葛根素宽慰Compression-Induced人类髓核细胞凋亡和线粒体功能障碍通过PI3K / Akt通路间充质干细胞

文摘

葛根素(PUR),大豆苷的8-C-glucoside从国内外葛根中提取植物,自噬密切相关,减少活性氧(ROS)生产、和抗炎作用,但它的影响对人类髓核间充质干细胞(NPMSCs)尚未确定。在这项研究中,NPMSCs培养在压缩装置的微环境模拟椎间盘压力控制(1.0 MPa),我们发现细胞生存能力下降和细胞凋亡水平逐渐增加压缩时间延长。PUR政府后,通过流式细胞术和细胞凋亡水平评估caspase-3活动汇出,和蛋白质水平的Bas以及裂解caspase-3下降,而bcl - 2水平升高被确认。此外,ATP生产检测、ROS和JC-1荧光照相术以及定量分析建议PUR可以减弱细胞间活性氧积累和线粒体功能障碍。此外,利用老鼠尾巴压缩模型,表明PUR可能恢复受损髓核变性引起的压缩。PI3K / Akt通路被发现后释放压缩刺激免疫印迹,PUR可以拯救一种蛋白激酶的磷酸化,从而重新激活途径。咕噜咕噜叫的影响,如antiapoptosis、细胞生存能力恢复,抗氧化作用,线粒体的维护,都是抵消PI3K / Akt通路抑制剂的应用(LY294002)。立刻,PUR可以缓解compression-induced人类NPMSCs体外细胞凋亡和细胞死亡以及和维持细胞内稳态的老鼠压缩模型稳定线粒体膜电位和衰减活性氧积累通过激活PI3K / Akt通路。

1。介绍

椎间盘变性(IDD)是最常见的一个病理疾病在世界各地,这将大大影响病人的生活质量,对社会带来巨大的经济负担1]。有很多因素导致IDD,包括遗传易感性(2],胶原降解[3)、生物力学过载和受损髓核细胞(NPC)扩散4]。髓核间充质干细胞(NPMSCs),也称为髓核(NP)祖细胞,也有类似的trilineage间充质干细胞(msc)分化潜力,也发现损失细胞生存能力、数量和性质在IDD [5]。至于其multidirection分化能力(6,7)和组织特异性,NPMSCs可能优于nonintervertebral盘——(试管)派生msc NPC-specific分化和IDD可能是潜在的治疗目标。理解微环境因素NPMSCs不利的影响,如压缩,铺平了道路干扰和NP受损组织的修复,这是一种很有前途的方法来治疗IDD [8,9]。

葛根素(PUR),大豆苷的8-C-glucoside从国内外葛根中提取植物,被发现在许多疾病的治疗是有效的,如心力衰竭(10)、高血压(11),脑血管缺血(12,各种癌症4,13,14],帕金森病(PD) [15),阿尔茨海默病(AD) [16),和糖尿病以及糖尿病并发症(17,18]。绝经后妇女患IDD的风险增加,这意味着减少雌激素与IDD[密切相关19]。此外,17β雌二醇已经被公认为一种抑制剂IDD的表达下调MMP-3 MMP-13和移植II型胶原蛋白(20.]。同样,尽管在治疗IDD PUR尚未报道,这种药,植物雌激素(21),可能是潜在的有利IDD的抑制。更具体地说,PUR大大与修改自噬相关(22),减少活性氧(ROS)的生产(23),和抗炎作用23]。然而,PUR对细胞凋亡的影响是不同的在各种细胞。例如,PUR可以抑制细胞凋亡,减少缺血引起的心肌损伤(24),而促进肿瘤细胞凋亡(25,26]。因此,PUR的具体影响的命运NPMSCs IDD的发展需要进一步澄清。

几个信号通路参与PUR的药理作用。PUR抑制氧化应激和炎症与NF -失活有关κB信号(17),它起到了保护作用与抑制TGF -糖尿病肝损伤β/ Smad信号。此外,PUR会抑制p38 MAPK信号通路,从而抑制血管平滑肌细胞增殖(27]。此外,ERK1/2-Runx2信号通路参与PUR在促进成骨分化的机制28]。通过PI3K / PUR可以减弱海马神经元损伤Akt1 / GSK-3β信号通路(29日]。在我们先前的研究,PI3K / Akt信号通路被发现显著激活,淫羊藿对人类npc浓度的保护作用[30.在不利的炎性微环境。由于PUR可以保护神经细胞也通过PI3K / Akt信号通路,它假定这种机制可能会适应NPMSCs PUR的影响。

