来自顶端乳头干细胞的外泌体通过诱导特异性牙本质形成促进牙本质-牙髓复合再生

摘要

再生牙髓手术（Reps）是用张开的牙齿治疗永久性牙齿的牙髓或根本疾病的新选择。组织学上，在Reps之后在根管中形成的新组织主要是水泥或骨状矿化组织，但不是真正的牙本质 - 纸浆复合物。因此，如何促进牙本质 - 纸浆复杂再生，提高代表临床效应已成为一个突出的研究课题。来自顶端乳头（SCAP）的干细胞来自牙科乳头，可分化为产生根牙本质和牙髓的原发性牙卵细胞和牙齿纸浆细胞。外泌体是干细胞旁静脉活性的关键调节剂，可以影响受体细胞的功能。在该研究中，将突出的外泌体（SCAP-EXO）引入含有骨髓间充质干细胞（BMMSC）的根片段中，并将皮下移植到免疫缺陷小鼠中。我们观察到牙科纸浆样组织存在，并将新形成的牙本质沉积在根管中的现有牙本质上。之后，阐明了SCAP-EXO对BMMSCs常规发生的影响体外．我们发现，用SCAP-EXO处理的BMMSCs中牙本质唾液酸磷蛋白和矿化结节形成的基因和蛋白质表达显着增加。总之，SCAP-EXO被BMMSCs内吞，明显改善了其特定的牙本发生。衍生自牙科干细胞的外泌体可包括急诊牙髓复合物复合再生的潜在治疗方法。

1.介绍

牙齿牙髓或牙齿牙齿的牙髓或根本疾病的治疗对临床医生具有挑战。传统的曝光方法受到不完全根部形成的限制，具有开放的顶点和短根。再生牙髓手术（REPS），具有坏死纸浆和/或恐慌牙周炎的未成熟牙齿的新治疗选择，是基于组织工程三联的概念的生物学方法[1.]. REPs中的组织再生主要是由于细胞归巢效应，这是由招募到空根管中的自体牙干细胞（如残余牙髓干细胞、来自根尖乳头（SCAP）的干细胞、牙周膜干细胞和来自颌骨的骨髓间充质干细胞）引导的[2.,3.］.Reps允许消除症状和骨愈合，并导致持续的根壁厚度和根长增加的根壁厚度。然而，我们以前的研究表明，在术牙齿牙齿炎的牙齿中的Reps之后，在仔细牙周炎的牙齿中形成自由细胞水泥样组织和骨状矿化结构[4.］.研究还表明，在代表后的运河中新形成的组织不是真正的牙本质 - 纸浆复合物，而是包括结缔组织，水泥样组织和骨状组织的异质组织[5.,6.］.此外，牙齿干细胞在纸浆坏死和顶端牙周炎的情况下的存活率是不够的，并且来自颌骨的BMMSCs可能是在REBIS期间与根管归巢的主要干细胞[7.]. 因此，如何促进牙本质-牙髓复合体的再生，提高REPs的临床疗效已成为一个突出的研究课题。

随着组织工程的发展，最近的证据表明，基于间充质干细胞（MSCs）的组织再生主要依赖于旁分泌效应，如营养因子、细胞因子和细胞外小泡的分泌[8.］.来自间充质干细胞（MSC-EXO）的外泌体是具有杯形双膜结构的细胞外微薄膜，其直径为30-150nm [9,10.］.此外，MSC-Exo含有生长因子;富含生物活性脂类、蛋白质、mrna和调节miRNA;在细胞间通讯中起重要作用;并能影响受体细胞的功能[11.,12.］.MSC-EXO用作调节组织再生的旁静脉或自分泌介质。迄今为止，MSC-EXO已被广泛应用于组织再生和修复方式，例如缓解创伤性脑损伤，增强心脏修复，保护肾脏免受急性缺血再灌注损伤，以及促进肌肉再生等应用[13.–16.］.

