维甲酸信号负调节骨的/牙原性的牙髓干细胞的分化

文摘

维甲酸(RA)信号参与牙齿发育和成骨分化的间充质干细胞(msc)。牙髓干细胞(DPSCs)是一个有用的msc在组织再生。然而,在骨的RA的功能/ DPSCs牙原性的分化尚不清楚。在这里,我们调查了RA的表达式模式小型猪牙胚和干预RA信号在骨的/牙原性的人类DPSCs的分化。落叶犬(DC)小型猪的细菌形态学观察,和风湿性关节炎的表达模式进行了研究原位杂交(ISH)。分离、培养人类DPSCs成骨的感应中有或没有RA或BMS 493,逆pan-retinoic酸受体的激动剂(pan-RARs)。碱性磷酸酶(ALP)活性测定,茜素红染色法,定量分析钙,CCK8化验,osteogenesis-related基因表达在活的有机体内移植进行了确定骨的/牙原性的分化潜能和扩散DPSCs的潜力。我们发现的表达RARβ和CRABP2在皇冠钙化DCs的小型猪有所下降。RA信号的激活在体外抑制人类DPSCs高山活动和矿化和减少mRNA的表达高山,骨钙素,骨桥蛋白一个转录因子,osterix。百时美施贵宝493治疗,结果是相反的。干涉RA信号减少DPSCs扩散。在活的有机体内移植实验表明,骨的/牙原性的分化的潜力DPSCs被反演RA信号增强。RA信号促进骨的差别我们的研究结果表明,对这些/ DPSCs牙原性的分化,表示一个潜在的目标途径来提高组织再生。

1。介绍

维甲酸(RA),维生素A的主要活性衍生物,在胚胎和成年脊椎动物(1),对胚胎发育至关重要(2- - - - - -4),和其他几个分子,继续扮演重要的角色在开发完成后(5]。RA信号被激活时RA与细胞结合视黄结合蛋白(CRABP),把RA从细胞质到细胞核。在原子核,形成异核视黄酸受体(rar)和类维生素a X受体(rxr)识别RA和调节转录与视黄酸反应元素(罕见)的启动子区域里的DNA (6]。先前的研究显示的动态表达式模式发展中牙RA-relative信号分子(3,7- - - - - -9)和报道,RA信号调节的起始和形成牙齿在开发的早期阶段(10- - - - - -12]。过量的RA有负面影响干细胞利基市场的维护和釉质的形成13,14]。RA信号还参与骨代谢和成骨细胞分化15- - - - - -17]。RA和几个分子之间相互作用已报告从骨的/ odontogenic-related途径,如骨形态发生蛋白(BMP) [18),纤维母细胞生长因子(FGF) [13),和Wnt信号通路(16,19]。然而,我们所知,RA的直接作用在牙本质矿化和成牙质细胞分化尚未报道。

间充质干细胞(msc)在组织工程的关键角色,他们的消息来源在组织再生和分化的调控机制的研究领域十分活跃。牙髓干细胞(DPSCs)与成人牙髓,具有高增殖率、自我更新能力,及其潜在的分化成成骨细胞,成脂肪细胞等。20.]。目前,DPSCs广泛研究作为潜在的种子细胞再生牙质pulp-like复杂和牙周组织和骨骼21- - - - - -24]。我们先前的研究[25- - - - - -27)已经确定DPSCs的角色功能的根和牙周再生。我们最近的研究发现,与其他间充质干细胞相比,DPSCs有优越的抗细胞衰老在文化和炎症环境下28]。所有这些观察结果表明DPSCs msc的可以是一个有前途的来源牙齿再生。改善的分化疗效DPSCs可以极大地促进组织再生的效用。

在这项研究中,我们使用落叶之间的小型猪狗(DCs)贝尔后期阶段和钙化阶段研究RA的表达模式的牙乳头(DP)皇冠钙化。使用人类DPSCs,我们调查如果RA假定影响骨的/牙原性的人类DPSCs的分化。我们的结果显示RA的负面影响,在皇冠钙化和骨的DPSCs /牙原性的分化,我们成功地提高了骨突的再生组织通过反演RA信号,一种新颖的方法来促进骨/牙质再生。

