的促血管生成作用的比较脂肪来源干细胞和包皮成纤维外来体上人工真皮预制皮瓣GydF4y2Ba

抽象GydF4y2Ba

由于缺乏新的血管和促进血管生成的相关因素，大型的预制皮瓣经常会发生坏死或愈合不良。脂肪来源的干细胞外泌体(ADSC-Exo)的创新应用解决了预制皮瓣血管化的问题。我们使用下一代测序(NGS)技术分析了ADSC-Exo中microRNA (miRNA)的差异表达，以探索其促进血管形成的潜在机制。我们观察到，与人包皮成纤维细胞外泌体相比，ADSC-Exo能显著促进人造真皮预制皮瓣的血管化。NGS显示，两种外泌体中均有不同表达的mirna。生物信息学分析提示ADSC-Exo中显著上调hsa-miR-760和显著下调hsa-miR-423-3p均可调控the的表达GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba分别促进皮瓣血管化的基因。综上所述，ADSC-Exo可以促进皮肤皮瓣血管化，从而解决人造真皮预制皮瓣新生血管化不足的问题，扩大预制皮肤皮瓣移植的应用。GydF4y2Ba

1.简介GydF4y2Ba

因外伤、肿瘤切除或各种原因引起的涉及大面积皮肤软组织的创伤，往往难以愈合，导致创面难治。由于缺乏血管结构和无法重建血液供应，传统的皮肤移植可能无法成功治疗这类顽固性伤口，因此必须使用皮瓣进行修复。虽然目前临床上广泛应用皮瓣移植修复创面[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，传统皮瓣的厚度受到标本位置的限制。此外，皮瓣的厚度对于深度区域、关节和高磨损和负重区域的伤口尤其重要。预制皮瓣为传统皮瓣的优化设计提供了一种很好的方法。GydF4y2Ba

预制皮瓣包括将任意的皮瓣重建为轴向皮瓣，通过移植已知的血管组织进行伤口修复[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]。这项技术可以增加皮肤皮瓣的选择，允许精确设计和制造皮瓣的大小和厚度，并减少供体组织的损失和浪费。此外，它还能改善修复后组织的美观和局部功能恢复，并保护患者免受强迫体位引起的疼痛[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]。然而，随着预制皮瓣的主要问题是目前的选择范围有限。此外，大型预制皮瓣往往坏死或愈合欠佳，由于缺乏新的血管和促进血管生成相关因素。GydF4y2Ba

脂肪来源干细胞(ADSCs)是具有多向分化潜能的干细胞，最早由Zuk等于2001年分离得到[GydF4y2Ba4GydF4y2Ba]。ADSCs在组织修复重建过程中具有促进血管化的作用;然而，他们实现这一目标的机制尚不清楚。目前大多数研究者认为ADSCs主要分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，形成新的血管网络[GydF4y2Ba5GydF4y2Ba]，或分泌的旁分泌因子，如碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子，肝细胞生长因子，血小板衍生的生长因子，和其它血管生成相关细胞因子和生长因子，以促进本地microvascularization [GydF4y2Ba6GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7GydF4y2Ba]。ADSC移植对难治性创面的治疗效果优于现有常规治疗方法[GydF4y2Ba8GydF4y2Ba]。然而，尽管脂肪干细胞，技术问题的诸多优点和肿瘤形成的风险目前限制了其临床应用[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]。外泌体是直径约30-150纳米的膜性小泡，从细胞内基质释放进入细胞外基质[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]。它们携带蛋白质、脂质、核酸等多种生物大分子，参与免疫反应、抗原提呈、蛋白质和RNA转运等多种生理过程[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]。先前的研究报道，ADSC外泌体(ADSC- exo)中的白介素-6可以保护皮瓣免于缺血-再灌注损伤[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]。然而，没有研究报道ADSC外型的促进血管生成在预制皮瓣的能力。GydF4y2Ba