在这项研究中,我们模拟了微环境导致IDD开发应用压缩装置NPMSCs研究细胞的生存能力和病理生理学。然后,我们旨在发现的影响PUR NPMSCs受损和PI3K / Akt信号通路的参与。

2。方法

2.1。人类NPMSCs隔离和主要的文化

人类的NP样本来自五个病人经历了椎间盘退行性椎间盘疾病,和所有病人的细节补充表所示1。所有程序都是同济医学院的医学伦理委员会批准,华中科技大学,中国。如前所述(31日),NP组织被孤立的腰椎椎间盘疝患者的解剖显微镜和洗磷酸盐(PBS),然后被切割和消化0.25% 6 h II型胶原酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在37°C。样本然后离心机在300 g×5分钟,两次暂停,在完全培养基培养间充质干细胞(msc)(美国Cyagen) 37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。培养基是改变每3天。细胞用0.25%胰蛋白酶消化- 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA、σ)当他们融合达到80 - 90%,亚文化在培养瓶比1:3。第二代NPMSCs以下实验中使用。

2.2。源和PUR的纯度

主要试剂,咕噜咕噜叫,是买了从上海原液生物技术有限公司有限公司https://www.shyuanye.com)。这是提取葛根和它的纯度达到99.9%。

2.3。应用NPMSCs压缩装置

协议使用先前建立,NPMSCs被培养在一个不锈钢压力容器模拟体内环境(4,32,33]。压缩器构造了能够承受超过1.5 MPa的压力。NPMSCs被放置在细胞培养板和暴露在1.0 MPa压力如下设计。压力容器充满了少量的蒸馏水保持适当的湿度,然后放置在一个孵化器在37°C。此外,CO的浓度₂被维持在5%,监控公司吗₂指标。控制细胞培养在37°C公司为5%₂在0.1 MPa 48小时。

2.4。体外实验设计

探讨凋亡的促进效应压缩,NPMSCs培养在1.0 MPa压缩0 h, 12 h, 24小时,36小时,48 h(图1)。PI3K / Akt通路的分析功能compression-induced凋亡,活性氧积累以及线粒体功能障碍,细胞使用200年μM PUR(上海原液生物技术有限公司,https://www.shyuanye.com),25μ米LY294002 (PI3K / Akt通路的抑制剂;多国评价,中国),200μM PUR + 25μM LY294002或者同样体积的DMSO(控制)24小时然后在1.0 MPa压缩培养48 h。

2.5。细胞生存能力分析

1.0 MPa 0压缩后,12日,24日,36岁,或48 h, NPMSCs的细胞生存能力是由一个细胞计数检查工具包(CCK-8 Dojindo,日本)根据制造商的指示。然后,吸墨性,表明细胞生存能力,使用分光光度计检测在450海里(美国Bio-Tek ELx808吸光度标)。

对于Edu-staining扩散分析,NPMSCs被播种到12-well板( 细胞/)。NPMSCs扩散为每个治疗组是评估在体外通过EdU DNA增殖检测设备(RiboBio、广州、中国)根据协议。最后,细胞可视化使用一个倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

2.6。免疫印迹分析

NPMSCs收集和细胞溶解在裂解缓冲(Beyotime、江苏、中国)含有蛋白酶抑制剂的混合物phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF Beyotime)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒我(σ,美国)。蛋白质浓度在细胞溶解产物测定使用增强BCA蛋白质分析工具包(Beyotime)。整个溶解产物分离使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - page)和转移到聚偏二氟乙烯膜(美国Amersham生物科学)。膜被封锁5%牛血清白蛋白(BSA Beyotime) Tris-buffered盐水和渐变20 (TBST) 1 h在室温下。膜在一夜之间被孵化在4°C的主要抗体伯灵顿(Abcam 1: 1000年,英国),caspase-3 (Abcam 1: 1000年,英国),bcl - 2 (Abcam 1: 1000年,英国),p-Akt (Abcam phospho-S473, 1: 1000年,英国),一种蛋白激酶(Abcam 1: 1000年,英国),PI3K (Abcam 1: 1000年,英国),p-PI3K(热费希尔phospho-Tyr524, 1: 1000年,美国),和β肌动蛋白(Abcam 1: 5000年,英国)。膜清洗三次TBS渐变20 0.1% 10分钟和各自的peroxidase-conjugated二级抗体孵育2 h。三10分钟后洗,蛋白质是可视化使用增强化学发光(ECL)方法根据制造商的指示(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)。