2。材料和方法

2.1。动物

怀孕的小型猪是获得中国农业大学动物科学学院。妊娠年龄计算从受精的日子。怀孕是通过b型超声证实的。所有程序获得的依据来自首都医科大学动物保健使用委员会(中国,北京)(许可证号码:aeei - 2016 - 063)。怀孕头猪被麻醉,牺牲了如前所述29日]。DCs是收获胚胎一天50 (E50)和胚胎60天(E60)。

2.2。原位杂交(ISH)

RNA探针合成和非放射性原位杂交进行如前所述[30.,31日]。引物用于逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)表中列出1。短暂,总RNA提取从直流牙细菌E50-60小型猪。rt - pcr后,DNA提取感兴趣的乐队和他们的DNA序列测定。Digoxigenin——(挖)标记RNA探针合成DIG-UTP和T7 RNA聚合酶(10881767001;瑞士罗氏公司)和挖掘RNA标签混合解决方案(11277073910;罗氏公司)。染色的过程中,幻灯片deparaffinized和水化完全然后消化1μg / mL蛋白酶K为30分钟37°C。后重新装设有4%多聚甲醛(PFA) PBS,部分脱水在25日,50岁,75年,100%的乙醇先后用电吹风之前1小时。与稀释探针杂交进行隔夜RNase-free孵化器在70°C。在第二天,部分冲洗3到4小时,孵化与抗体(碱性phosphatase-conjugated anti-digoxigenin, Fab片段)(11093274910);罗氏公司)在一夜之间。信号检测与电视台/执行BCIP衬底(S3771;Promega,麦迪逊,WI)。

2.3。细胞培养

人类牙齿组织影响第三磨牙,获得批准制定的指导方针下北京口腔医院,首都医科大学。所有程序进行患者的知情同意。DPSCs的隔离和文化进行了报道之前(32]。DPSCs在章节3到5被用于以下实验。DPSCs在成骨诱导培养3 - 14天中包含100μM抗坏血酸、2毫米的βKH的甘油磷酸盐,1.8毫米₂阿宝₄,10 nM的地塞米松。在实验组织,激活RA信号,RA(美国圣路易Sigma-Aldrich)使用,抑制RA信号,BMS 493 (Tocris,猫。3509号),一个逆pan-RARs受体激动剂,使用。对于每一个实验,RA和BMS 493股票的解决方案最初在DMSO溶液稀释,然后在培养基为10⁷10米,⁶10 M,⁵根据以前的文献[M13,19,33]。

2.4。碱性磷酸酶(ALP)测定和茜素红染色

成骨诱导后7天,高山活动分析是使用一个高山活动执行装备后,指令从制造商的协议(Sigma-Aldrich)。信号强度归一化是基于蛋白质浓度。经过14天的感应,发现矿化。培养DPSCs被固定为70%乙醇和2%茜素红染色(Sigma-Aldrich)。计算其钙的内容,上面的样本使退色10%氯化十六烷吡啶在测量其吸光度562海里多平台之前读者。钙的钙内容来自一个标准曲线,构造使用钙稀释相同的解决方案。在每一组中,最终钙水平规范化中总蛋白浓度重复的盘子。

2.5。细胞增殖实验

分析RA信号干涉DPSC扩散的影响,细胞增殖试验在96 -孔板进行了使用细胞计数kit-8 (CCK8;Dojindo,日本东京)。成骨诱导后1、2、3、4、5天,10% CCK8试剂添加到每个在37°C,孵化2 h之前测量光密度(OD)的样本值标在450海里。细胞增殖能力是由OD值表示。