因此，我们将ADSC-Exo和人包皮成纤维细胞外泌体(HFF-Exo)应用于人造真皮预制皮瓣，比较其促血管生成效果。我们还对这两种外泌体进行了下一代测序(NGS)，比较了高富集的microRNAs (miRNAs)，并通过定量方法鉴定了差异表达的mirna。我们利用基因本体论(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes, KEGG)通路数据库分析了靶基因的分布，提示差异表达的miRNAs可能在基因功能调控中发挥重要作用。GydF4y2Ba

2。材料和方法GydF4y2Ba

2.1。分离和培养hADSCs和HFFS的GydF4y2Ba

人体皮下脂肪组织和包皮组织样本来自中国上海海军军医大学长海医院。所有组织均在获得患者知情同意后进行来源。初级人类ADSCs及hff的产生如上文所述[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba,GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]。hADSC和HFF微球分别在低葡萄糖和高葡萄糖的Dulbecco 's Modified Eagle’s Medium (DMEM)(美国犹他州HyClone)和2.5%的外泌体耗尽胎牛血清(FBS) (Gibco, Grand Island，美国纽约州)中重悬，并在含5% CO的湿化培养箱中培养GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba。细胞附着后每2-3天更换一次培养基。GydF4y2Ba

2.2。外来体分离GydF4y2Ba

如前所述，通过极速离心分离从hADSCs和HFFs中分离出外泌体[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]。简言之，细胞培养基由80％衍生于90％汇合hADSCs或HFFS在无菌条件下。Differential ultracentrifugation was performed at 300 × GGydF4y2Ba和2000×GydF4y2BaGGydF4y2Bafor 10 min to remove dead cells, followed by 10,000 × GGydF4y2Bafor 30 min to remove cell debris. The cell pellets were then centrifuged twice for 70 min at 100,000 × GGydF4y2Ba。所有离心在4℃下进行。将粒料最后再悬浮于100 μGydF4y2Bal的冷磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，立即保存在-80℃，1-2周内使用。GydF4y2Ba

2.3。外来体识别GydF4y2Ba

2.3.1。透射电子显微镜（TEM）GydF4y2Ba

丰富的外来体的颗粒在30稀释 μGydF4y2Bal的PBS (HyClone, UT, USA)保存在4℃直到透射电镜(TEM)分析。将一滴外泌体样品放在碳涂层铜网格上5分钟，用2%磷钨酸染色3分钟。用吸水纸去除多余液体，风干15分钟。然后用透射电镜检查制备过程。GydF4y2Ba

2.3.2。纳米颗粒跟踪分析(NTA)GydF4y2Ba

NTA是使用NanoSight仪（Zetaview，粒子Metrix的，德国）根据制造商的方案进行。的particle size distribution and concentration of all types of nanoparticles with diameters of 10–2000 nm could be analyzed rapidly and automatically by NTA. NTA detection technology also ensured the accuracy and repeatability of the sample readings.

2.3.3。Western印迹GydF4y2Ba

western blotting采用5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个样品中的蛋白，并在300 MA的浓度下转移到聚偏二氟乙烯膜(Cell Signaling Technology, MA, USA)中，持续100-120 min。膜最初阻塞在5%的牛血清白蛋白在室温下2 h,然后孵化一夜之间在4°C的主要热休克蛋白(HSP) 70 (Abcam 1: 2000年,英国),3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(1: 1000年,细胞信号技术,妈,美国),组蛋白脱乙酰酶5 (HDAC5) (CST 1: 1000年,美国),或整合素alpha-5 (ITGA5)抗体(1:1000年,细胞信号技术,妈,美国),分别之后,三到四个与Tris-buffered盐水洗,0.1%渐变20。将膜与山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(1:3000,Beyotime，中国)室温孵育2小时。然后使用Alpha成像扫描仪(Tecan, Thermo Fisher Scientific, USA)化学发光观察蛋白表达。GydF4y2Ba

2.4。GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba研究GydF4y2Ba

48只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:ADSC组、ADSC- exo组、HFF组和HFF- exo组。所有实验均按照海军军医大学长海医院卫生科学、动物政策和福利委员会的指导方针批准。GydF4y2Ba

