比较分析检查参与组成分泌腺脂肪基质细胞和他们的耳软骨再生

文摘

脂肪基质细胞(ADSCs)可以修复耳软骨缺陷。此外,检查参与组成分泌腺干细胞生物治疗也可能是一个有前途的选择,等于甚至优于干细胞。我们探索的治疗功效ADSCs检查参与组成分泌腺和兔耳软骨再生。ADSCs检查参与组成分泌腺及其被放置到外科手术创造了耳软骨缺陷。4和8周后,切除耳廓组织病理学和免疫组织化学检查。我们使用实时PCR确定水平的基因表达胶原蛋白II型转化生长因子-β1 (TGF -β1)和胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)。ADSCs显著提高耳软骨再生在4和8周,检查参与组成分泌腺的和PBS组相比,所显示的总检查,组织病理学和免疫组织化学。ADSCs调节胶原蛋白II型的表达,TGF -β1,igf - 1比检查参与组成分泌腺的或PBS。胶原蛋白II型和igf - 1的表达水平明显高于在8周比ADSC注射后4周。尽管ADSCs从而显著提高新的软骨形成,检查参与组成分泌腺的没有。因此,ADSCs检查参与组成分泌腺可能比他们更有效的耳软骨修复的缺陷。

1。介绍

耳软骨内在的修复能力很低,因为它不是血管;缺陷或眼泪可能引发严重的畸形和缺陷(1]。软骨组织工程可能克服的局限性自体软骨移植,重建软骨(独特的生物学和功能性质2]。间充质干细胞(msc)分化成几个间充质血统,比如形成骨(3- - - - - -5),脂肪组织(3,4),和软骨(3,4];最近的研究集中在MSC分化成软骨细胞帮助软骨组织工程(6]。兔耳软骨缺陷被完全修复软骨细胞来源于同种异体骨骨髓来源msc (7]。脂肪基质细胞(ADSCs)也修复这些缺陷,与高层次的表达相关蛋白s - 100,胶原蛋白II型、转化生长因子-β(TGF -β)[8]。最近,基质干细胞和secretomes用作软骨再生治疗工具和(1]。多项研究表明,干细胞移植的治疗效果是由多个分泌调节周围的微环境因素引起再生通过旁分泌机制(9- - - - - -11]。msc分泌的生长因子、细胞因子和细胞外囊泡;这些增强胶原蛋白II型表达和表达下调基质金属蛋白酶表达在骨关节炎软骨细胞(12]。尽管干细胞及其secretomes提供类似的疗效的动物关节软骨再生(13相比),还没有研究干细胞的影响及其secretomes耳软骨修复的缺陷。

本研究的目的是探讨是否ADSCs检查参与组成分泌腺,促进软骨修复和比较治疗效果之间的软骨再生ADSCs检查参与组成分泌腺和耳软骨缺损的动物模型。

2。材料和方法

2.1。动物

六个月大的雌性荷兰兔子从Samtako购买有限公司(韩国乌山,http://www.samtako.co.kr)和饲养在一个特定的无菌设施。研究协议是机构批准的动物保健和使用委员会釜山国立大学医学院(没有。pnuh - 2015 - 075)。

2.2。ADSC隔离和文化

如前所述(8),从腹股沟区获得脂肪组织,洗广泛与相同量的磷酸盐(PBS)和0.075%胶原酶消化I型(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟的37°C。中和后的酶活性α修改鹰的介质(αmem)含10%胎牛血清的边后卫,样本在1200×g离心10分钟,一夜之间,球被孵化控制介质在37°C下5%的股份有限公司₂。不依从红细胞被移除,第三,或者fourth-passage附着ADSCs表型特征(后被使用14]。

流仪分析被用来描述ADSCs的表型。至少有50000个细胞被孵化与荧光素isothiocyanate-labeled单克隆抗体对小鼠干细胞antigen-1, CD44、CD45、CD117和CD11b (Clontech BD生物科学,帕洛阿尔托,CA)或与各自的同形像控制。洗后,标记细胞分析流式细胞术使用FACSCalibur流式细胞分析仪和Cell-Quest Pro软件(BD生物科学,圣地亚哥,CA)。ADSCs的表达每一个标记的百分比是由积极事件的比例,确定相比isotype-matched消极的控制。

