移植的干细胞从人类脱落乳牙降低认知障碍从通过减少神经元细胞凋亡在大鼠慢性脑缺血

文摘

从人类脱落乳牙干细胞(棚)是一个独特的产后干细胞群高自我更新能力来源于颅神经嵴。因为棚是同源的中枢神经系统,他们拥有优越的分化成神经细胞的能力。然而,是否以及如何改善中枢神经退行性疾病尚不清楚。慢性脑缺血(CCI)是一种神经系统疾病引起的长期脑血液循环不足,特点是进步的认知和行为的恶化。在这项研究中,我们表明,系统性的棚移植或注入CCI的海马体改善认知障碍大鼠4周后脱落的拯救海马区神经元的数量。从力学上看,移植减少海马区神经细胞的凋亡CCI劈裂型caspase-3差别通过对这些基因的老鼠。总之,减少移植保护神经功能,减少神经元凋亡,导致改善CCI的认知障碍。我们的研究表明,裁员是一种很有前途的干细胞来源神经系统疾病的细胞疗法诊所。

1。介绍

慢性脑缺血(CCI)被认为是神经系统和脑血管疾病,特点是进步的认知和行为恶化造成的长期脑血液灌注不足。许多脑血管疾病密切相关,包括脑动脉硬化、脑梗塞、血管性痴呆(VaD)和阿尔茨海默氏症。CCI是一个残疾的主要原因和构成大型医疗负担。涉及多个因素CCI,机制尚未完全了解。这可能与氧化应激有关,细胞凋亡、炎症反应、突触功能障碍,和能量代谢障碍。研究表明,海马神经元CCI显示一个宽松的安排与减少数字和不规则形态和更高水平的细胞凋亡已观察到CCI老鼠的海马1,2]。目前临床治疗CCI仍然是药物管理局。药物会抑制大脑NF -κ活动,减少神经细胞凋亡和自噬,增加诱发神经保护的bcl - 2 /伯灵顿比CCI模型(3- - - - - -5]。然而,即使是最有效的神经保护药物已被证明是无效的换向脑组织中神经元损害。因此,重要的是要确定新的治疗CCI的有效策略。

间充质干细胞(msc)具有自我更新和multipotential分化能力。系统性MSC移植(多层)已成功用于治疗多种人类疾病,如系统性红斑狼疮、心肌梗死和炎症性肠病6,7]。最近,有研究报道,多层促进神经恢复和改善缺血性脑损伤(8,9]。多层恢复记忆通过促进内源性神经发生、突触重建早期AD小鼠和改善患者认知功能和日常生活活动和监督(10,11]。多层已被确认为治疗脑血管疾病的新策略。多种治疗机制可能构成MSCT-based疗法的影响,包括直接分化成神经元功能,旁分泌效果,msc和免疫细胞间的相互作用。然而,详细的机制尚未完全了解。

从人类脱落乳牙干细胞(棚)是一个独特的产后干细胞群高自我更新能力来源于颅神经嵴。因为它们是同源的中枢神经系统,减少表达间充质和neuroectodermal标记。此外,获得了纸浆的乳牙是防止损伤的;此外,摆脱与最低限度的道德问题对他们的提取和使用12]。流表现出较高的增殖活性和神经分化能力(13),可能能够分化为神经元,多巴胺能神经元,感觉神经元和视网膜photoreceptor-like细胞在活的有机体内(14- - - - - -16]。最近的一项研究报告称,裁员能够再生功能牙髓血管和神经的大型动物模型。此外,裁员可能导致包含一个3 d全牙髓组织的再生成牙质细胞层、结缔组织、神经和血管,类似于正常牙髓(16]。已经证实了移植可以有效治疗神经系统疾病。摆脱移植能促进脊髓损伤后功能恢复,和他们可以分化成功能性神经元和少突胶质细胞17- - - - - -19]。流也可以通过旁分泌作用小胶质细胞极化转移,减少神经炎症从而改善运动功能恢复和减少皮质病变在大鼠创伤性脑损伤(20.]。然而,减少移植是否治疗影响CCI和底层的机制仍不清楚。

在这项研究中,我们使用了一个老鼠与two-vessel阻塞模型,一个经典的CCI模型,调查了移植的治疗效果,记忆和神经功能的CCI模型进行评估,我们进一步探讨底层机制。我们的数据表明,移植减少认知障碍的CCI老鼠和保护神经元的细胞功能通过减少细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。动物和伦理语句