人工真皮预制皮瓣及小腿创面大鼠模型如既往报道[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]。接枝挡板和腹壁伤口缝合后，翼片的基部被多点100注入 μGydF4y2Bal of PBS containing 1 × 10^6GydF4y2Ba脂肪干细胞或HFFS和200 μGydF4y2Bag的ADSC-Exo或HFF-Exo，分别。GydF4y2Ba

分别于术后7、14、21、28天观察四组皮瓣的变化。通过监测皮肤表面颜色、血供和切口周长来评估皮瓣的生存状况。GydF4y2Ba

2.5。免疫组化GydF4y2Ba

皮瓣组织28天手术后切除，并通过组织学染色分析。将切下的皮瓣固定用10％福尔马林和在梯度乙醇中脱水。然后石蜡包埋标本切成5 μGydF4y2Bam切片，苏木精、伊红染色和马尾松三色染色进行组织学观察和评估胶原成熟。CD31检测皮瓣血管生成情况GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba免疫组化染色(1:50,Abcam, UK)。进行组织切片制备和免疫组化分析，如先前报道[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]。brown反应表明CD31阳性。显微照片在光学显微镜下获得(莱卡，德国)。在每个切片中随机选取四个区域，使用Image-Pro Plus 6进行分析。GydF4y2Ba

2.6。皮瓣微血管GydF4y2Ba

皮瓣移植后7天行显微血管造影。低压向大鼠右颈静脉注射30%硫酸钡溶液。第二天取下皮瓣，用x线摄影检查血管网。既往报道进行皮瓣显微血管造影术[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

2.7。ADSC - 外和HFF外向对人脐静脉内皮细胞增殖的作用（血管内皮细胞）GydF4y2Ba在体外GydF4y2Ba

血管内皮细胞是从美国典型培养物保藏中心，在播种GydF4y2Ba 在24孔板中培养每孔细胞，并在高糖DMEM中与2.5%的外泌体耗尽胎牛血清培养，可达到70%-80%的融合。细胞被分为两组:ADSC-Exo组和HFF-Exo组。HUVECs与100个共培养GydF4y2BaμGydF4y2BaG/ml ADSC-Exo or HFF-Exo for 24 h, and the effects of the respective exosomes on cell proliferation were detected using a 5-ethynyl-2 deoxyuridine (EdU) assay kit (RiboBio, Guangzhou, China) [18GydF4y2Ba]，根据制造商的说明。细胞荧光显微镜（蔡司HLA100，上海，中国）下终于观察。增殖将HUVEC通过绿色荧光和由蓝色荧光细胞核指示，并计算这些比率以获得增殖率。GydF4y2Ba

2.8。准备库和测序GydF4y2Ba

使用TruSeq小RNA样本准备试剂盒(Illumina，中国)按照制造商的说明提取总外泌体RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，并使用Agilent 2100生物分析仪进行分析。利用Illumina HiSeq xten平台对文库进行测序。小RNA测序和分析最初由OE生物技术有限公司(中国上海)进行。基本读取通过基调用转换为序列数据(原始数据/读取)。过滤低质量读取，读取值为5GydF4y2Ba主要污染物和聚(A)被去除。读没有3GydF4y2Ba适配器和插入标签和与读取<15或> 41个核苷酸，过滤，并且读取得到清洁。GydF4y2Ba

2.9。生物信息学分析GydF4y2Ba

确定了清洁序列在参考基因组中的长度分布。非编码rna被注释为rRNAs、tRNAs、小核rna (snRNAs)和小核仁rna。这些rna被对齐，然后受到爆炸的影响[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]搜索针对RFAM v.10.1（GydF4y2Bahttp://www.sanger.ac.uk/software/RfamGydF4y2Ba)[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]及基因库数据库(GydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GydF4y2Ba)。已知的miRNAs是通过对miRBase v比对得到的。21个数据库(GydF4y2Bahttp://www.mirbase.org/GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba，并分析了不同样本中已知mirna的表达模式。使用miRDeep2分析未注释的小rna [GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]来预测新的miRNA。根据miRNA前体和数据库的miRBase的发夹结构，相应的miRNA星序列也被确定。差异表达的miRNA进行鉴定阈值GydF4y2Ba值< 0.05。的GydF4y2Ba采用式中的DEG算法计算GydF4y2Ba包。GydF4y2Ba