2.7。免疫荧光

显示治疗后,NPMSCs在PBS洗两次,固定在4%多聚甲醛在室温下15分钟。30分钟的细胞被屏蔽5%牛血清白蛋白(BSA)稀释0.3% Triton x - 100。细胞被孵化与p-AKT(英国Abcam phospho-S473, 1: 50)和PI3K (1: 50, Abcam,英国)单克隆抗体,一夜之间在4°C在黑暗的调湿室。洗后,这些细胞被孵化fluorophore-conjugated二级抗体60分钟。然后,在黑暗中与DAPI复染色的细胞为5分钟。被PBS洗3次后,彩色样本可视化和拍摄使用荧光显微镜(日本奥林巴斯)。集成光密度(IOD) p-AKT或PI3K在三个随机选择的视觉领域进行了分析(每片免疫荧光)在高放大倍数下( )。IOD测量使用Image-Pro + 6.0与高分辨率分析系统。最后,相对IOD值(0 h)的100%计算,统计图表。

2.8。凋亡检测

压缩后48 h,控制和治疗NPMSCs接受胰蛋白酶化和离心,用冰冷的PBS和resuspended在500年μl 1 x绑定缓冲。5μl propidium碘(π)和5μl Annexin-V(南京凯基生物生物技术,南京,中国)随后补充道,和细胞培养在黑暗中在室温下15分钟。膜联蛋白和πdouble-positive百分比(表明晚期凋亡细胞)用流式细胞仪测量(BD LSRII,正欲)。此外,NPMSCs被播种在6-well文化板块和治疗如上所述。为每个组,细胞在PBS冲洗三次,孵化5分钟在黑暗中在室温在5μmol / l Annexin-V和5μmol / lπ。然后染色细胞成像激光扫描共焦显微镜下(LSM、蔡司、德国)。

的活动caspase-3测量使用caspase-3活动侦测套件(Beyotime,中国)。短暂治疗后,连接和浮动NPMSCs完全收集。接下来,浮在表面的样品被用来评估caspase-3活动严格按照制造商的协议。最后,caspase-3活动规范化,每组的血清总蛋白检测评估光学密度的波长405 nm。

2.9。定量实时聚合酶链反应(rt - pcr)分析

总RNA提取人类NPMSCs使用1毫升试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。孤立的RNA转录成互补DNA。rt - pcr的设计使用的引物序列如下:bcl - 2:转发:5 - - - - - -TGAGTTCGGTGGGGTCATGT-3 ,反向:5 - - - - - -GGCCGTACAGTTCCACAAAGG-3 ;伯灵顿:转发:5 - - - - - -CTGACGGCAACTTCAACTGGG-3 ,反向:5 - - - - - -TGAGCACTCCCGCCACAAA-3 ;caspase-3:转发:5 - - - - - -TTGGAACAAATGGACCTG-3 ,反向:5 - - - - - -ACAAAGCGACTGGATGAA-3 ;β肌动蛋白:转发:5 - - - - - -GTCCACCGCAAATGCTTCTA 3 ,反向:5 - - - - - -GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 。基因表达是通过RT-qPCR量化,使用标准PCR工具包和SYBR绿色萤光素/ qPCR大师混合(5 x)(豆类、日本)在7900年ABI棱镜ht序列检测系统(美国应用生物系统公司)。放大产品检查使用放大曲线分析,并使用2所有的数据进行了分析^{- - - - - -ΔΔCT}管家基因方法和规范化β肌动蛋白。

2.10。透射电子显微镜(TEM)

通过TEM人类NPMSCs的超微结构检查。NPMSCs,被压缩或医学,预处理是胰蛋白酶化和离心后收集的,然后他们在PBS洗两次。细胞被颗粒状15分钟在1000 g和上层的丢弃,前用2.5%戊二醛固定在PBS在室温下2 h。细胞然后为2 h后缀四氧化锇与1%,紧随其后的是乙醇和渗透脱水步骤和嵌入在环氧树脂812。超薄部分获得了超微切片机(EM UC7、徕卡、德国)和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和检查Tecnai G²美国范20 tem(公司)。

