCF7细胞。会发生细胞pyroptosis通过规范化途径(包括caspase-1和NLRP1)或不在经典里的通路(包括caspase-4)。在这项研究中,我们首先确认inflammasome NLRP1形成的复杂和ASC参与MCF7细胞pyroptosis hUCMSC-CM引起的。此外,我们调查的作用CASP4和NLRP1在细胞MCF7 pyroptosis hUCMSC-secreted因素引起的使用shRNA-mediated转染CASP4或NLRP1在MCF7细胞。细胞毒性分析显示CASP4击倒NLRP1击倒也不可能抑制hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。基因和蛋白表达分析表明,hUCMSC-CM诱导pyroptosis主要通过规范化路径CASP4击倒MCF7细胞,但主要是通过不在经典里的通路NLRP1可拆卸的MCF7细胞。我们的研究为进一步的研究提供了一个基础,旨在阐明的精确机制hUCMSC-induced pyroptosis乳腺癌细胞和援助的乳腺癌的潜在治疗靶点的识别。

1。介绍

Pyroptosis,一种程序性细胞死亡伴随着一些促炎因子的释放,在抗感染的免疫反应中起着重要的作用。与pyroptosis涉及相关的形态学改变孔隙形成的等离子体膜,水涌入,细胞肿胀,以及随后破裂的质膜和释放细胞内的促炎的分子(1]。还存在在人类,pyroptosis是由炎症(caspase-1、caspase-4 caspase-5),这可能是由inflammasomes激活。inflammasome通路包括caspase-1-dependent规范化路径和caspase-1-independent不在经典里的途径(2]。Caspase-1活化诱发gasdermin D乳沟,从而导致细胞膜的孔隙的形成和il - 1的成熟和释放β和地震-细胞因子诱导pyroptosis [3]。Nucleotide-binding,富亮氨酸重复pyrin domain-containing蛋白1 (NLRP1), nod样受体(NLR)家族的一员,是一种重要的天然免疫分子(4]。在人类,它激活pro-caspase-1直接与它交互或间接通过招募适配器蛋白质ASC和pro-caspase-1形成inflammasome [5]。因此,NLRP1扮演着一个重要的角色在细胞pyroptosis由规范化的途径。典中的通路在人类包括激活caspase-4 / caspase-5 [2]。Caspase-4 / caspase-5劈开gasdermin D,从而引发pyroptosis [6]。在人类巨噬细胞,caspase-4激活嗜肺性军团菌诱导细胞死亡和il - 1α分泌(7]。细胞内的脂多糖(LPS)直接与caspase-4和诱发细胞pyroptosis [8]。

乳腺癌是女性癌症的主要类型(9),和乳腺癌发病率上升据报道在中国(10]。然而,一个有效的治疗乳腺癌还没有可用的。间充质干细胞(MSC)为基础的方法被广泛的研究发展的新的癌症治疗策略。人类脐带间充质干细胞(hUCMSCs)广泛应用于研究集中在癌症治疗由于其简单的可用性和没有道德问题(11- - - - - -13]。我们先前证明hUCMSCs pyroptosis诱导分泌的因素的乳腺癌MCF7细胞线。此外,RNA序列研究显示pyroptosis-related基因的表达显著增加CASP4和NLRP1在pyroptotic MCF7cells [14]。因此,caspase-4和NLRP1可能在这一过程中发挥作用。尽管一些机制的功能NLRP1和CASP4pyroptosis已知的影响这两个基因在细胞MCF7 pyroptosis hUCMSC-secreted引起的因素尚不清楚。因此,在目前的研究中,我们阐明caspase-4的角色和NLRP1 MCF7细胞pyroptosis hUCMSC-secreted因素引起的。我们的研究提供了可能的机制hUCMSC-induced pyroptosis在乳腺癌细胞,并可能为乳腺癌提供潜在的治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