雄性Wistar鼠体重200 - 250克从辽宁昌盛生物技术公司购买(本溪,中国)。所有动物都适应环境温度控制的条件下,一个12 h光/暗周期为1周免费获取食物和水。所有研究协议经伦理委员会批准的中国医科大学口腔医学院,沈阳,中国(排名2018099)。

2.2。CCI模型

在这项研究中,CCI模型之前报道后引起的协议(21,22]。总之,与0.1%(老鼠麻醉后 )戊巴比妥钠(40毫克/公斤腹腔内;Cristalia、Itapira、巴西),颈动脉都轻轻分开迷走神经,和永久动脉阻塞是实现以丝线。sham-operated老鼠以类似的方式处理,但是没有通过双重结扎闭塞。成功的CCI模型被定义为明显减少脑血流量的速度结束舒张和收缩,它证实了小动物超声(补充图1)。4周后,大鼠受到莫里斯水迷宫测试评估认知赤字(微波加工)。

2.3。隔离和表征

棚的捐助者,或其法定监护人在未成年人的情况下,提供知情同意签署。提取乳牙和运送到实验室的最低必要媒介α(αmem;Gibco表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)解决方案包含300 U /毫升青霉素和300年μg / mL链霉素(美国UT Hyclone, Logan)维持在4°C。在无菌条件下,髓腔和根管暴露通过削减cement-enamel结。然后,使用一个倒钩拉刀牙髓被隔离。牙髓剁碎,养殖有限公司5%₂气氛在37°C磁盘包含10厘米文化αmem, 15%胎牛血清(的边后卫;MRC、江苏、中国),100 U /毫升penicillin-streptomycin (Hyclone)和0.1更易与L L-ascorbic酸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。一半的介质代替7天后,和所有的媒介是每三天更换一次。到达90%融合,细胞消化0.25% Trypsin-EDTA (Gibco)。细胞通道3 - 5用于后续实验。

流分析了集群的蛋白质(CD)表型分化。总共 细胞/管堵塞了0.5%牛血清白蛋白(BSA)和孵化主要抗体针对CD73, CD90、CD105、CD34、CD45(马剑桥Abcam 1: 100年,美国)1 h在黑暗中冰。染色细胞中和0.5% BSA和2%多聚甲醛固定,然后用流式细胞分析仪分析(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。接下来,摆脱neuron-like细胞分化。总之,分化诱导的神经扩张中Neurobasal (Gibco)补充20 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF、研发)和20 ng / mL重组人表皮生长因子(EGF、研发)补充2%的人类白细胞抗原B27 (Gibco)。细胞生长在湿润5%股份有限公司₂气氛在37°C。媒介是每日更换。7天之后,干细胞被证实积极表达神经细胞标记βIII-tubulin巢蛋白和神经干细胞特异性标志。

2.4。摆脱移植

CCI老鼠收到了移植海马体(SHED-hippocampus组)或通过尾静脉(SHED-vein组)。确定了移植对海马神经细胞凋亡的影响,老鼠被随机分配到六组:虚假的(健康)组,缺血组,SHED-hippocampus 集团SHED-hippocampus 集团SHED-hippocampus 组和SHED-vein 集团( 每组)。

SHED-hippocampus组,头骨被暴露通过中线皮肤切口和使用一个小牙钻磨洞。双边海马区域被用作注射部位。切口的位置相对于前囱如下:前后的(美联社):3.2毫米,中侧的(ML):±2.0毫米,和背腹侧的(DV): 3.5毫米。麻醉后,每只老鼠双边注射10μL磷酸盐(PBS)或细胞悬液在病变部位微量调节注射器诱导CCI后24小时。所有老鼠都移植没有抑制免疫反应。注射器保持在5分钟后注入允许悬挂的扩散到周围组织。

SHED-vein组处理 150年细胞稀释μL PBS,摆脱被尾静脉注射注射诱导CCI后24小时。此外,同等体积的PBS注入大鼠在虚假的组。动物被缝合后标准手术,住在单独的笼子里,直到行为功能恢复。所有的老鼠受到微波加工测试后再1个月。

2.5。微波加工测试

CCI可以诱导切断双边颈总动脉,引起神经认知障碍等后遗症。微波加工测试是一种有效的方法来评估小鼠学习和记忆。这个记忆测试依赖于动物营救自己的能力达到一个隐藏的目标平台在一个水池23]。大鼠神经损伤通常在微波加工测试显示空间记忆障碍。微波加工测试进行连续5天每天在所有的老鼠。每个试验一直持续到老鼠被测试来定位隐藏的逃生平台在1分钟或更少。如果不成功,老鼠是测试人员的指导下为10年代隐藏的平台。逃避延迟记录作为评估空间记忆。审判过去学习后,6天,进行了探测试验来评估空间记忆。平台被从水中,每个老鼠为60年代被允许自由地游泳。为了避免短期记忆在微波加工测试,每个老鼠的行为被记录每8小时三次,和这三个结果的平均值记录(24]。老鼠干,每次试验后回到笼子里。逃避延迟和游泳速度的平均值在日常试验记录,和老鼠穿过平台的次数记录,定义为空间记忆。