SCAP在开放尖恒牙的牙体发育和牙髓再生中起着重要作用。SCAP可分化为原始成牙本质细胞和牙髓细胞，产生根牙本质和牙髓，是牙髓再生的一种有前景的干细胞来源。此外，由根尖乳头干细胞衍生的外泌体(SCAP- exo)可能携带SCAP的特定生物学信息。因此，我们假设在REPs期间给予SCAP-Exo可能会增强牙本质的形成并改善牙本质-牙髓复合体的再生。在本研究中，我们评估了SCAP-Exo促进牙本质-牙髓复合体再生的潜力，以及SCAP-Exo可能对BMMSCs生物学功能的调控作用，特别是在牙本质生成能力方面。

2。材料和方法

2.1。突然分离和识别

人类受到中国医科大学临床学院的牙科诊所的每个健康患者（12-15岁）中收集了患有未成熟根的第三摩尔。该研究批准了中国医科大学口腔医学院伦理委员会（201508年）。在2mg / ml胶原酶I（Worthington，USA）和4mg / mL Dispase II（Mannheim，Germany）的溶液中，从牙齿，切碎和消化的牙齿，切碎和消化的顶端乳头拉伸。将单细胞悬浮液在10cm培养皿中播种并用α最小基本培养基培养（α.-mem，Hyclone，USA）补充有15％胎牛血清（FBS，MRC BR1），2mM L-谷氨酰胺（Biosource / Invitrogen，USA），100u / ml青霉素 - 链霉素（Hyclone）和0.1mm L-抗坏血酸2-磷酸盐（Wako，Japan）和维持在5％CO_2.在37°C。采用抗cd29、CD44、CD105、CD146、CD34和CD45抗体(Abcam，美国)通过流式细胞术鉴定SCAP。在成骨和成脂诱导4周后，评估SCAP的成骨和成脂多能分化潜能。茜素红S和油红O染色用于检测矿化结节和脂滴的形成。实验中使用了第三代的SCAP。

２.２.BMMSC的分离与鉴定

选择和麻醉了六至八周的Wistar大鼠（从Vitaliver，北京，北京，北京），并用2％戊巴比妥钠麻醉。分离后肢的股骨和胫骨以暴露骨髓腔。然后，使用100 u / ml青霉素 - 链霉素和2％BSA（Meilun，中国）赶出骨髓。将单细胞悬浮液接种在10cm培养皿中，并用5％CO中的常规培养基培养_2.在37°C。与SCAP一样，评估BMMSCs成骨和成脂的多能分化潜能。

2.3。SCAP-EXO隔离和识别

根据以前的协议分离了SCAP-EXO [17.,18.］.对于外泌体分离，当细胞达到60-80％汇合时，用无血清培养基替换常规培养基，另外培养48小时。然后，将上清液在4°C 3,000×以4℃下依次离心20分钟，20,000×30分钟，120,000×两个 H最后，在200分钟内重新悬浮外体颗粒 μ.L PBS。20μ.l加入30 μ.L裂解缓冲（BeyoTime Biotech Co.，中国上海，中国）在冰上为1小时。由二碳酸（BCA）试剂盒（Beyotime，中国）检测外泌体的总浓度。将SCAP-EXO储存在-80°C下进行后续实验。

用透射电子显微镜（日本日立H-800）鉴定了SCAP Exo的形态。通过纳米粒子追踪分析这些外显体的大小。此外，使用针对CD9（1）的特异性抗体通过western blot检测CD9和Alix : 250，Abcam，美国）和Alix（1 : 美国阿布坎500号）。

2.4。牙齿碎片的制备

牙齿来自临床健康的前磨牙为正畸原因拔牙。先用刀片去除根表面的牙周组织，然后用牙槽钻去除牙骨质、牙髓组织、牙釉质和部分牙本质。根管间隙的直径扩大到3mm左右，将牙齿分成5mm长的根段。然后将牙块浸泡在17% EDTA中5分钟，超声清洗机去离子水中洗涤10分钟，5% EDTA中浸泡10分钟，超声清洗机去离子水中洗涤10分钟。其中一个牙齿碎片孔用玻璃离子水泥密封(Fuji IX, GC, Tokyo, Japan)。然后在4°C条件下，在添加50 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素的磷酸盐缓冲液中保存。

2.5。动物实验

本研究由中国医科大学伦理委员会批准动物实验（201315）。所有操作均在6周龄裸鼠上进行（N=10)全身麻醉。首先,50μ.g / ml scap-exo和a 用明胶海绵（Xiang En，Jiang Xi，China）引入牙齿片段并皮下移植到免疫缺陷小鼠的背部; 将含有明胶海绵的骨髓间充质干细胞作为对照植入牙齿碎片中。每只老鼠有四颗牙齿碎片，每侧两颗。每组10个样本。移植后12周，对小鼠实施安乐死，取出牙齿碎片进行组织学分析。