2.6。RNA隔离、rt - pcr和实时rt - pcr

总RNA提取DPSCs使用试剂盒试剂(表达载体)。使用2μg的RNA, cDNA六聚体与随机合成低聚糖(dT)和逆转录酶(英杰公司)根据制造商的协议。实时rt - PCR反应进行了使用QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、希尔登,德国)和一个iCycleriQ复合彩色实时rt - PCR检测系统。特定基因的引物用于如表所示2。

2.7。在裸小鼠移植

本研究按照一个批准的协议执行。八周大的雌性BALB / c裸小鼠保持一般免费的水和食物。人类DPSCs培养存在与否的BMS 493 3天前结合40毫克的羟基磷灰石/磷酸三钙(HA / TCP)陶瓷颗粒。混合物被移植的背一边裸鼠皮下注射。8周后,移植是收获和10%福尔马林固定48 h和脱钙在缓冲10% EDTA (pH值8.0)一个月前在石蜡包埋和切片。

2.8。组织学分析

部分被苏木精和伊红染色(他)来检测DP形态变化的直流微型猪和移植的新骨形成。马森的三色的染色应用评价胶原原纤维存款。位于马里兰州Rockville Image-Pro + 6.0(媒体控制论)用于矿化的定性测量。

2.9。免疫组织化学染色

免疫组织化学染色进行了如前所述[34]。简而言之,部分deparaffinized,水化,沉浸在10% H₂O₂10分钟淬火内源性过氧化物酶。他们孵化一夜之间在4°C主要抗体。这里使用的抗体主要包括针对牙质sialophosphoprotein (DSPP)(猫。不。ab216892 Abcam,剑桥,英国)、骨钙素(OCN)(猫没有。ab13418 Abcam,剑桥,英国),胶原蛋白I型(COL-1)(猫没有。美国罗福斯生物纪念nb600 - 408)。在第二天,部分清洗和孵化在二级抗体室温。DAB染色进行民建联衬底设备(细胞信号,丹弗斯、马、美国),与他对比染色。位于马里兰州Rockville Image-Pro + 6.0(媒体控制论)用于矿化的定性测量。

2.10。统计分析

所有统计计算都使用SPSS 13.0统计软件进行。学生的 - - - - - -执行测试来确定统计学意义。值≤0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。RA信号减少在皇冠钙化的落叶从小型猪狗

首先,我们使用DCs皇冠从小型猪模型在牙齿发育钙化。他染色显示,牙釉质的DCs E50(数据变得明显1(一)和1(一个 )),但在DP,分泌的细长成前期牙质才出现E60(数字1(B)和1(B ))。因此,我们指定DCs的发展阶段的小型猪E50和E60贝尔和钙化阶段后期,分别。探讨RA信号在皇冠钙化的作用,我们研究了RNA的表达模式RA受体α(RARα),β(RARβ),细胞视黄结合蛋白1和2(CRABP1和CRABP2在DCs E50 E60。我们发现RARα并不表示在整个DCs E50 E60和牙胚CRABP1表达式显示小区别两个阶段(数据未显示),而mRNA的表达RARβ(数据1(C),1(C ),1(D)1(D ))和CRABP2(数据1(E),1(E ),1(F)1(F ))是突出在间充质细胞和E50 E60显著下降。考虑的同时减少RARβ和CRABP2可以表达下调RA的激活信号,我们建议RA信号起着消极的作用在皇冠钙化和成牙质细胞分化。