2.11。ROS化验

细胞内ROS水平测量使用活性氧检测设备(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。NPMSCs孵化2,7-dichlorofluorescin二乙酸(DCFHDA)在黑暗中37°C为30分钟。然后,细胞被洗两次与PBS和测量ROS生产通过流式细胞术(BD LSR II,正欲),遵循制造商的指示。每组的细胞内ROS水平也由荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

2.12。线粒体膜去极化(Δψm)测量

收集NPMSCs从每个治疗组和resuspended 1毫升中包含10μg / ml JC-1 (5 5 ,6、6 - - - - - -tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethylbenzimidazolyl-arbocyanine碘)(Beyotime,中国)。然后,细胞被孵化在37°C公司为5%₂20分钟,并进一步分析了流式细胞术(BD LSRII,正欲)。检测细胞的数量,从红色转向绿色荧光显示细胞出现线粒体膜电位的频率(MMP)去极化。带通滤波器是 纳米JC-1绿色排放和 纳米JC-1红色发射。此外,荧光染色图像,NPMSCs培养在6-well板块在PBS,冲洗三次,在孵化前30分钟在黑暗中在10 37°Cμ克/毫升JC-1。与JC-1缓冲洗两次之后,NPMSCs服用1毫升中为每个好和可视化荧光显微镜(日本奥林巴斯)。细胞内ATP含量测定采用ATP生物发光分析工具包(Beyotime生物技术)根据制造商的指示。

2.13。压缩和PUR治疗体内

所有动物实验进行的动物实验委员会批准的协议华中科技大学。19 Sprague-Dawley老鼠(三个月)450 - 500克重量购买实验动物中心的华中科技大学(武汉,中国)。评估的影响Ilizarov-type装置在不同的尾骨的光盘,2老鼠立即牺牲和Co7/8 Co8/9收集,和另一个2老鼠以前应用压缩刺激提到如下。大鼠麻醉了2% ( )水合氯醛(40毫克/公斤);尾椎体(Co7 Co8, Co9)大鼠尾巴被切位置,计算和试验证实了摄影。然后,尾巴和聚维酮碘消毒,然后粘贴Ilizarov-type装置(34]。两个十字0.7毫米直径柯式电线被钻经皮插入到每个7日和九尾的椎体,垂直于尾轴,固定在铝环,纵有四个螺杆连接。仪器后,轴向载荷应用使用四个0.50 N /毫米校准弹簧安装在每个杆,被收紧从远端产生的压应力计算约为1.3 MPa。手术后,老鼠在股四头肌肌内注射青霉素(800000 U / ml, 0.1毫升)感染控制。4周后,大鼠被牺牲,试管(Co7/8和Co8/9)收获和组织学评估的准备。15老鼠,如补充图所示1机械加载的应用程序之前,老鼠尾巴,他们被试管注射用生理盐水预处理和PUR [35]。针(G) 29日用于穿刺纤维环层虽然尾部皮肤,在平行板。椎间盘穿刺的深度是预先确定的基于纤维环的尺寸和NP和针都安全的深度,避免失败的注入。Co7 / Co8光盘注射2μl(生理盐水作为自控集团,而2μl (PUR (200μ米)注入Co8 / Co9光盘作为实验组。PUR和盐水注射后的一天,他们在上述Ilizarov-type装置的方法。手术后,老鼠被分为三组(虚假的、2 w和4 w),每组包含5大鼠。2 w和4 w组,压缩装置,对鼠尾1.3 MPa的压力是2和4周,分别。2 w集团,当压缩时间达到2周,压力缓解,但Ilizarov-type装置仍是另一个2周的尾巴。虚假的组,压缩设备安装没有任何外部机械负荷的应用。手术后,所有老鼠都安置在标准笼子和允许无限制的食物,水,和活动。4周后最初的手术,所有的老鼠都牺牲了,和外部设备的每个老鼠都卸载了,然后试管(Co7/8和Co8/9)收获和准备进一步评估。体内实验的原理图补充图所示2。