2.6。组织学检查

将样品固定在4％多聚甲醛24小时，并在10％EDTA（pH7.4，Meilunbio，China）中脱钙3个月，然后将所有样品嵌入石蜡中并切成5 μ.米的部分。切片用H&E染色进行组织学分析。接下来，我们计算成牙本质细胞的数量，并使用ImageJ软件(1.50i，美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)测量新牙本质的厚度。

2.7. 外显体摄取试验

按照制造商推荐的方案，使用PKH-26红色荧光细胞连接试剂盒(Sigma，美国)对SCAP-Exo进行标记。简单地说,SCAP-Exo (300μ.外泌体的G蛋白当量μ.l稀释剂c）用pkh26染色（1 μ.L的PKH26乙醇染料溶液250 μ.L稀释剂C）通过移液室温度4分钟。然后，500 μ.加入外泌体耗尽的血清L终止标记反应。接下来, BMMSCS在玻璃盖玻片上播种并放置在12孔板内。播种后二十四小时，将PKH-26标记的SCAP-EXO与BMMSC孵育3小时。向对照组中加入等体积的PBS。用4％多聚甲醛固定细胞，用DAPI染色细胞核。最后，我们确定了使用荧光显微镜的BMMSCS内化SCAP-EXO。

2.8。单元计数套件-8（CCK-8）测定

为了评估SCAP-Exo对细胞增殖的影响，将BMMSCs与补充有不同浓度SCAP-Exo的培养基孵育，并使用CCK-8试剂盒（日本熊本道津多）测定增殖。简而言之，骨髓间充质干细胞接种于96孔板（2000个细胞/孔）中，并与条件培养基（含0、5、20和50个细胞）培养 μ.g / mL SCAP-Exo)。1、3、5天后，大约10天μ.L的CCK-8溶液90μ.lα.将常见孔加入到每个孔中，将板在37℃下孵育另外2小时。用450nm波长的微孔板读取器（Tecan，奥地利）检测光学密度。

2.9。Ki-67染色测定

BMMSCS（ /孔）在玻璃盖玻片上播种放置在12孔板内并培养48小时。用4％的多聚甲醛固定细胞，并使用0.3％Triton X-100（Beyotime，中国）透透透明。然后，将玻璃盖玻片与抗KI-67（CST，USA）在4℃下孵育过夜。接下来，在室温下与荧光二抗（Proteintech，Chicago，USA）一起温育样品2小时;然后进行DAPI染色，并使用抗醌密封片。基于使用荧光显微镜的每种样品的10个图像计数Ki-67阳性和总细胞数。KI-67阳性细胞的数量表示为总细胞数的百分比。

2.10。体外骨/牙源性分化试验

BMMSCS（ 将细胞/孔）在6孔板中接种并用含有不同剂量的SCAP-EXO（0,5,20和50的条件培养基进行预处理 μ.g/mL)。然后，用含有1.8 mM磷酸二氢钾(Sigma-Aldrich)和10 nM地塞米松(Sigma-Aldrich)的骨/牙髓诱导培养基替代培养基。培养7天后，提取总mRNA, 10天后，分离蛋白以评估成骨/成牙本质标记物的表达水平。

2.11。实时聚合酶链反应(PCR)分析

使用GOTAQ®QPCR主混音（Promega Corporation，Madison，Wi，USA）在7500个实时PCR系统（应用生物系统）中进行了实时PCR。牙本质唾液酸磷蛋白的mRNA表达水平（DSPP），碱性磷酸酶（alp.)和矮子相关转录因子2 (Runx2）评估。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH.)被用作正常化的管家基因。使用公式2对数据进行计算和统计分析^-ΔΔCT.．引物序列如下:DSPP前底漆，5 -CTGTTGGGAAGAGCAAGATAG-3 ;DSPP反向底漆，5 -CCAAGATCATTCCATGTTGTCCT-3 ;alp.前底漆，5 -Taaggacatcgcctaccagctc-3 ;alp.反向底漆，5 -TCTTCCAGTGTCAACGGT-3 ;Runx2前底漆，5 -GcaccagcccataAtaga-3 ;Runx2反向底漆，5 -TTGGAGCAAGGAGAACCC-3 ;GAPDH.前底漆，5 -CCGGCGTCCGACCTGTGAAC-3 ;GAPDH.反向底漆，5 -GGGCGAAGGCTCCAGAGGA-3 ．