2.6。神经病理分析

动物麻醉后戊巴比妥(100毫克/公斤腹腔内),他们牺牲了transcardiac灌注通过注射0.9%,其次是4%的多聚甲醛0.1 PBS (pH值7.4)。从每组大鼠的大脑被移除,嵌入在石蜡,并分为4μm日冕部分滑动切片机。部分染色和尼氏小,使用数码相机和图像捕获。TUNEL染色法进行评价海马神经细胞凋亡。TUNEL染色,部分被放进微波炉煮柠檬酸缓冲(10毫米,pH值6.4)5分钟后抗原检索deparaffinization和补液。然后,部分是直接与TUNEL孵化的混合原位细胞凋亡检测装备V (POD)(美国博士德生物技术,而往常,CA)根据制造商的协议。六个连续使用5片海马体μ米间隔每两个相邻部分的数量从每个动物组评估在海马的CA1区锥体神经元。

2.7。西方墨点法

海马体一边是移除,在冰冷的裂解缓冲均质,离心机在10000 g×15分钟在4°C。蛋白质浓度进行了分析使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(Beyotime生物科技、江苏、中国)。样品与等量的蛋白质(50μg)是由sds - page分离,然后转移到硝化纤维素膜(美国微孔,Billerica的)。膜被封锁使用5%的无脂牛奶1 h和孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:兔子anti-brain-derived神经因子(BDNF;1:1000;居住亲和力生物制剂,加拿大),兔子anti-postsynaptic密度蛋白95 (PSD95;1:1000;美国Proteintech, Rosemont, IL),兔子anti-synaptophysin (SYN;1:1000;Proteintech),兔子anti-caspase-3 (1: 1000;细胞信号技术,丹弗斯,美国马)。膜与TBS-T洗,其次是孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 5000; Affinity Biologicals) for 2 h at room temperature. Immunoreactive bands were visualized by the enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) and exposed on an X-ray film. The immunoblot intensities were quantified using the Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

CCI老鼠的实验过程的过程是显示为以下示意图(图1)。

2.8。统计分析

这样的数据 偏差(SD)。所有使用SPSS 17.0进行分析。统计与单向方差分析进行比较(方差分析)其次是图基的事后测试。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。描述的流

摆脱孤立和特征在体外。流仪分析表明,表达了MSC表面标记,如CD73 (98.89%), CD90(98.52%),和CD105(97.62%),但没有表达造血标记,如CD34(0.5%)和CD45(0.2%)(数据2(一个)和2 (b))。观察脱落的细胞集落形成主要文化(图后的第14天2 (c))。茜素红染色表明,流能够分化成成骨的血统和成骨诱导条件下形成的矿化结节(图2 (d))。免疫荧光染色显示,摆脱表达神经标记,包括βIII-tubulin和巢蛋白在神经源性诱导条件下只有7天在体外(数据2 (e)和2 (f))。

3.2。移植降低CCI大鼠认知障碍

CCI特点是进步的认知和行为的恶化。评估了移植的影响在CCI老鼠认知缺陷,我们移植海马内或通过尾静脉。在这项研究中使用的微波加工测试。虚假的集团相比,在空间记忆拒绝缺血组。的传球次数老鼠穿过平台区域缺血组相比明显减少,在空间探测试验(虚假的组 , );这种效应被剥离移植逆转通过海马、尾静脉;缺血和SHED-hippocampus之间有显著差异 ( , )或SHED-vein 组( , );还有SHED-hippocampus之间的区别 和SHED-vein 组( , )。有虚假和SHED-hippocampus之间没有显著差异 ( , )(数据3(一个)和3 (b))。这些数据表明,移植减少认知障碍的CCI老鼠。SHED-vein相比 组,SHED-hippocampus的效果 更好的在CCI大鼠认知障碍。详细分析见表1。