乳腺癌MCF7细胞行(中国科学院昆明细胞银行昆明,中国)是维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco热费希尔科学™、苏州、中国)包含l谷氨酰胺、葡萄糖4.5 g / L和110 mg / L MSC-qualified丙酮酸钠,并配以10%胎牛血清(的边后卫;生物产业、澳大利亚)、100 mg / L链霉素和100 mg / L青霉素(Gibco热费希尔科学™,纽约,美国)在37°C公司为5%₂。

hUCMSCs被孤立的从人类脐带沃顿胶和确认如前所述14]。这项研究是医学伦理委员会批准的云南大学医学院,并获得了知情同意的捐助者。hUCMSCs在最低基本培养基培养α修改(αMEM;HyClone由通用电气医疗集团,北京)补充10% MSC-qualified的边后卫,100 mg / L链霉素,100 mg / L青霉素,10 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF;默克密理博,达姆施塔特,德国)在37°C公司为5%₂。第八段前hUCMSCs被使用。

2.2。shRNA向量

四组不同pGPH1 / GFP Neo向量(上海GeneChem有限公司有限公司、上海、中国)表达CASP4或NLRP1成分被用于CASP4或NLRP1可拆卸的。用于shRNA-mediated击倒的序列表中列出1。shRNA向量被测序鉴定,成功的目标序列的插入pGPH1 / GFP Neo向量和核苷酸序列的准确性确认(附加文件1)。

2.3。暴露MCF7细胞hUCMSC-Conditioned介质(hUCMSC-CM)

hUCMSCs培养在塑料水瓶(25厘米²;美国纽约康宁)。在~ 90% confluency,培养使用0.22中收集和过滤消毒μm Millex-GP过滤装置(微孔、Carrigtwohill、爱尔兰)。条件培养基(CM)准备使用80% hUCMSC-cultured介质和20%新鲜培养基,如前所述[14]。MCF7细胞被播种在6-well板块(康宁)的密度 细胞/毫升正常培养基和培养过夜。然后,细胞转染与2.5μ每使用Lipofectamine 3000 g shRNA表达向量试剂72 h。中当时hUCMSC-CM所取代。

2.4。ASC斑点染色

MCF7细胞被播种在24-well盘盖滑(美国纽约康宁)包含正常培养基和培养过夜。然后,媒介是hUCMSC-CM所取代。24小时后,细胞用4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100, 0.1%包含5% BSA和阻塞PBS缓冲。细胞被沾anti-ASC抗体(1:100;Proteintech、武汉、中国)和AlexaFluor488-conjugated二级抗体(1:200;热费希尔科学、与anti-NLRP1抗体(上海,中国),和1:100;圣克鲁斯生物技术)和AlexaFluor594-conjugated二级抗体(1:200;热费希尔科学、中国上海)。DAPI染色细胞核。细胞图像捕获使用倒置相差光学(徕卡DFC420C)。

2.5。膜联蛋白V / Propidium碘(PI)分析

MCF7细胞转染后收集在72 h和培养hUCMSC-CM 24 h。死细胞的百分比确定使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(CWBio,北京)。简而言之,胰蛋白酶消化后收集细胞没有与冷PBS EDTA清洗三次。这些细胞被resuspended绑定缓冲的密度 细胞/毫升,孵化与10μLπ和5μL膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) 10分钟37°C,并使用CyFlow空间分析流式细胞分析仪(Sysmex Partec)和FloMax 2.82软件(Sysmex Partec)。

2.6。LDH细胞毒性试验

细胞损伤的程度是决定使用LDH-Glo™细胞毒性试验(Promega,北京)。MCF7细胞被收集在转染后48 h,播种在96 -孔板(康宁)的密度 细胞/毫升,培养过夜。媒介是hUCMSC-CM所取代,这些细胞被培养24小时。然后,5μL培养介质添加到95年μL LDH存储缓冲区,和最终的解决方案是稀释5倍使用LDH存储器缓冲区。稀释标准解决方案准备每个制造商的指示。然后,50μL /标准样品与50孵化μL LDH检测试剂在每一个不透明的96孔板在20 - 25°C 1 h,发光是记录使用模数微型板块多模读者(特纳生物系统,加州,美国)。

2.7。逆转录定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)