2.14。组织学和免疫组织化学分析

被PBS洗了三遍后,收获光盘与缓冲甲醛固定(4%,pH值7.4)12 h和脱钙在10%甲酸的解决方案。然后他们脱水25%,50%,75%,和95%乙醇,嵌入在石蜡,分段4μm。组织学分析,部分与苏木精和伊红染色(北京Biotopped科技有限公司、北京、中国)或红色染料O和快速绿色(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA,美国),用一个显微镜(日本奥林巴斯)。组织学分级应用来确定细胞形态变化在纤维环(AF)和NP(补充表2),(36]。组织学部分由三个独立的和被调查人员评估。

免疫组织化学分析,部分沉浸在透化作用的试剂,0.5% Triton x - 100, 20分钟,和探测的主要抗体,p-AKT (Abcam phospho-S473, 1: 50,英国),一夜之间在4°C和PBST洗5分钟三次和二次抗体孵育(1:200;美国向量,伯林盖姆,CA)在37°C 40分钟。接下来,部分与DAPI染色(Beyotime,中国)5分钟。然后,图像可视化和拍摄显微镜(日本奥林巴斯)。p-AKT阳性细胞的百分比(p-AKT阳性细胞/总核)是手动计算评估的影响PUR PI3K / Akt途径在体内。

免疫组织化学片的具体分析过程如下:首先,只有中央片Co7/8(注射生理盐水,控制)和Co8/9 (PUR)注入每个老鼠收集(每组五个老鼠)。然后,三个视觉字段(每片免疫组织化学)在高放大倍数下被随机选中。因此,对于每一个治疗组,15视觉领域( )终于和手动评估包括三个独立的调查。在分歧的情况,达成的共识是一起讨论。最后,积极p-Akt染色细胞的平均百分比计算根据每组15视觉领域。

2.15。统计分析

使用GraphPad棱镜6进行了统计分析软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。所有数据都从至少三个独立的实验,提出了获得 (SD)。多组数据分析单向方差分析(方差分析)测试,其次是图基的事后考验。学生的 - - - - - -测试中使用的双官能团的分析参数。统计学意义是 。以外的所有实验在体内实验中独立重复了三遍(生物复制: )。在体内实验中,复制的数量是15。

3所示。结果

3.1。压缩减少人类NPMSCs细胞生存能力和诱导细胞凋亡

细胞从退化试管中提取组织可以有效地诱导成骨分化,chondrogenic分化和脂肪形成的分化(补充图1)。更重要的是,孤立的细胞表现出高水平的MSC-related标记(CD73, CD90、CD105)和低水平的differential-related标记(CD31和CD45)(补充图吗1 b)。因此,我们成功地孤立NPMSCs,细胞通道2被用于本研究。

压缩(1.0 MPa)的时间延长,细胞的可行性NPMSCs逐渐减少,表明损伤的细胞增殖受到压缩时间,观察和意义在12 h, 24小时,36小时,48 h组(数字1(一)和1 (b),补充图3)。Caspase-3活动和膜联蛋白的百分比+ / PI +和膜联蛋白+ /π-细胞增加,压缩时间延长,这表明,凋亡率(数字上升1 (c)- - - - - -1 (e))。

3.2。PI3K / Akt途径是改变在NPMSCs压缩和PUR的影响

观察失活的PI3K / Akt信号通路与降低p-PI3K (phospho-Tyr524)和p-Akt (phospho-S473),当NPMSCs压缩1.0 MPa下48 h。然而,p-Akt PI3K和p-PI3K内容增加了PUR的应用,虽然LY294002,特定的PI3K / Akt通路抑制剂,可以减少p-PI3K, PI3K和p-Akt块PUR(图的促进作用2(一个))。同样的,压缩后48 h,免疫荧光检测PI3K和p-Akt降低细胞质和细胞核。PI3K和p-Akt差别有趣的是,对这些基因在细胞质中是更重要的比原子核。PUR可以有效地恢复compression-induced PI3K和p-Akt水平下降在细胞质中,而LY294002政府废除这种效果从根本上(数字2 (b)和2 (c))。此外,PUR享年200岁μ在25 M和LY294002μ米(30.)没有对细胞死亡和细胞凋亡的影响,如果PUR和LY294002预处理不压缩(补充图4和补充图8)。