3.2。RA DPSCs抑制成骨分化和细胞增殖在体外

DPSCs是牙齿牙髓干细胞的分离,这是来自牙乳头,间充质间,在开发过程中。基于上述发现,我们提出一个假设的成骨的潜力DPSCs可以由RA信号控制,除了参与成矿的牙质在牙齿发育。为了证实这一点,DPSCs培养的成骨的介质有或没有RA补充。首先,高山活动,早期成骨分化的标志,进行了分析。实验处理10组⁷10米,⁶10 M,⁵M的RA,基于之前文献[13,19]。在DPSCs,高山活动减少7天在上面的实验小组。我们选择的最低有效浓度的10⁷M(图2(一个)进一步的实验。经过14天的文化,DPSCs治疗RA显示更少的矿化结节(图2 (b))和定量测量显示低浓度的钙(图2 (c)比对照组)。扩散DPSCs减少了RA诱导4天之后,见CCK8试验(图2 (d))。实时rt - pcr进行评估包括成骨的基因的表达水平高山,骨钙素(OCN),骨桥蛋白(OPN),一个相关的转录因子osterix(OSX)。与对照组相比,有显著减少的表达成骨的标记(高山,OCN,OPN),OSX在RA-treated DPSCs天3、7、10、14(数字2 (e)- - - - - -2 (h))。这些结果表明,RA DPSCs抑制成骨分化和增殖在体外。

3.3。百时美施贵宝DPSCs 493促进成骨分化和抑制增殖在体外

进一步证实RA信号的作用在DPSCs成骨分化,10⁷10米,⁶10 M,⁵493年百时美施贵宝M, pan-RARs的反兴奋剂,培养基中添加调节DPSCs RA信号。的10⁷493 BMS,高山活动增加(图7天后文化3(一个)),和更多的矿化结节(图3 (b)(图)和更高浓度的钙3 (c))。扩散DPSCs减少10。治疗组⁷M BMS(图3 (d))。接下来,我们研究了由半定量rt - pcr成骨的基因的表达。在14日长成骨诱导,的表达高山,OCN,OPN,OSX增强了BMS 493 - DPSCs治疗,而对照组(数字3 (e)- - - - - -3 (h))。总的来说,这些结果表明,百时美施贵宝493促进成骨分化和抑制DPSCs扩散在体外。

3.4。百时美施贵宝DPSCs 493促进成骨分化在活的有机体内

测试RA信号是否会影响骨生成在活的有机体内,人类DPSCs治疗有或没有BMS 493 3天前混合与HA / TCP陶瓷粒子和皮下移植到裸鼠。8周后,移植组织被检索和脱钙。他染色显示的形成更多的骨突组织BMS 493 -治疗DPSCs比对照组(数字4(一)和4(一个 ))。马森的三色的染色,胶原纤维染色的蓝色,与一个红色背景的细胞和其他结构。这里,它表现出更大的蓝色区域,显示更多的纤维组织的形成,骨形成的早期阶段,在BMS 493 - DPSCs治疗,相对于控件(数字4(C)和4(C ))。定性的测量显示更多新形成的骨组织(图4(B))和胶原纤维组织(图4(D)) 493年BMS -治疗组比对照组。此外,包含IHC进行评估骨的/牙原性的标记表达式。表达水平的DSPP, OCN, COL-1 BMS 493 -治疗组显著高于控制(数字5(一),5(b),5(d),5(e),5(g)5(h))。定性测量证实DSPP的相对差异表达,OCN, COL-1 BMS 493组和对照组(之间的数字5(c),5(f)5(我))。总的来说,这些结果表明,骨/牙质的再生潜力DPSCs可以大幅提高反演RA信号在活的有机体内。

4所示。讨论

视黄酸是胚胎发育的早期信号,有至关重要的作用在牙齿发育的早期阶段10- - - - - -12]。研究表明RAR信号参与产后骨代谢(35]。RA的负面作用,RAR在骨和骨矿化16,19,36]。在小鼠牙齿发育,RARβ表达式是发起贝尔阶段和成在37]。CRABP2在牙间充质细胞的表达,减少在牙质开发在鼠标38]。人类DPSCs CRABP2击倒增强odontoblastic分化。从肌原性的祖细胞成骨分化过程中表达下调和负调节成骨分化39]。小型猪与人类相似的下颌解剖学和哺乳动物牙齿(40]。在目前的研究中,同时减少的表达RARβ和CRABP2在小型猪牙间充质细胞在牙齿发育显示RA信号的负作用在牙原性的分化和牙本质矿化。