MCF7细胞转染后收集在72 h和培养hUCMSC-CM 24 h。总RNA提取使用试剂盒™试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA的数量和质量是评估使用nano - 300分光光度计(杭州Allsheng仪器有限公司,杭州,中国)。First-stand互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript™RT与gDNA橡皮擦(豆类生物试剂盒。,北京,中国)。引物序列设计使用PrimerQuest工具(http://http: / / www.idtdna.com);序列表中列出2。q-PCR使用由于“快速上手”项目执行通用SYBR绿色大师(罗氏,曼海姆,德国)和Bio-Rad CFX96™实时PCR检测系统(Bio-Rad、上海、中国)。相对量化进行了使用比较Ct (2^{- - - - - -ΔΔCt})方法(15]。

2.8。西方墨点法

MCF7细胞转染72 h和培养hUCMSC-CM 24 h在50个细胞溶解μ包含0.5 L•瑞帕裂解缓冲(强)μL phenylmethylsufonyl氟化物(CWBio、江苏、中国)和孵化冰2 h。细胞溶解细胞孵化了50μL 2 x的sds - page蛋白加载缓冲区(Bio-Rad)煮10分钟。离心后,蛋白质样品受到10% sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜(默克密理博)。TBST膜被封锁(3.0 g Tris-HCl 8.0克氯化钠,Tween-20 0.1%,和pH值7.4)包含5%的脱脂奶粉1 h和孵化一夜之间在4°C主要抗体稀释GAPDH (1: 2000;CWBio、江苏、中国),caspase-1 (1: 500;圣克鲁斯生物技术、特拉华、美国),NLRP1 (1: 100;圣克鲁斯生物技术)、caspase-4 (1: 500;Proteintech,武汉,中国),ASC (1: 1000;Proteintech,武汉,中国)。膜是孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白或山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 2000;CWBio、江苏、中国)在20 - 25°C 1 h,然后与ECL衬底的解决方案(1):1 ( );CWBio、江苏、中国)。乐队是量化使用Photoshop 7.0,乐队的灰度值比率确定。

2.9。分泌IL - ELISA-Based量化α,il - 1β,地震

媒体MCF7细胞转染shRNA向量72 h(对照组)和媒体MCF7细胞转染shRNA向量72 h和培养hUCMSC-CM 24 h(治疗组)收集。所有的样品都存储在-80°C检测。IL -的数量α,il - 1β,地震MCF7细胞分泌的控制和治疗组使用人类IL -确定α酶联免疫试剂盒(ExCell生物科技、江苏、中国),人类il - 1β/ IL-1F2 Valukine™酶联免疫试剂盒(罗福斯生物制品、台湾、中国)和人工地震- Kit (OriGene,罗克维尔市,医学博士,美国)另外,根据制造商的指示。

2.10。统计分析

统计分析使用Microsoft Excel 2007和GraphPad棱镜5软件;图是准备使用GraphPad棱镜5软件。差异与值<0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。hUCMSC-CM治疗效果Caspase-1 mRNA和蛋白水平,Caspase-4, NLRP1 MCF7细胞

我们先前证明hUCMSCs诱导分泌的因素pyroptosis pyroptotic等MCF7细胞,细胞显示显著增加CASP4和NLRP1表达(14]。为了进一步证实这一结果,我们分析的表达CASP1,CASP4,NLRP1在hUCMSC-CM MCF7细胞培养48 h。RT-qPCR分析表明,CASP1,CASP4,NLRP1MCF7细胞培养在mRNA水平hUCMSC-CM更高(成倍增加 , ,和 ,比在控制细胞(分别) ;图1(一))。这些结果与我们之前的核糖核酸测序结果一致。