2.10。预测和miRNA靶基因的功能分析GydF4y2Ba

使用miRanda软件预测差异表达miRNAs的靶基因[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，具有以下参数:GydF4y2Ba 要求严格5GydF4y2Ba种子配对。对差异表达的miRNA靶基因进行GO富集和KEGG通路富集分析GydF4y2Ba ,GydF4y2Ba基于超几何分布。GydF4y2Ba

2.11。实时聚合酶链反应(PCR)GydF4y2Ba

总RNA使用TRIzol®试剂（Life Technologies公司，美国）内皮细胞分离，根据制造商的说明。总RNA的两微克使用反转录成cDNA的miRNA特异性引物（HSA-的miR-423-3p：MIMAT0001340; HSA-的miR-760：MIMAT0004957）用的TaqMan miRNA的反转录试剂盒（赛默飞世尔科技，USA）[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]。Real-time PCR was then performed with an initial denaturation step at 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. The level of the U6 small nuclear RNA gene was used as an internal control, and normalized relative expression levels were calculated using the方法。GydF4y2Ba

2.12。统计分析GydF4y2Ba

数据采用SPSS 17.0进行分析，以GydF4y2Ba 。GydF4y2Ba统计显著性是由方差分析或学生的GydF4y2Ba -GydF4y2Ba测试和基因表达数据集，使用Spearman秩检验了分析。的价值GydF4y2Ba 被认为是显著的。GydF4y2Ba

3.结果GydF4y2Ba

3.1。描述液GydF4y2Ba

外泌体是直径30 - 150nm的细胞内小泡，可以通过各种方法从细胞培养基中获得，包括超离心法、超滤法、免疫亲和捕获技术和微流体分离技术。本研究中分离的外泌体经TEM、NTA和western blot验证。TEM(图GydF4y2Ba1(一)GydF4y2Ba)证实了典型的外泌体形态和NTA(图)GydF4y2Ba图1（b）GydF4y2Ba)表明ADSC-Exo的平均直径为GydF4y2Ba 和HFF-ExoGydF4y2Ba 。GydF4y2Ba

此外，免疫印迹（图GydF4y2Ba图1（c）GydF4y2Ba)显示外泌体标记HSP70高表达。这些结果与外泌体的特性一致。GydF4y2Ba

3.2。GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba研究GydF4y2Ba

四组皮瓣及表皮血供在观察时间点均保持良好，无明显溃疡及感染。术后21-28天观察所有皮瓣的毛发生长情况(图)GydF4y2Ba图2（a）GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

皮瓣切片显微镜观察，ADSC组和ADSC- exo组在皮瓣厚度和胶原蛋白方面无明显差异，但均明显优于HFF组和HFF- exo组(图)GydF4y2Ba图2（b）GydF4y2Ba,GydF4y2Ba图2（c）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba图2（f）GydF4y2Ba)。CD31GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba免疫组织化学染色（图GydF4y2Ba图2（d）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2 (g)GydF4y2Ba)显示ADSC和ADSC- exo组的血管数量明显高于HFF和HFF- exo组。GydF4y2Ba

微血管造影进行术后28天以后发现类似度的ADSC外型和ADSC组预制皮瓣的人工真皮的血管，而这两种都是比HFF和HFF外型组显著更好（图GydF4y2Ba图2（e）GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