3.3。PI3K / Akt通路参与PUR-Related迟钝的人类NPMSCs Compression-Induced细胞凋亡

Annexin-V /π荧光染色显示显著增加的早期和晚期凋亡细胞阶段1.0 MPa压缩后48 h。有趣的是,200年μM PUR有效缓解compression-induced NPMSCs的细胞凋亡在早期和晚期凋亡阶段,虽然PUR的保护作用已经被LY294002(图3(一个))(PUR的应用浓度取决于CCK8,补充图5)。此外,定量分析显示,NPMSCs诱导的细胞凋亡率压缩被PUR下降,而且,这种效应可能被LY294002(图3 (b))。伯灵顿蛋白水平升高在48小时的压力下压力、bcl - 2水平下降,表明细胞凋亡的执行(图3 (c))。蛋白质水平的裂解caspase-3也显著升高(图3 (c))。与PUR的应用、伯灵顿和裂解caspase-3是减少和bcl - 2增加(图3 (c))。,伯灵顿(图和bcl - 2记录显示类似的模式3 (d))。并通过LY294002 PUR被封锁的影响。TEM表明细胞的超微结构改变明显48 h后压缩。Karyopyknosis是显而易见的,有显著的囊泡形成的内质网和线粒体肿胀。此外,细胞膜的突起消失的压缩下48 h,而0 h(数字4(一)和4 (b))。此外,PUR可以恢复受损的细胞超微结构引起的压缩(图4 (c))。然而,PUR的保护作用可能消失的凋亡超微结构形态学是重要的额外治疗后LY294002(图4 (d))。

3.4。PUR减毒细胞间活性氧积累和线粒体功能异常在人类NPMSCs压缩

绿色荧光,表明活性氧产量,玫瑰在48 h压缩组0 h对照组相比,减少了PUR(数据的应用5(一个)和5 (b))。和流式细胞术定量分析表明,细胞间代ROS被PUR汇出,这种效应可能被LY294002(数字5 (c)和5 (d))。此外,线粒体功能明显异常的压缩下1.0 MPa 48 h。JC-1说明可以松了一口气的受损MMP的初加工PUR(数字6(一)- - - - - -6 (c),补充图6)。PUR也促进ATP生产,由压缩明显受损,PUR的有利影响是减少通过应用LY294002(图6 (d))。线粒体肿胀的可视化图所示4。

3.5。压缩诱导IDD体内而PUR它在很大程度上缓解

补充图表示7,Co7/8和Co8/9透露类似的形态在压缩刺激组0周和4周。在此基础上,我们认为这是可以接受的执行PUR Co8/9注入,而使用Co7/8作为对照组注射生理盐水。一般来说,他走时染色显示结构逐渐扰乱和大量的细胞外基质(ECM)以及细胞数量在对照组降低,尾巴上的压缩扩展。同样,所以染色显示显著减少蛋白聚糖的对照组2周和4周压缩,相比那些虚假的组。正如所料,PUR注射没有显著加剧IDD虚假的组。此外,他走时染色表明PUR可以显著恢复ECM的干扰分布和数量的减少和增加生存的细胞,从而缓解破坏性压缩2 w和4 w集团(数字7(一)和7 (b))。此外,p-Akt-positive细胞的百分比的对照组2 w和4 w组明显减少,虽然政府p-Akt PUR可以增加蛋白质含量的NP细胞组织(图7 (c))。

4所示。讨论

由于其负面冲击个人或社会,IDD强调了研究领域,和许多因素被发现导致IDD的发展,包括年龄、新陈代谢,营养,和机械负荷(37]。其中破坏性因素,过度/机械负荷异常试管被确定为主要动机(38]。此外,pressure-induced IDD现在已经澄清的潜在机制在很大程度上,和许多挑通路已被证明参与进展,如TGF -βPI3K / Akt通路,p38-MAPK通路(37,38]。

最近,试管祖细胞,软骨终板组成的祖细胞,纤维环祖细胞,NP祖细胞(5),被认为是更有效的恢复椎间盘高度比骨骼间充质干细胞(bmsc) [39),因此可能在试管再生更有前途。为了充分利用试管祖细胞的分化潜能,是至关重要的充分理解他们的病理生理学不利的微环境下,如缺氧和压缩,以画一个特定的治疗来维持细胞的生存能力,促进对试管成熟细胞分化。在我们的研究中,PUR是首先被证明是保护人类NPMSCs压缩的刺激下,这是有效的恢复退化模型大鼠试管;因此,PUR可能试管再生的辅助治疗。