为了知道mRNA水平影响蛋白表达的变化,我们做免疫印迹分析。控制细胞相比,细胞培养hUCMSC-CM CASP1蛋白质水平有显著提高( ),CASP4蛋白质含量无显著变化( ),和NLRP1蛋白质水平显著下降( ;数据1 (b)和1 (c))。这些结果表明,这三种分子的蛋白质含量的变化是不一致的与各自的mRNA水平的变化。Caspase-1通常不活跃的形式存在于细胞pro-caspase-1。为了应对细胞压力或微生物感染,pro-caspase-1裂解p10和p20子单元,和激活caspase-1是四聚物组成的两个p20和两个p10子单元(p20 / p10) (16]。Caspase-1招聘炎症信号中心报告,使其激活可能通过增加局部的浓度pro-caspase-1促进单体的二聚作用[17]。全身caspase-1单体可以接受二聚、激活和self-cleavage只有当他们被雇来inflammasomes;这使得当地的单体浓度(高18]。在我们的研究中,pyroptotic MCF7细胞CASP1蛋白质水平有显著提高,这与这些理论是一致的。类似于caspase-1, caspase-4以非活性的形式存在于细胞及其活性形式是由两个p20和两个p10子单元组成的四聚物(p20 / p10)。在目前的研究中,pyroptotic MCF7细胞显示增加CASP4信使rna但不是蛋白质含量,可能是因为体内平衡,表明caspase-4激活需要pro-caspase-4消费,增加CASP4信使rna补充procaspase-4数量。NLRP1与适配器蛋白质交互ASC形成一个inflammasome复杂,这新兵pro-caspase-1 [5]。因此,减少NLRP1蛋白质含量在这项研究中观察到可能是因为NLRP1形成的蛋白质分子被NLRP1 inflammasome,和这些分子没有检测到的抗体用于免疫印迹。

3.2。Inflammasome效应形成的复杂NLRP1和ASC hUCMSC-CM-Induced Pyroptosis MCF7细胞

接下来,我们进行了免疫荧光分析调查是否NLRP1与适配器蛋白质ASC交互形式inflammasome复杂pyroptotic hUCMSC-CM MCF7细胞诱导。Colocalization NLRP1蛋白质和ASC蛋白质形成一个复杂的观察一些MCF7细胞培养在某些地区hUCMSC-CM(红色箭头,图2),和强大的colocalization和荧光强度的增加NLRP1和ASC蛋白质都pyroptotic细胞(白色箭头,图中观察到2)。这些结果表明,NLRP1可以与ASC组成一个inflammasome复杂的,这种复杂的参与hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。

3.3。的影响CASP4或NLRP1击倒hUCMSC-CM-Induced Pyroptosis MCF7细胞

执行RT-qPCR分析评估的基础上抑制成分的速度向量,向量shRNA -CASP4-100年,shRNA -CASP4-1104年,shRNA -NLRP1-1634年,成分-NLRP1-2523年被选为转染实验(附加文件2)。

我们第一次观察到的形态变化在hUCMSC-CM转染MCF7细胞培养。这些细胞的质膜完好无损,但显示pore-induced内陷。明显破裂质膜和细胞死亡(图3)。这些形态变化表明pyroptosis的发生与hUCMSC-CM转染MCF7细胞治疗后。

理解是否细胞死亡后下降CASP4或NLRP1击倒,我们执行膜联蛋白V-FITC /π分析CASP4可拆卸的,NLRP1可拆卸的MCF7细胞。FITC的数量⁺/π⁺细胞和FITC⁺/π^{- - - - - -}细胞hUCMSC-CM治疗后保持不变。然而,π的数量⁺/ FITC^{- - - - - -}细胞转染的细胞治疗后显著增加hUCMSC-CM 24 h。数量增加到 来 , 来 , 来 , 来 ,和 来 在细胞转染shRNA-NC(负控制),成分-CASP4-100年,shRNA -CASP4-1104年,shRNA -NLRP1-1634年,成分-NLRP1-2523年,分别为(数字4(一)和4 (b))。凋亡细胞的数量与目标基因转染组没有明显不同于NC组( )。这些结果表明,hUCMSC-CM治疗24小时诱导pyroptosis MCF7细胞组,包括与数控细胞转染。因此,MCF7细胞不能从hUCMSC-CM-induced获救pyroptosis通过抑制的表达CASP4或NLRP1。

为进一步证实了这些结果,我们评估细胞毒性的LDH水平在中通过测量与hUCMSC-CM转染MCF7细胞治疗。在所有细胞组LDH水平,包括数控集团hUCMSC-CM治疗24 h后增加;然而,没有观察到显著差异之间的LDH水平目标gene-transfected团体和NC组(图4 (c))。这些结果是一致的与膜联蛋白V-FITC /π分析和说明CASP4或NLRP1抑制无法阻止hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。