ADSCs分化成脂肪形成的分析的能力,成骨的,和chondrogenic血统,如前所述14]。脂肪形成的和成骨分化,细胞被播种在6-well板的密度20000细胞/厘米²和治疗3周脂肪形成的和成骨的媒体。脂肪形成的成骨分化是评估使用油红O染色,作为细胞内脂质积累的指标,和茜素红染色,分别作为细胞外基质钙化的指标。Chondrogenic分化诱导使用micromass文化技术。简而言之,集中ADSC悬挂10毫升( )是镀的中心每个好,治疗3周chondrogenic媒介。证实了软骨形成免疫组织化学。

2.3。ADSC标签

ADSCs洗了PBS和孵化2μM细胞追踪CM-Dil(分子探针Inc .,尤金,或者)在37°C 5分钟然后额外15分钟在4°C。这些细胞被洗PBS和悬浮在PBS 。CM-Dil-labeled ADSCs荧光显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本;模型IX7122FL / P)的激发波长553纳米。

2.4。检查参与组成分泌腺ADSC的隔离

检查参与组成分泌腺ADSC文化的上层清液()pressure-concentrated (ca。50倍)(Amicon,微孔Corp . Billerica,妈,美国)使用3000 Da孔隙大小膜。盐被淘汰使用HiTrap脱盐设备(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。脂多糖(LPS)耗尽( )使用Detoxi-Gel亲和力Pak预填充列(皮尔斯,罗克福德,IL)按照制造商的指示。

2.5。检查参与组成分泌腺ADSCs Subperichondrial注入和

总结在图的实验协议1(一)。二十个荷兰兔子与2%利多卡因麻醉(1毫克/公斤)和alfaxan(5毫克/公斤)。剃须后,聚维酮碘酱,我们删除一个球形 涉及的软骨膜软骨板和皮肤的midportion每个耳廓,外层皮肤完好无损(图1 (b))。右耳朵ADSCs处理( )检查参与组成分泌腺或( )和左边的耳朵( )PBS。总共 纯化ADSCs或10μg / 50μL检查参与组成分泌腺的注射(使用26-gauge针)在软骨膜下,6点周围的边缘切除,术后天(PODs) 0, 2, 4, 6, 8(图1 (c))。所有的缺陷都覆盖着Spongostan (Ferrosan,哥本哈根,丹麦),防止脱水;应用生理盐水日常维护湿(图1 (d))。

2.6。耳软骨再生

耳朵都是定期检查。照片拍摄术前、术后立即和每周之后;我们测量了缺陷大小和指出任何炎症改变。缺陷大小的均值主要和次要的轴。所有的评估都由一名调查员治疗失明的细节。

2.7。组织学和免疫组织化学

五10兔子牺牲4周检查参与组成分泌腺ADSC或注射后,剩下的兔子牺牲在8周。没有动物牺牲前死亡。后腹腔注射苯巴比妥(80毫克/公斤),耳廓被切除,组织病理学检查。部分取自石蜡wax-embedded标本和苏木精和伊红染色())。弹性蛋白免疫组织化学进行评估新的软骨形成和软骨成熟的程度,如前所述[15]。检测弹性蛋白,部分被孵化兔子anti-elastin多克隆抗体(# RDI-TP 592;研究诊断Inc .,弗兰德斯,新泽西州)的稀释1:000 (Dako Z0311)在室温下2 h和沾Polymer-HRP (Dako设想®+双链接System-HRP(民建联+)K4065) 30分钟。消极的控制没有收到主抗体。

2.8。定量实时逆转录聚合酶链反应

之前定量实时聚合酶链反应(存在),总rna提取并使用随机reverse-transcribed五个一,如前所述[10]。rt - pcr进行使用10 ng cDNA /管和SYBR绿色混合(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。Transcript-specific引物对胶原蛋白II型(NM_001844), igf - 1 (NM_000618)和TGF -β1 (NM_000660)设计基于基因库cDNA序列表1。提出了表达水平随着倍增加glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)相比,使用公式 ,在哪里 目标基因的负GAPDH (NM_002046) (16]。