2.12. 蛋白质印迹分析

用裂解缓冲液(Beyotime Biotech Co.， Shanghai, China)提取总蛋白。20μ.通过12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加载并分离全蛋白质，并将电泳转移到聚偏二氟化乙烯膜（Millipore Corporation，USA）。通过在室温下在4％BSA中孵育1小时，然后与抗DSPP（1：500，Santa Cruz Biotechnology，USA），反润X2（1：250，Santa Cruz Biotechnology，USA）孵育膜。抗ALP（1：200，Santa Cruz Biotechnology），或者反β-Actin（1：1,000，Santa cruz生物技术）初级抗体在4℃过夜。山羊抗兔/抗小鼠IGG IgG IRDYEL 800CW二级抗体（1：1,000，ABBKINE，USA）用于在室温下培养膜1小时。用Odyssey CLX仪器（Li-Cor，Lincoln，Ne，USA）检测蛋白质条带，并使用imagej软件进行灰度分析（1.50i，国家健康机构，贝塞斯达，MA，美国）。

2.13。茜素红的染色

用骨 - /牙核诱导培养基培养3周后，将所有培养物用60％异丙醇固定1分钟。将茜素红S溶液加入每个孔中以进行染色。通过用蒸馏水反复洗涤除去非特异性染色。用ImageJ软件进行矿化结节形成的半定量分析。

2.14。统计分析

使用SPSS 20.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。所有数据都被记录为 并复制三个独立实验。通过单向性方差分析（ANOVA）测试差异。如果存在差异值小于0.05。

结果

3.1。识别SCAP，BMMSCS和SCAP-EXO

大多数隔离的垫圈保留了纺锤体形状并在初级培养中形成菌落（图。S1A.)．当在成骨和脂肪发生调节培养基中培养SCAP时4周，发现基于茜素红S染色形成矿化结节（图。S1B.)和油红O染色的脂滴（图。S1C.)．此外，流式细胞术分析表明，突出表达的间充质干细胞表面标记包括CD29，CD44，CD105和CD146，但未表达出血包血标志物CD34和CD45（图。S1D.)．

当培养BMMSCS 7天时，显微镜观察细胞粘附生长，显示短轴或多边形形状（图。S2A.)．在用骨质酸或脂肪发生调节培养基培养3周后，也发现BMMSCS形成矿化结节和脂液滴（图。S2B，2C)．

通过透射电镜观察，SCAP-Exo包含双层膜和杯板状结构(图1（a）)．此外，纳米粒子跟踪分析显示粒径为120.6nm的主要峰（图1（b）)．此外，SCAP-Exo表达特定的外泌体标记物CD9和Alix(图1（c）)，基于western blot。

３．２．SCAP-Exo促进BMMSC-Based牙本质-牙髓复合再生

如示意图所示（图2（a）），用SCAP-EXO，BMMSC和支架的牙齿片段皮下植入免疫缺陷小鼠，而对照组用相同的制剂处理，而无需粘接-exo。12周后，组织学分析表明，在SCAP-EXO基团中形成了一种新的连续牙本质层，其中牙卵细胞（黄色箭头）的数量显着增加，具有高柱状形状和偏振形态。它们位于纸浆的交界处，以有序的布置在纸浆和预先形成，形成牙牙子流入牙本质小管。此外，还观察到更多的血管内腔（红色箭头）。在对照组中，我们没有观察到这种新的牙本质和Odontoblast层的形成（图2（b）). SCAP Exo组的新牙本质厚度和成牙本质细胞数量均高于对照组（图2（c）和2（d）)．这些数据表明，SCAP-EXO促进了基于BMMSC的牙本质纸浆复合物再生。

3.3. SCAP-Exo被BMMSCs内吞

我们接下来将PKH-26标记的碎片外部添加到BMMSCs的培养基中体外．3 h后，荧光染色显示许多SCAP-Exo(红色)位于dapi标记的BMMSCs(蓝色)的细胞质中;而对照组仅BMMSCs细胞核用DAPI染色(蓝色)(图)3.)．这些数据表明BMMSCS可以占用SCAP-EXO通过内吞作用。