3.4。hUCMSC-CM治疗效果在转染MCF7细胞基因表达

尽管抑制CASP4或NLRP1基因表达没有抑制hUCMSC-CM在诱导MCF7细胞死亡的影响,我们试图阐明机制潜在pyroptosis感应MCF7细胞。在这里,我们分析了mRNA水平caspase-1, caspase-4, NLRP1CASP4可拆卸的,NLRP1击倒,NC-transfected细胞hUCMSC-CM对待。RT-qPCR分析(图5(一个))显示显著减少CASP4hUCMSC-CM-treated mRNA水平CASP4击倒MCF7细胞,相比NC-transfected MCF细胞( );然而,没有观察到的相当大的变化CASP1信使rna的水平CASP4可拆卸的MCF7细胞( )。此外,治疗hUCMSC-CM显著增加了NLRP1mRNA水平MCF7细胞转染shRNA -CASP4-100 ( )。的NLRP1信使rna水平NLRP1可拆卸的MCF7细胞最初明显下降( )但在治疗后增加hUCMSC-CM ( )。CASP4信使rna水平NLRP1可拆卸的MCF7细胞并没有改变明显( );然而,治疗hUCMSC-CM显著增加了CASP1mRNA水平MCF7细胞转染shRNA -NLRP1-2523 ( )。

进一步了解转染MCF7细胞蛋白水平的变化,我们进行免疫印迹。免疫印迹结果(数据5 (b)和5 (c))显示显著降低caspase-4蛋白质水平CASP4可拆卸的MCF7细胞( );然而,减少细胞转染shRNA -更加突出CASP4-100 ( )。相比NC-transfected MCF7细胞MCF7细胞转染shRNA -NLRP1-2523年明显下降NLRP1蛋白质水平( ),和hUCMSC-CM治疗进一步减少NLRP1这些细胞中的蛋白质含量。因此,成分,CASP4-100和shRNA -NLRP1-2523基因抑制更有效,我们选择MCF7细胞转染shRNA -CASP4-100和shRNA -NLRP1为进一步研究-2523。

3.5。两个Pyroptosis通路参与hUCMSC-CM-Induced Pyroptosis MCF7细胞

阐明的效果CASP4或NLRP1MCF7细胞pyroptosis击倒,我们调查pro-CASP1的蛋白质含量,CASP1裂解,pro-CASP4,裂解CASP4和ASC斑点的变化形成MCF7细胞转染shRNA -CASP4-100和shRNA -NLRP1-2523年。在CASP4击倒MCF7细胞,hUCMSC-CM治疗24小时显著降低的水平裂解CASP4但显著增加水平ofcleaved CASP1, ASC和NLRP1。这些发现表明,不在经典里的通路被抑制CASP4击倒MCF7细胞,hUCMSC-CM-induced pyroptosis主要通过caspase-1-mediated规范途径发生。相反,24 h与hUCMSC-CM治疗NLRP1击倒MCF7细胞并不影响裂解的水平CASP4 pro-CASP1但显著降低的水平CASP1分开。这表明NLRP1抑制并不影响不在经典里的通路,但可以降低裂解CASP1蛋白质水平。此外,ASC斑点NLRP1可拆卸的细胞明显低于CASP4可拆卸的细胞,表明inflammasome形成的抑制和随后的部分规范途径的抑制NLRP1可拆卸的细胞。因此,规范途径被抑制NLRP1击倒MCF7细胞,hUCMSC-CM-induced pyroptosis主要发生在这些细胞通过caspase-4-mediated不在经典里的途径。

il - 1α分泌caspase-1独立(19),但与caspase-4的活性呈正相关(7,20.],不在经典里的通路的关键因素。的分泌il - 1β和地震与caspase-1的活性呈正相关,一个关键因素的规范化途径21,22]。因此,我们评估了il - 1的水平α,il - 1β,地震-转染MCF7细胞培养基的对待hUCMSC-CM 24 h决定不在经典里的和规范的途径参与hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞在缺乏caspase-4或NLRP1,分别。对照组显示低三个细胞因子的分泌。相比之下,hUCMSC-CM-treatedNLRP1可拆卸的细胞,hUCMSC-CM-treatedCASP4可拆卸的细胞显示降低il - 1α但增加分泌il - 1β和地震-分泌(图6 (d))。这些结果与免疫印迹结果一致,确认中的通路抑制和hUCMSC-CM-induced pyroptosis主要通过caspase-1-mediated规范途径发生CASP4击倒MCF7细胞,而规范化途径抑制和hUCMSC-CM-induced pyroptosis主要通过caspase-4-mediated经典之中发生的途径NLRP1可拆卸的MCF7细胞。