3.3。ADSC-Exo和HFF-Exo小RNA组成的NGSGydF4y2Ba

小RNA包括miRNA的，tRNA基因，rRNA的，PIWI相互作用RNA，snRNAs，等等。的miRNA非编码单链RNA分子的长度为约22个核苷酸，其由内源性基因编码的，并参与转录后基因表达的植物和动物的调节。在测序结果的小RNA进行分类，我们比较干净的使用RFAM数据库[读GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba， cDNA序列，物种重复文库[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]，及miRBase数据库[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba,GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]。每个样本中已知mirna的长度分布统计量用折线图表示(图)GydF4y2Ba图3（a）GydF4y2Ba)。此外，基于上述数据库每个样品中的小RNA的分布总结并作为饼图显示（图GydF4y2Ba图3（b）GydF4y2Ba和GydF4y2Ba图3（c）GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

3.3.1。miRNA的表达分析GydF4y2Ba

miRNA的丰度与其表达水平成正比。小RNA测序分析可以通过定位成熟的miRNA序列和计算新预测的miRNA序列来估计miRNA表达水平。根据已鉴定的已知miRNA和新预测的miRNA，计算miRNA表达量为每百万转录本[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]。miRNA表达箱线图显示了数据的对称性和分散性(图)GydF4y2Ba图4（a）GydF4y2Ba)。当样本数量较大(≥3)时，样本间miRNA表达水平的相关性是实验可靠性和样本选择合理性的重要指标。用相关系数热图检验样品之间的相似性(图)GydF4y2Ba4 (b)GydF4y2Ba）和样品 - 样品聚类分析（图GydF4y2Ba4 (c)GydF4y2Ba）;越接近样品相关系数为向一个或优先聚合，较高的样品之间的表达模式的相似性。GydF4y2Ba

3.3.2。差异miRNA分析GydF4y2Ba

使用差异表达分析来鉴定不同样本间差异表达的mirna。对于有生物学重复的成对样本，DESeq2 [GydF4y2Ba28GydF4y2Ba在GydF4y2Ba用于差异miRNA筛选，共发现43个差异表达基因，包括9个上调基因和34个下调基因(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)。不同样品之间的筛选的差分的miRNA示于直方图（图GydF4y2Ba5(一个)GydF4y2Ba)和火山图(图GydF4y2Ba5 (b)GydF4y2Ba）构建澄清差异表达的miRNA的总体分布。热图（图GydF4y2Ba5 (c)GydF4y2Ba)，根据无监督层次聚类显示mirna的差异表达。相同类型的样本一般可以聚集在同一簇中，同一簇中的miRNAs可能具有相似的生物学功能。GydF4y2Ba

3.4。靶基因预测GydF4y2Ba

虽然植物miRNA几乎是完美的它们的靶mRNA的互补性，大多数动物miRNA不完全互补。植物miRNA可结合到靶mRNA（主要是蛋白质编码区域）的任何区域和通过切割靶mRNA或抑制其翻译调节基因表达。此外，动物miRNA被报道为目标的5GydF4y2Ba结束RNA以及该编码区。我们预测使用米兰达算法[miRNA的靶基因GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]。靶基因预测结果见表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba而在补充材料（可GydF4y2Ba这里GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

3.5。miRNA的功能分析GydF4y2Ba

生物过程，细胞组分和分子功能均的使用GO的方法识别的潜在的基因功能的三个最重要类别。我们筛选的三个类别的前10项GO（图GydF4y2Ba6(一)GydF4y2Ba)。我们还使用Fisher算法对预测各组差异表达miRNAs的靶基因进行细胞组成、生物学过程和分子功能富集分析，并使用topGO创建无环图(图)GydF4y2Ba6 (b)GydF4y2Ba- - - - - -GydF4y2Ba6 (d)GydF4y2Ba)。此无环图提供靶基因GO富集分析结果，包括GO节点和它们的靶基因的富集的分层关系的图形表示。miRNA的差异分析与靶基因富集分析相结合表明HSA-的miR-760和hsa-的miR-423-3p分别与相关联的GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba基因,分别。GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba参与伤口修复及血管化[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba，而上调hsa-miR-760可能促进的表达GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba从而加速伤口血管化和愈合。相比之下,GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba对血管生成有负面影响[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]，和hsa-的miR-423-3p的下调可以通过减少的表达促进伤口的血管形成GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