海马体被认为是一个关键地区的大脑与认知功能有关,和海马损害发生在CCI大鼠颈动脉结扎后(22]。因此,我们进一步研究了在老鼠大脑的海马神经元功能移植。免疫印迹分析表明,脑源性神经因子(BDNF)表达水平的降低缺血组相比,在虚假的组。摆脱移植可以提高BDNF的表达水平,BDNF的表达水平增加SHED-hippocampus最 和SHED-vein 缺血组相比,水平组( , ; , )(数据3 (c)和3 (d)),SHED-hippocampus之间有显著差异 和SHED-vein 组( , )。这些数据表明,移植促进神经功能的恢复,SHED-hippocampus 组更好。

海马神经元细胞的数量和功能在空间记忆起着重要的作用。尼氏小染色是用来检查的海马CA1区神经元数量CCI老鼠。严重受损的神经元与致密的原子核在脑缺血大鼠,观察和幸存神经元的数量显著减少的价格相比虚假的集团( , )。减少移植后,神经细胞的数量增加了移植组,包括那些在移植是由海马注入和尾静脉输液。此外,神经细胞的数量增加SHED-hippocampus最 和SHED-vein 组相比,在缺血组( , ; , )(数据3 (e)和3 (f));和SHED-vein相比 组,SHED-hippocampus 2×10的效果⁵组好( , )。这些数据表明,显著减少移植拯救海马体神经元数量的CCI老鼠。

3.3。摆脱移植保护海马神经元通过抑制细胞凋亡

因为海马移植CCI老鼠流有更好的治疗效果,所以我们用了移植通过海马体在进一步的实验。他染色显示神经细胞排列紧密,与大而圆中核组织良好,几乎没有虚假的自发凋亡细胞组。缺血组神经元的数量减少,分布不均匀,核膜不清楚,一些核膜萎缩,凝固坏死和细胞损失发生。在缺血组相比,减少移植减轻神经元损失CCI老鼠的海马CA1区( , ),和细胞形态和分布往往是正常的(数字4(一)和4(c))。

TUNEL染色显示TUNEL-positive神经元,这显然是观察布朗和稀疏散落在海马区,在场的比例大大提高缺血组( , )(超过60%)。此外,凋亡神经元的比例显著下降减少移植后( , )(数据4(b)和4(d))。

半胱天冬酶3/8,半胱天冬酶家族的一员,由许多因素可以被激活,在细胞凋亡中起着至关重要的作用。在缺血大鼠,裂解的表达caspase-3 caspase-3增加,分别为( , ; , )。摆脱移植CCI减少的表达裂解caspase-3 caspase-3与缺血组,分别为( , ; , )(数据4(e) -4(g))。这些结果表明,减少移植保护海马神经元通过抑制细胞凋亡。

进行免疫印迹检测蛋白表达的突触后密度蛋白95 (PSD95)和synaptophysin (SYN),有些指出老鼠大脑的海马的神经功能。在缺血大鼠,PSD95和SYN的表达水平降低( , ; , ),和移植增加表达式( , ; , )(数据4(h) -4(j))。这些结果表明,移植促进神经功能的恢复。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,移植保护神经细胞,改善认知功能在CCI老鼠注入海马或通过尾静脉。崔等人报道,MSC移植可以改善神经功能25]。底层机制减少移植的治疗效果主要是减少神经元凋亡和相关的部分救援受损神经元的细胞功能。空间学习和记忆能力经常被用作索引来评估认知功能的啮齿动物模型。空间记忆可以直接反映在观察到通过次目标象限在一定的时期内。在这项研究中,微波加工空间探测试验表明,减少移植部分逆转后认知障碍大鼠CCI的感应。先前的研究已经报道,骨髓间充质干细胞(BMMSCs)可以发挥神经保护作用,提高学习和记忆能力的CCI老鼠(9]。然而,棚比BMMSCs表现出更强的增殖和多向分化潜能,特别是神经元分化能力强,以及重要的免疫调节作用[26,27]。棚,独特的间充质干细胞,具有低免疫原性和可用于同种异体或heterogeneic移植28]。此外,裁员可以获得广泛的来源通过非侵入性方法。因此,作为一个优秀的临床应用方面显示了很大的潜力的干细胞来源。