4所示。讨论

乳腺癌的癌症起源于乳腺组织,分为五种类型根据其分子特征:鲁米那,腔的B, HER2丰富、基底/三阴性,和其他特殊类型乳腺癌的23]。治疗和预后的响应随乳腺癌的类型。因此,癌症治疗特定类型规定(24]。我们的研究集中在调查hUCMSC-CM对乳腺癌MCF7细胞线。MCF7细胞腔的一种类型,ER /公关积极和HER2阴性,ER-related基因的高表达和低扩散基因的表达(25]。通常,这是一个低级的癌症,预后良好。

msc展示几种有前景的应用程序在细胞治疗和基因治疗由于其独特的特点。msc和癌症之间的关系已被广泛研究,许多研究小组。几项研究表明,在癌症治疗中使用msc是一把双刃剑,可以抑制或促进肿瘤生长26]。不同的msc对肿瘤生长的影响取决于msc的来源和类型的癌细胞。陈等人。27)报道,激进的er阴性乳腺癌细胞显示强大的吞噬能力msc比积极的雌激素受体阳性MCF7细胞和nontumorigenic MCF10A细胞,而这种吞没导致乳腺癌的发展与增强的迁移、入侵和转移性属性。

msc与癌细胞通过各种机制,包括直接接触和随后的吞没的癌细胞(27,28)和免疫调节来影响肿瘤细胞的生存29日,30.]。旁分泌的msc对其免疫调节功能可能是至关重要的。细胞外囊泡(EVs)代表一群细胞衍生的双层膜结构,含有生物活性分子旁分泌,从而影响靶细胞(31日]。电动汽车通常分为三个亚型:液,微泡(MVs)和凋亡的身体32]。最近,许多研究报道,EVs源自msc (MSC-EVs)可以调节肿瘤细胞增殖、血管生成和转移。EVs源自hUCMSCs也有效对抗癌细胞。吴et al。33)发现hUCMSC-EVs可能抑制膀胱肿瘤T24增长下调Akt蛋白激酶磷酸化和移植caspase-3分开。Hendijani et al。34)表明,检查参与组成分泌腺hUCMSC显示白血病细胞的抗增殖作用线和施加一个加法细胞毒性效应与阿霉素。通常,hUCMSC-CM可用于初步研究调查hUCMSC-EVs的效果。他等。35]表明hUCMSC-CM抑制肿瘤生长和辐射敏感度的乳腺癌细胞株mda - mb - 231表达下调Stat3信号通路。香港et al。36表明hUCMSC-CM可以减少cisplatin-induced卵母细胞和颗粒细胞的凋亡cisplatin-induced卵巢损伤模型。我们之前报道hUCMSC-CM可以诱导MCF7 pyroptosis体外,和我们的RNA序列研究显示显著增加pyroptosis-related基因的表达NLRP1和CASP4在pyroptotic MCF7细胞。因此,在这项研究中,我们进一步研究这两个基因的影响MCF7细胞pyroptosis hUCMSC-CM引起的。

我们第一次评估caspase-1的基因和蛋白质表达,caspase-4, NLRP1 MCF7细胞接受hUCMSC-CM-induced pyroptosis。尽管这三个基因的mRNA水平增加,蛋白质含量表现出不同的趋势。特别是,NLRP1蛋白质显著降低。pyroptosis期间,NLRP1与适配器蛋白质交互ASC形成一个inflammasome复杂。同样地,我们发现的表达和本地化NLRP1和ASC pyroptotic MCF7细胞通过免疫荧光和发现,这两个蛋白与pyroptotic MCF7细胞,建议的形成和参与的inflammasome hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。