3.4。SCAP-EXO诱导了BMMSCs的牙本发生

CCK-8分析和Ki-67染色显示，SCAP Exo对BMMSCs的增殖率没有显著影响（图4（a）和4（b）)．为了进一步探索突出的碎片 - exo如何调节BMMSCs的骨质/牙突化分化，我们使用SCAP-EXO治疗BMMSCs，然后在成骨诱导条件下培养细胞。茜素红S染色表明，以浓度依赖的方式，用SCAP-EXO处理显着增加了矿化结节形成（图4（c）)．此外，我们检查了骨肉/牙突菌基因和蛋白质的表达水平。如图所示4（d）， SCAP-Exo增加了牙本质标记物的基因表达DSPP，20和50 μ.与对照组相比，G / ML SCAP-EXO组表现出更强大的增加（ )．尽管如此，SCAP-EXO对基因表达水平没有显着影响alp.和Runx2．与qPCR分析结果一致，DSPP蛋白在20μ.50 g / mLμ.g / ml scap-exo治疗（ ）;然而，SCAP-EXO也不会影响ALP和RUNX2的蛋白质水平（ ;数字4（e）)．因此，这些数据表明，SCAP-EXO促进了BMMSCs的特异性牙本发生。

4。讨论

牙本质-牙髓复合再生的策略通常分为基于细胞和无细胞治疗。以细胞为基础的治疗方法包括将外源性干细胞移植到带有信号分子的支架上，使其进入宿主的根管系统，以实现再生。以msc为基础的组织再生治疗模式包括将MSCs转移到原位并分化为功能细胞以替代受损细胞[19.］.一般情况下，选择牙源性间充质干细胞移植到根管。宣等等。有报道称，人类乳牙髓干细胞能够再生整个牙髓，形成新的牙本质，以促进根的发育[20.]，虽然SCAP衍生自顶乳头的未成熟组织，并且由比牙科纸浆更多的未分化细胞组成[21］.然而，MSCs的临床翻译应用受道德问题，可用性，干细胞隔离和储存以及其他因素的专业技术技能受限。此外，越来越多的证据表明，大多数外源性MSCs迅速消失后普形[22］.基于“细胞归巢”理论，无细胞方法通过调节位于根尖周围的内源性干细胞的迁移、增殖和分化来实现组织再生。据信，“细胞归巢”是目前大多数rep临床方法的基础[23］.一些学者认为干细胞群的细胞龛可以通过产生免疫调节因子和促进旁分泌活性来建立一个合适的微环境，从而刺激祖细胞的分化原位[19.,24,25］.已显示天然化合物或生物活性物质具有诱导特异性牙本发生的潜力[26,27］.

目前，基于MSC-Exo的方法为组织再生提供了新的治疗选择。研究表明，不同类型的细胞具有不同的外泌体特征[28］.此外，MSC-EXO的复杂组合物可能会镜像父母细胞的迁移和迁移到特定组织的能力[22］.MSC-Exo还含有大量的生物活性分子，可以转移到目标细胞，影响其命运和组织再生。此前的一项研究表明，从牙髓干细胞中分离出的外泌体可以诱导牙源性分化体外并触发牙髓状组织的再生在活的有机体内[27］.在本研究中，我们评估了SCAP-Exo促进牙本质-牙髓复合体再生的潜力。我们的在活的有机体内研究表明，SCAP-EXO可以促进新形成的牙本盆组织和Odontoblasts的产生。此外，有序排列中有大量的极性异形细胞。Odontoblast偏振标志着对称间充质细胞到不对称的牙卵细胞的形态变化，这是牙齿发育和牙本质形成的先决条件和基本步骤[29］.此外，我们在根管中观察到新形成的纸浆牙本质复合物中的许多血管。血管生成是通过提供足够的氧气和组织存活营养的组织再生的先决条件[30.］.已有报道称牙髓干细胞来源的外泌体对血管生成有影响[31］.突然可以分泌大量的含量造型因素[32]. SCAP-Exo是否能促进血管生成及其相关机制有待进一步研究。总之，组织学研究结果表明，SCAP Exo可促进REPs牙本质-牙髓复合体的再生。