长期在CCI老鼠大脑血液灌注不足导致缺乏氧气和葡萄糖和大脑的炎症反应,导致细胞凋亡的神经元(29日,30.]。在以前的研究,发现了移植监管proapoptotic因子肿瘤坏死因子之间的平衡α(肿瘤坏死因子-αBcl-xl)和凋亡因素,减少神经细胞凋亡早期,并导致自发运动机能的恢复早在1周后在大鼠脊髓损伤31日,32]。另一份报告显示,因移植减少神经细胞凋亡,抑制促炎细胞因子的表达TNF -α和白介素- 1 (IL)β,增加抗炎细胞因子il - 4和il - 10的表达,和提高围产期分老鼠的生存33]。创伤性脑损伤(TBI)也有类似的机制,CCI,获救,据报道,在创伤性脑损伤大鼠运动功能和降低神经炎症,治疗效果是与液来自流(20.]。此外,有人建议,摆脱或SHED-derived条件培养液可以发挥神经保护作用的神经元,改善帕金森病的神经功能和广告(19,34]。这些旁分泌作用提供了新的见解了移植的治疗效果。本研究进一步证实了摆脱对CCI的神经保护作用,另一个主要类型的神经系统疾病。

目前,CCI的发病机制尚不清楚。它可能与神经元损伤,突触异常,神经递质功能障碍、能量代谢障碍、或其他因素。此外,神经系统疾病大多是由于神经元生产和功能性神经元的减少赤字。我们发现了移植可以减少神经细胞凋亡,减少神经元损伤有CCI的老鼠。脑源性神经营养因子、神经生长因子的生成家庭成员,积极生产整个大脑和参与神经发育,分化和生存。脑源性神经营养因子在调节突触可塑性中起着核心作用在大脑的发育过程35]。BDNF一直强调功能恢复的关键调节器和被报道对缺血性脑疾病有显著的保护作用[36- - - - - -38]。老鼠的空间参考记忆部分BDNF可拆卸的显示是受损(39,据报道,缺血性中风后功能恢复是最常与脑源性神经营养因子表达增加有关,减少BDNF表达导致减少神经可塑性和功能恢复40- - - - - -43]。缺血性损伤后的早期阶段,BDNF高架在组织周围神经元的主要损失后的受伤的网站(43,44]。然而,BDNF缺血性损伤后的相对水平可能不足以克服障碍和援助在功能恢复。MacLellan等人发现了BDNF表达的关键阈值需要促进增强神经元可塑性和中风后恢复(45]。最近的一项研究报道,通过尾静脉移植BMMSCs BDNF表达增加大脑梗塞的半球,引起大鼠中风模型中的功能恢复46]。在目前的研究中,我们发现了移植显著提高BDNF水平CCI老鼠的大脑。因此,改善了神经元的神经可塑性可能有助于减少从CCI棚移植术后认知障碍。

突触前和突触后蛋白被激活的脑源性神经营养因子和扮演一个重要角色在海马的突触可塑性39]。突触plasticity-associated蛋白质,包括SYN和PSD95,已被证明在许多神经系统疾病由于海马结构可塑性的重要作用。众所周知,广告是由突触功能障碍引起的认知障碍。研究表明,l3-n-butylphthalide,种子的提取物芹菜graveolens(中国芹菜),增加的表达PSD95 SYN,减毒的发展β斑块和神经炎症反应,促进海马神经发生,和改进行为复苏岁广告老鼠(47]。另一项研究表明,SYN的表达和PSD95调节SMAP8小鼠后14天重复经颅磁刺激的刺激;这个改变突触生物标志物是伴随着改善认知功能在这些老鼠48]。在目前的研究中,人们发现PSD95和SYN的表达减少海马的CCI老鼠和摆脱移植促进神经恢复BNDF上调表达,PSD95, SYN。

先前的研究表明,MSC移植神经保护作用对神经系统疾病。然而,移植msc的数量达到海马体/侧脑室还未确定,范围从 来 细胞(36,49,50]。在这项研究中,一个梯度对海马注射移植,我们发现适当的剂量的减少移植减轻CCI的老鼠 细胞/ 10μl .注入海马的体积是严格限制以来,高剂量的减少可能导致不足再悬浮和细胞团,造成局部免疫反应和减少了移植的治疗效果。我们的研究为进一步的研究提供了理论基础对于他们的应用程序。在这项研究中,我们还观察到少量的绿色阳性细胞在血管损伤后海马区PKH67标记移植通过尾静脉,这可能是由于血脑屏障的破坏CCI(数据没有显示)。

5。结论

摆脱移植成功地促进神经功能通过抑制神经细胞凋亡和移植神经相关蛋白的表达。作为重要的干细胞与巨大的潜力,展示了一个有前途的治疗神经系统疾病的临床价值。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者明确指出没有利益冲突与本文有关的。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。81900963),辽宁省自然科学基金(没有。20180551110),打开教育部重点实验室基金对中医藏象理论和应用,辽宁中医药大学(没有。zyzx1909)。

补充材料

补充图1:血流速度的变化后颈总动脉结扎。(补充材料)

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