接下来,我们调查的角色caspase-4和NLRP1 hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。shRNA-mediated击倒的CASP4或NLRP1在MCF7细胞导致减少50 - 70% (Supplementary2)在相应的记录水平。通过规范化和典中的通路Pyroptosis发生。Caspase-1规范化路径是关键分子参与,和NLRP1新兵ASC和pro-caspase-1形成NLRP1 inflammasome或直接与pro-caspase-1激活Caspase-1和诱导pyroptosis5]。Caspase-4是分子参与中的通路的关键。在这项研究中,缺乏caspase-4或NLRP1不能完全阻止这两个通路。因此,研究一个通路的作用通过阻断其他不能进行这项研究。然而,我们发现这两个通路之间的一些联系。

使用膜联蛋白细胞形态学和细胞死亡分析V-FITC / PI和LDH化验表明,水平hUCMSC-CM-induced pyroptosisCASP4可拆卸的,NLRP1击倒MCF7细胞没有显著不同于NC组中观察到。这表明抑制caspase-4或NLRP1不能抑制MCF7细胞pyroptosis hUCMSCs分泌的因素引起的。因此,阐明机制这些观察,我们进一步研究了pyroptosis-related基因的表达变化在shRNA-transfected MCF7细胞。

Caspase-1,也称为il - 1β转化酶,负责成熟和分泌的促炎细胞因子il - 1β和地震16,37- - - - - -39]。通过inflammasomes Caspase-1二聚和自活化诱导,这是由PRR、适配器ASC, pro-caspase-1 [38]。ASC与PRRs和pro-caspase-1交互通过其pyrin域(PYD)和招聘域(卡),分别。PRRs NLRP1等NLRP3、NLRC4 AIM2, Pyrin,应对微生物,环境,和host-derived危险分子模式;microbe-associated分子模式;和其分子模式(40]。激活caspase-1劈开gasdermin D促进膜孔隙的形成和pyroptosis [41,42]。在人类中,NLRP1包含PYD,一个函数来找到域(发现),卡。因此,NLRP1可以直接激活procaspase-1通过相互作用或间接通过招募ASC和pro-caspase-1形成NLRP1 inflammasome,它激活caspase-1 [5]。然而,代理可以选择性地激活人类NLRP1 inflammasomes尚未确定。我们之前报道明显高表达NLRP1和CASP1在hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。这些结果表明,一些因素hUCMSC-CM与NLRP1并激活caspase-1诱导pyroptosis MCF7细胞。然而,hUCMSCs分泌大量的分子,和精确的因素与NLRP1仍然未知,进一步的研究是必要的来识别这些因素。在这项研究中,我们撞倒了NLRP1阐明其作用hUCMSC-CM-induced pyroptosis。hUCMSC-CM治疗没有显著改变caspase-4 mRNA和蛋白表达水平和没有改变的裂解CASP4但增加pro-caspase-1e xpressionNLRP1可拆卸的MCF7细胞。NLRP1突变已报告增加系统性的caspase-1关节炎患者和角化病43];我们的结果与这些研究结果相一致。此外,pro-caspase-1水平相比,活动ASC复合物被报道的数量是一个更重要的限制因素caspase-1成熟/释放[21]。的分泌il - 1β和地震与caspase-1的活性呈正相关。因此,在NLRP1击倒MCF7细胞,我们发现ASC复合物,cleaved-CASP1和分泌il - 1的水平β和地震-减少。这些结果表明,NLRP1击倒在一定程度上抑制规范化pyroptosis途径但不影响不在经典里的通路。