2.9。统计分析

所有实验至少重复三次。数据了 的意思。统计分析了克鲁斯卡尔-沃利斯测试Bonferroni-corrected紧随其后,两群,事后Mann-Whitney测试连续变量。我们使用IBM SPSS统计为Windows版本。22.0软件(、IBM公司,纽约Armonk)。一个值< 0.05被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述的ADSC Immunophenotype ADSC分化

培养的细胞表面标记CD45 ADSCs为负,CD117, CD11b,但本来阳性,CD44, CD90。ADSCs主轴——的(因此,呈),在以往报道ADSCs和骨骨髓来源msc。ADSCs可以分化成脂肪形成的、成骨的chondrogenic血统后文化在适当的条件下(补充图1)。

3.2。总发现

没有耳廓展出任何炎症的迹象(皮肤红斑或放电)。ADSC组、10三个缺陷完全修复,表现出光滑,表面温和的粉色,注射后4周(图2(一个))。此外,注射8周后,所有缺陷,除了一个完全愈合,因此,周围组织(图相似的颜色2 (e))。检查参与组成分泌腺的组织,无明显明显的治疗4周后注入(图2 (b))。虽然缺陷大小8周post-injection有点降低(图2 (f)),这样减少还指出在PBS组(数字2 (c)和2 (g))。缺陷大小4周接受 , ,和 检查参与组成分泌腺的ADSC, PBS组,分别;8周数据 , ,和16.6±4.2毫米。ADSC组证明更好的耳软骨再生(检查参与组成分泌腺相比或PBS组)( )在4(图2 (d))和8 ( )周(图2 (h))。然而,检查参与组成分泌腺的和PBS组没有差别。

3.3。检测的ADSCs耳软骨缺陷

免疫荧光显微镜显示红色(CM-Dil-positive) ADSCs方面的缺陷4和8周后ADSC注入(数字3(一个)和3 (b))。ADSCs已经与周围组织集成在8周。

3.4。微小的发现和免疫组织化学

四个星期ADSC注射后,典型的软骨由软骨细胞,内层,cartilage-specific细胞外基质(ECM)是明显(图4(一))。检查参与组成分泌腺没有新的软骨形成明显的组或PBS组,尽管他走时染色观察纤维组织(数字4 (b)和4 (c))。ADSC集团在8周接受包含成熟软骨有明显的缺损和密集的ECM填充任何软骨缺陷(图4 (d))。然而,只有最小的软骨细胞增殖检测检查参与组成分泌腺的和PBS组(数字4 (e)和4 (f))。弹性蛋白免疫组织化学显示新软骨ADSC注入(4和8周后的数字5(一个)和5 (d))。尽管一些检查参与组成分泌腺中可观察到ECM集团(数字5 (b)和5 (e)),只有纤维组织中检测出PBS组4和8周时接受(数字5 (c)和5 (f))。

3.5。胶原蛋白II型和生长因子基因的表达

在4周ADSC注射后,胶原蛋白II型的相对表达水平,igf - 1、TGF -β1(相比PBS组) , ,和 ADSC组 , ,和 检查参与组成分泌腺的组织。8周的数据 ,和 ADSC组 , ,和 检查参与组成分泌腺的组织。igf - 1表达水平和TGF -β1 ADSC组在4周检查参与组成分泌腺相比显著增加( 和 ,分别)和PBS ( 和 ,(图)组6(一))。胶原蛋白II型的表达水平,igf - 1, TGF -β1 ADSC组检查参与组成分泌腺在8周相比显著增加( , ,和 ,分别)和PBS ( , ,和 ,(图)组6 (b))。值得注意的是,胶原蛋白II型和igf - 1的表达水平明显高于ADSC注入(以8比4周后 和 ,分别)。然而,表达水平无显著差异的胶原蛋白II型,igf - 1、TGF -β1检查参与组成分泌腺之间的明显和PBS组。