更具体地说,压缩对人类NPMSCs可能导致恶化的细胞凋亡,导致受损细胞生存能力和上升的细胞死亡,这是符合我们之前的研究基于鼠npc (4]。然而,有有限的治疗开发基于这些发现。咕噜咕噜叫,国内外葛根的主要生物活性异黄酮提取从根舌状(40),据报道是有效治疗各种病理条件。例如,PUR可以减轻肝损伤和促进细胞增殖通过调节mTOR信号通路(41]。同样,咕噜咕噜叫,一个潜在的抗氧化剂,还可以缓解cadmium-mediated细胞毒性主要通过恢复大鼠近端小管细胞自噬和抑制Nrf2通路(42]。此外,PUR也被发现是有效的糖尿病(43)和心血管或神经紊乱12,44]。自PUR主要是细胞生存能力恢复和抗氧化作用有关,这是假设PUR可能汇compression-induced NPMSCs神经细胞凋亡。

结果,PUR管理可以大大降低细胞内活性氧积累和恢复线粒体功能障碍,从而保持细胞细胞器稳定和增加对压缩的刺激,从而拯救compression-induced细胞死亡和受损NPMSC形态。虽然PUR的抗氧化和线粒体的保护作用已被证明在肌管,hyperglycemia-related心血管疾病,和蛛网膜下腔出血23,45,46),这是第一个研究来识别那些PUR对IDD的影响。此外,PUR的防护作用的发展IDD首次观察到体内。因此,人类IDD PUR可能是一个潜在的治疗,但PUR的剂量和管理需要进一步临床探索,确保人类的安全性和有效性。后确定PUR的保护作用在体外和体内,然后我们进行进一步探索潜在的机制。

PI3K / Akt通路是一个至关重要的细胞内途径调节细胞周期,揭示其显著影响细胞增殖、衰老、癌症发展和细胞凋亡47- - - - - -49]。压缩已被下调诱导报道人大凋亡N-cadherin和抑制PI3K / Akt信号通路38]。PI3K / Akt信号通路的激活可能是一个方法来拯救细胞凋亡(50]。有趣的是,PUR是一种有效的antiapoptosis代理,也可以激活PI3K / Akt通路(51]。具体来说,PUR可能减弱认知缺陷增加生存海马CA1锥体神经元(29日)和汇daunorubicin-induced H9c2细胞凋亡(51通过一种蛋白激酶磷酸化)。同样的,根据我们的发现,PI3K / Akt通路抑制人类NPMSCs受到压缩,以及PUR治疗可以激活途径。随后,PI3K / Akt通路抑制剂,LY294002,应用于块PUR治疗后这条通路的激活。因此,PUR的影响,如antiapoptosis和细胞生存能力恢复,被抵消。因此,我们首先发现PUR减毒compression-induced NPMSC通过PI3K / Akt通路细胞凋亡。维持线粒体的完整性,防止细胞色素c和活性氧释放从事antiapoptosis PUR[效果23,52,53]。PI3K / Akt失活也被发现与线粒体去极化(53]。在肝细胞线粒体生物起源所需功能类3 PI3K PPAR的控制α与线粒体转录活动和协调能源需求内容(54]。抑制PI3K还发现禁用PUR对线粒体内稳态的影响在非酒精性脂肪肝病(55]。组成与发现,阻塞的PI3K / Akt信号通路显著减少PUR在抗氧化和线粒体维护的影响。立刻,PUR的保护作用compression-induced NPMSC细胞病变效应在很大程度上是依赖PI3K / Akt通路的激活(图8)。组成的体外研究结果,PUR应用还发现大鼠模型,以缓解变形和结构障碍体内p-Akt显著激活。然而,一些研究报道PUR的anticancerous效果通过诱导细胞凋亡抑制PI3K / Akt信号通路(26,56,57]。因为大多数冲突的研究进行癌症细胞系,它很好奇,PUR可以执行完全相反的影响在不同细胞系细胞凋亡。除此之外,它也是我们的研究观察到,PUR过量可能引起细胞毒性,这说明在这些研究矛盾的另一个可能的来源的发现。然而,缺乏研究,可以完全解释PUR的冲突的作用在细胞凋亡和PI3K / Akt通路。因此,建议具体PUR之间的分子间相互作用和PI3K / Akt通路或其上游分子应该进一步探讨。