Caspase-4检测胞质有限合伙人和触发器经典之中pyroptosis通路在人类身上。Caspase-5与caspase-4协同效应(36,44]。caspase-4寡聚化和激活和caspase-5由它引发的绑定与有限合伙人的脂质部分的卡片。然而,卡caspase-5发散于caspase-4 56%,表明caspase-5结合和响应脂质特异性不同于caspase-4 [45]。事实上,这两个还扮演着不同的角色在不同的细胞。procaspase-5 LPS刺激诱导处理,但不是caspase-4,介导il - 1释放单核细胞(44]。Caspase-5 U937细胞中无法表达,和异位表达Caspase-5部分触发inflammasome激活响应大肠杆菌有限合伙人,但没有触发inflammasome激活响应弗朗西斯氏菌属novicida有限合伙人(21]。Caspase-5无法检测到LPS-stimulated THP1细胞(6]。相比之下,caspase-4上皮细胞死亡中发挥了重要作用志贺氏杆菌感染(46),在pyroptosis和il - 1α在人类牙龈成纤维细胞分泌Td92,牙周病原体的表面蛋白梅毒denticola(20.]。我们之前证明hUCMSC-CM-treated pyroptotic MCF7细胞caspase-5表达的变化不显著但显示显著增加caspase-4表达式。因此,我们假设一个或多个因素分泌hUCMSCs caspase-4和触发MCF7细胞pyroptosis交互。在这项研究中,我们发现hUCMSC-CM治疗没有显著改变pro-caspase-1 mRNA和蛋白表达水平但适度增加NLRP1表达和ASC斑点形成和cleaved-CASP4水平下降CASP4可拆卸的MCF7细胞。此外,分泌il - 1的水平α较低但il - 1的水平呢β和地震CASP4击倒MCF7细胞高于数控NLRP1可拆卸的MCF7细胞。这些结果与先前的报道是一致的(21,44)和建议中的通路部分抑制并通过规范化途径MCF7细胞死亡主要发生在caspase-4的缺失。Caspase-4-mediated细胞死亡报道触发NLRP3-dependent caspase-1激活和il - 1的分泌β和地震6,21,47,48]。此外,规范inflammasomes可以控制激活经典之中inflammasomes [49],阻塞中的通路本身可能不足以改变对感染的易感性(50]。因此,其他机制影响规范化途径可能参与调停pyroptosisCASP4可拆卸的MCF7细胞,进一步的研究对阐明这些机制至关重要。

5。结论

我们之前证明hUCMSCs分泌的因素可能引起pyroptosis乳腺癌MCF7细胞线。此外,我们之前的RNA序列分析表明,pyroptosis-related基因的表达NLRP1和CASP4显著增加。在这项研究中,我们阐明这两个基因的作用在hUCMSC-CM-induced pyroptosis MCF7细胞。我们发现,尽管CASP1,CASP4,NLRP1信使rna水平增加,蛋白质含量表现出不同的趋势。特别是,NLRP1蛋白质显著降低。进一步分析识别潜在的理由表明NLRP1与ASC形成一个复杂的相互作用,参与细胞MCF7 pyroptosis。进一步调查使用NLRP1和CASP4击倒MCF7细胞显示击倒的CASP4或NLRP1不能拯救MCF7细胞hUCMSC-CM-mediated pyroptosis。进一步研究CASP4——或者NLRP1 -击倒的细胞显示MCF7细胞通过规范和经典之中pyroptosis pyroptosis发生通路;当一个通路抑制,hUCMSC-CM诱导MCF7细胞pyroptosis通过其他途径。我们的研究为进一步的研究提供了一个基础,旨在阐明的精确机制hUCMSC-induced pyroptosis乳腺癌MCF7细胞行和援助的乳腺癌的潜在治疗靶点的识别。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章及其补充信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

我们感谢美国妇产科昆明呈贡分公司的延安医院协助人类脐带的集合。这项工作是支持的重大项目云南科技项目(批准号2018 zf007-05),云南省应用基础研究计划,中国(批准号2018 fb058),云南省对外合作项目(批准号2018 ia045)和联合科技部专项资金的云南Province-Kunming医科大学(批准号2017 fe468 (-011))。

补充材料

额外的文件1:(a)的测序结果CASP4 shRNA向量。(b)的测序结果NLRP1 shRNA向量。测序和T7通用引物。额外的文件2:caspase-4 (a)基因表达。NLRP1 (b)基因表达。MCF7细胞转染shRNA向量72小时,然后,从细胞中提取总RNA。q-PCR是用于检测目标基因。NC:消极的控制。数据提出了Ct (2^{- - - - - -△△Ct}相对于负控制)。数据了 , 。(补充材料)

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版权

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