近年来,DPSCs被证明是一个有前途的选择在牙质和骨再生。能够准确操作干细胞所需的细胞谱系仍然是一个追求目标的研究(41]。鉴于成矿RA的负面作用,我们建议阻止RA信号可能是一种有效的方法从DPSCs牙质再生。击倒的CRABP2 DPSCs通过慢病毒转染提升DPSCs的牙原性的分化在体外(38]。然而,程序上的困难和安全问题是慢病毒转染的临床应用的障碍。在这种情况下,反演RA信号BMS的493是一个新方法来改善骨的/牙原性的分化组织再生的DPSCs在体外和在活的有机体内。目前的结果表明,百时美施贵宝493增强骨的/ DPSCs牙原性的分化潜力在体外和增强骨突的再生组织在活的有机体内。尽管先前的研究显示RA信号有一个重要的角色在调节不同的细胞的增殖(42,43),研究了有趣的结果在我们的工作,人类DPSCs下降时的扩散激活或阻断RA信号经过4天的文化,这表明DPSCs可能独立于RA信号的增殖和成骨的感应可能影响细胞增殖。

msc骨的/牙原性的分化的不同阶段的特点是一些标记。高山参与骨矿化和早期成骨分化标记(44,45),而OPN和OCN特定矩阵与骨代谢相关的蛋白质和重塑,迟到了成骨细胞的分化标记在msc (45,46]。在成骨诱导在体外,我们的表达进行了研究高山,OPN,OCN通过实时rt - pcr。他们同步减少由于RA治疗显示RA的负面影响骨DPSCs的早期和晚期分化期。在发展中特异表达OSX是一个关键的转录因子的骨头(47)和增强成骨分化潜能的干细胞(48,49]。在老鼠的牙齿发育,OSX据报道,高度表达成骨的间质而成,及其在老鼠odontoblast-like细胞过度导致增强转录的牙原性的标记,DSPP(50]。的差别通过实时rt - pcr,我们发现了对这些OSX由于类风湿性关节炎及其增强由于BMS 493。这些结果表明OSX的作用在调节RA信号在成骨分化的DPSCs(图6)。未来的研究需要探讨RA和相关信号的作用在骨的/牙原性的分化和专注于特定的OSX风湿性关节炎的作用机制。DSPP成是一个牙原性的标志广泛表达于成熟和牙质51,52]。COL-1矿化组织是一个重要的组成部分,和报告支持其潜力提高成骨的生存和表达式,在msc chondrogenic表型在活的有机体内(53]。目前的研究证明,治疗与BMS 493改善DSPP的表达,COL-1 OCN以及增强DPSCs的矿化在活的有机体内。

相比之下,一些研究已经表明RA的积极作用通路的成骨分化msc (54- - - - - -56)和牙髓细胞(57- - - - - -59]。然而,他们的在体外诱导时间是短于7天而骨是一个长期的和动态的过程。此外,长期的在体外干细胞的文化人类脱落乳牙牙周韧带和纸浆显示成骨分化,改善RA (60]。不同的文化环境、不同诱导时间和不同的细胞类型可能解释这种差异。在任何情况下,在骨的RA信号的具体机制/牙原性的分化仍有待划定。

5。结论

本研究表明RA信号通路参与了牙冠钙化和表明,激活RA信号减少的成骨分化潜能DPSCs和阻塞RA信号增强在体外和在活的有机体内。风湿性关节炎的调制信号有潜力提高组织再生和解释骨和牙发生的机制。RA和其下游信号之间的关系需要更详细地研究更好地理解这个过程。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委81570940和81570940 JD);北京口腔医院的学科建设基金,学校口腔,首都医科大学(19-09-02 JD);中国医学科学院研究中心(2019号ru020);首都医科大学,北京市政府拨款,SW(北京学者Program-PXM2018_014226_000021)。

补充材料

补充图1:干预RA信号与不同浓度的RA和百时美施贵宝493体外改变了高山活动不同(A, B)。(补充材料)

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