4所示。讨论

干细胞疗法是有前途的软骨再生;这些细胞可以分化成几个血统(17]。MSC移植的治疗效果应该反映MSC移植到损伤的部位,细胞融入受损组织,分化成专业组织(18]。MSC分泌许多自分泌或旁分泌因素包括生长因子、细胞因子、趋化因子(检查参与组成分泌腺的),创建一个支持MSC微环境细胞生存,更新,和分化,以及调节炎症反应和诱导血管生成,最终再生(19,20.]。许多研究表明检查参与组成分泌腺的心血管(在再生中扮演重要角色21),肝脏(22)、肺(23),和肾24)损伤。茎cell-conditioned介质被用来治愈伤口在许多临床前研究和作为一个可接受的替代细胞疗法(25- - - - - -27]。这鼓励了检查参与组成分泌腺的使用干细胞加速耳软骨再生。这里,我们比较了再生检查参与组成分泌腺ADSCs及其对耳软骨缺陷的影响;我们进行观察,总值组织学分析,免疫组织化学和存在。ADSCs耳软骨修复,加速比检查参与组成分泌腺的或PBS。ADSCs贴上CM-Dil观察缺陷4和8周接受,这表明ADSCs软骨再生中发挥了重要作用。这些发现是组织学证实;新的软骨由软骨细胞和cartilage-specific ECM是明显的缺陷。ADSCs收购chondroblastic表型,强烈表达弹性蛋白,免疫组织化学染色和高级II型胶原蛋白的表达中存在。

许多因素都与细胞招聘、增殖,生存,在软骨再生和分化。各种细胞因子和生长因子,TGF -β总科包含完善的生长因子用于诱导chondrogenic分化(8]。TGF -β1参与古典chondrogenic分化和刺激软骨细胞的合成活动(28]。igf - 1主要需要维护软骨的完整性,促进软骨成熟通过增加生产硫酸粘多糖和留住这些材料在pericellular矩阵(29日]。我们发现ADSC移植显著增加TGF -β1,igf - 1表达。然而,这样的表达式检查参与组成分泌腺之间和PBS组之间没有显著性差异。耳廓软骨板的弹性;主要的胶原蛋白II型(30.,这有效证实软骨细胞表型的表达。胶原蛋白II表达显著增加的ADSC检查参与组成分泌腺比和PBS组。综上所述,这些数据表明ADSCs本身促进软骨再生的软骨细胞分化、成熟和ECM的合成。胶原蛋白II型的高级表达和igf - 1 8比4周时接受可能表明软骨细胞成熟的ECM生产。

最近的一项系统回顾和荟萃分析显示,检查参与组成分泌腺的治疗提供利益方面类似于干细胞移植关节软骨再生动物模型(13]。然而,我们发现,检查参与组成分泌腺ADSC没有显著影响耳软骨再生。这些相互矛盾的结果很难解释,但可能是由于周围的微环境的差异。关节软骨是一种透明软骨支架的关节面骨以阐明联合(一个封闭的空间)。检查参与组成分泌腺因此,移植可能在关节软骨再生中发挥关键性的作用。然而,在我们目前的研究中,检查参与组成分泌腺ADSC不能保留在长期开放的,手术,耳软骨缺陷。

我们的研究有一些局限性。目前尚不清楚ADSCs注入手术创造了耳软骨缺陷直接分化成软骨细胞。还需要进一步的研究来完全描述的再生效果ADSCs耳软骨缺损的重复与血统跟踪实验。

5。结论

检查参与组成分泌腺ADSCs产生有益的作用,但没有对耳软骨再生产生重大影响。因此,ADSCs检查参与组成分泌腺可能比他们的更有效的治疗耳软骨修复的缺陷。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(2016号r1d1a 1 b03932026)。本研究也支持韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIT,科技部ICT)(2019号r1f1a1056614)。

补充材料

补充图1。脂肪基质细胞(ADSCs)的特征。ADSCs显示特征的间充质干细胞呈形态外观(a)、骨(b),软骨形成(c)和脂肪生成(d)(放大,×100)。(补充材料)

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