为了探讨突出的液体促进纸浆牙床复合物再生的潜在机制，我们评估了它们对BMMSC的增殖和分化的影响体外．我们发现，SCAP-Exo并不影响BMMSC的增殖，但通过增强BMMSC中DSPP的表达以及矿化结节的形成，显著调节其牙本质的形成。DSPP是一种前体蛋白，可被裂解为两种蛋白，即牙本质唾液蛋白(DSP)和牙本质磷蛋白(DPP)，这两种蛋白被认为在牙本质的形成中起着至关重要的作用[33］.DSPP由成牙本质细胞分泌，在细胞外基质中含量最多;此外，它可以作为矿物成核和生长的模板，介导牙本质形成过程中细胞外基质的矿化[34］.此外，它是成牙本质细胞的最终分化标记物[35］.最近，Frozoni在小鼠模型的牙髓帽中使用了BMMSCs，他们发现GFP标记的BMMSCs被直接使用，7周后在根管中观察到GFP标记的DSP阳性成牙细胞[36］.这项研究可能有助于解释他们的观察结果。牙髓暴露部位周围的内源性牙髓干细胞可能将特定物质转移到移植的骨髓基质干细胞中，诱导骨髓基质干细胞发生牙本质形成通过旁分泌的影响。特别是在本研究中，SCAP-Exo处理对另外两种矿化相关蛋白ALP和Runx2的表达水平没有显著影响。我们推测SCAP-Exo可能主要促进DSPP的分泌，而不是bmmsc的分化。

目前，外泌体如何影响受体细胞仍是未知的。外泌体包含多种rna(包括mRNA、miRNA和tRNA)和蛋白质[10.,37］.八十一点等. 研究表明，MSC Exo中五种最丰富的miRNA占总miRNA的高比例（50%），这表明大量存在的特异性miRNA可能对靶细胞产生生理影响[38］.此外，外泌体蛋白可以通过受体细胞直接使用。我们以前的研究表明，受体MSCs可以从供体MSCs接收外来物质，并从这些外来源的再利用Fas来改善接受者MSC功能[39］.在这项研究中，我们认为SCAP-EXO可能会转移扰动组织的生物学信息以重新编程BMMSCs的功能。然而，CAP-EXO影响BMMSCs的生物功能的详细机制需要进一步阐明。

SCAP-Exo作为全身细胞-细胞通讯介质，在组织再生中发挥重要作用。我们认为，不同类型的细胞在不同状态下释放的外泌体可能包含不同的内容，以传递特定的信息，这可能对靶细胞有不同的含义。因此，SCAP-Exo的应用可能为促进rep术后牙本质-牙髓复合再生提供一种新的策略。进一步的研究需要建立具有开放尖的恒牙根尖周炎的动物模型，以确定SCAP-Exo在rep中的疗效。选择合适的支架将外泌体运送到根管是至关重要的。有证据表明，支架的几何和力学特性可以影响细胞行为和MSCs在支架表面的粘附[40–42]. 需要进一步的研究来选择合适的支架材料，以便将来在根管中使用SCAP-Exo，并阐明在REPs期间SCAP-Exo和支架材料之间可能的相互作用。

5。结论

SCAP-EXO可以通过BMMSCS内吞，显然改善了其特异性牙本发生，并促进了牙本质纸浆复合物再生。本研究为临床中的基于细胞归巢代表提供了优化的方法。它可能是一种有希望的治疗方法，在再生胸腺系中使用标准化外泌体试剂。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

利益冲突

作者明确说明，与本文没有利益冲突。

致谢

中国天然科学基金的补助金（No.81771059）是辽宁省的自然科学基金（201602842号）的支持，中国医科大学青少年研究基金（Grant No. QGZD2018083）。教育部免疫解性（中国医科大学）的重点实验室得到了一些工作。

补充材料

补充图1:根尖乳头干细胞(SCAP)鉴定。(A) SCAP在原代培养中形成菌落形成单位。(B)茜素红S染色显示矿化结节形成。(C)油红O染色显示脂滴形成。(D)流式细胞分析显示SCAP CD29、CD44、CD105、CD146阳性，CD34、CD45阴性。补充图2:骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的鉴定。(A) bmmsc的形态。(B)茜素红S染色显示矿化结节形成。(C)油红O染色显示脂滴形成。(补充材料)

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