最近,已经有另一个研究,评估了PUR对腰椎间盘突出症(LDH) [58],它强调了PUR减轻疼痛的影响,并指出这些影响脊髓ERK-dependent或小胶质细胞的激活有关。不同,我们的研究是第一个调查的医疗效果的PUR compression-induced受损生物人类NPMSCs和鼠IDD发展的行为,我们发现这些影响是PI3K / Akt pathway-related。

5。结论

在结论(图8),PUR可以缓解compression-induced人类NPMSCs体外细胞凋亡和细胞死亡以及和维持细胞内稳态的老鼠IDD模型稳定MMP和衰减活性氧积累通过激活PI3K / Akt通路。因此,PUR可能是一个潜在的治疗应用椎间变性疾病。

缩写

伴着:	骨间充质干细胞
BSA:	牛血清白蛋白
DCFHDA:	2,7-Dichlorofluorescin二乙酸
发射极耦合逻辑:	增强化学发光
ECM:	细胞外基质
EDTA:	乙二胺四乙酸
):	苏木精-伊红
年代:	番红精O-fast绿色
国际直拨电话:	椎间盘变性
碘:	集成光学密度
试管:	椎间盘
JC-1:	5、5 ,6、6 - - - - - -Tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethylbenzimidazolyl-arbocyanine碘化
MMP的:	线粒体膜电位
msc:	间充质干细胞
NP:	髓核
npc:	髓核细胞
NPMSCs:	髓核间充质干细胞
PBS:	磷酸盐
PI:	Propidium碘化
咕噜咕噜叫:	葛根素
ROS:	活性氧
SD:	标准偏差
透射电镜:	透射电子显微镜。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

作者的贡献

HDH、SZW MKG, PYZ设计实验。HDH PYZ进行体外实验。HDH、PYZ LZL进行体内实验。HDH、DXY QXC分析数据。PYZ QXC画表和数据。PYZ、MKG DXY完成手稿。所有作者参与了手稿编辑和商定的最终版本。东华彭黄和译了同样本工作和分享第一作者。

确认

我们感谢杨教授的技术贡献金的助手在武汉协和医院转化医学中心。同时,我们要感谢裴张和An-Na Du从核心设备和技术支持,武汉病毒学研究所为她帮助生产TEM显微照片。这项研究得到了国家重点研究和发展项目(2016 yfc1100100),中国国家自然科学基金重大研究计划的中国(91649204)、中国博士后科学基金会(2019 m662077)。

补充材料

补充表1:纳入本研究的患者的细节特征。补充表2:大鼠椎间盘变性组织学分级规模。补充图1:评估NPMSC具备干细胞和细胞标记。(一)NPMSCs分化成成骨的能力,chondrogenic,脂肪形成的血统评估茜素红染色( μ米),阿尔新蓝染色( μ米),油红O染色( μ米)。(B)流仪分析确定了细胞表面标记(CD73, CD90、CD105、CD31、CD45)。补充图2:体内实验的原理图进行大鼠模型。(一)初,PUR或生理盐水注入椎间盘(Co7/8和Co8/9)。(B)压力加载到1天的老鼠尾巴。(C)的压力后28天,老鼠的尾巴被牺牲,进行进一步调查。补充图3:定量分析的Edu荧光染色。这样的数据 ( )。( , ,和 相比之下,0 h)。补充图4:PUR的细胞毒性和LY294002 NPMSCs在使用浓度检测LDH释放试验72 h后治疗不压缩。数据了 ( )。 显示显著差异( 和 两组之间)。补充图5:保护作用存在剂量依赖的相关性不同分的1.0 MPa的PUR压缩时间。细胞的生存能力是由细胞计数检测设备(CCK-8)测定。这样的数据 ( )补充图6:JC-1荧光染色法的定量分析。这样的数据 ( )(ns:没有意义; 和 两组之间)。补充图7:反应苏木精和伊红())和红色染料O-fast绿色(年代)染色法观察不同组的老鼠光盘( μ米)。Co7/8和Co8/9画报》类似的破坏性四周压缩条件下的性能。补充图8:LY294002对细胞凋亡的影响在使用浓度(25μ米)72 h后被检测到免疫印迹分析治疗不压缩。数据了 ( )。ns:两组之间没有意义。(补充材料)

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