3.6。miRNA途径分析GydF4y2Ba

途径分析有助于识别涉及差异表达mirna的细胞途径。我们选择了20条最重要的信号通路(图)GydF4y2Ba7(一)GydF4y2Ba），其中磷脂酰肌醇-3-激酶的蛋白激酶B（PI3K-AKT）（图GydF4y2Ba7 (b)GydF4y2Ba)和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)GydF4y2Ba7 (c)GydF4y2Ba）显示在推动预制皮瓣的存活ADSC外型和HFF外型的最大区别。一些研究[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba,GydF4y2Ba33GydF4y2Ba已经报道PI3K-Akt和MAPK信号通路与伤口血管形成密切相关。因此，这些差异miRNAs可能通过激活PI3K-Akt和MAPK信号通路，增强内皮细胞的增殖和活性，并促进血管生成。GydF4y2Ba

3.7。ADSC外型调节miRNA和基因表达的影响HUVEC增殖GydF4y2Ba

我们埃杜试验评估ADSC外型和HFF外型对HUVEC增殖的影响。细胞增殖的速率（图GydF4y2Ba8(一个)GydF4y2Ba和GydF4y2Ba8 (b)GydF4y2Ba)明显高于HFF-Exo组(GydF4y2Ba )。GydF4y2Ba

我们还调查的影响GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2BaHUVECs与100共培养对血管形成的影响GydF4y2BaμGydF4y2BaG/ml ADSC-Exo or HFF-Exo for 72 h, extracting total RNA and protein, and detecting the expression levels of the above miRNAs. Expression levels of hsa-miR-423-3p andHDAC5GydF4y2Ba与HFF-Exo组相比，ADSC-Exo组显著降低，而hsa-miR-760和GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba分别的ADSC外型组显著更高（GydF4y2Ba )GydF4y2Ba（数据GydF4y2Ba8 (c)GydF4y2Ba- - - - - -GydF4y2Ba图8（e）GydF4y2Ba)。这些结果表明ADSC-Exo通过调节of的表达促进人工真皮预制皮瓣的新生血管形成GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

4。讨论GydF4y2Ba

预制皮瓣首先在20世纪70年代的动物模型成功地使用，并一直不断细化供临床使用。预制皮瓣扩张皮瓣供区的范围，并提供了更充足稳定的血液供应。然而，预制翼板具有有限的厚度，并且不耐磨，并且因此不适合于某些区域的修复诸如关节。人工真皮可以增加组织的厚度使得修补区域耐磨，但限制挛缩。新的预制涉及人工真皮和预制皮瓣的组合能改善血液灌注皮瓣，但他们的申请是由缺乏的因素，促进新生血管形成和血管生成的限制。最近的研究表明，miRNA和所含的蛋白质中充当细胞间信息传递的介质[外来体GydF4y2Ba34GydF4y2Ba,GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]。此外，许多研究表明，干细胞的外来体可通过促进血管伤口加速创面修复，没有干细胞诱导肿瘤发生的风险[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]。然而，ADSC-Exo在预制皮瓣中的促血管生成作用尚未见报道。因此，我们构建了人造真皮预制皮瓣，移植至大鼠模型创面，并注射ADSCs、HFFs、ADSC-Exo、HFF-Exo。观察并比较各组预制皮瓣的血管化情况。ADSC组和ADSC- exo组在人造真皮预制皮瓣的厚度和血管形成方面没有显著差异(GydF4y2Ba ）GydF4y2Ba而这两种显著比HFF和HFF外型组更好（执行GydF4y2Ba )。GydF4y2BaADSC-Exo可显著促进移植的人工真皮预制皮瓣的血管形成，提高存活率。GydF4y2Ba

之前的学习 [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba研究表明，人工真皮预制皮瓣在厚度和血液灌注方面优于传统的预制皮瓣，但由于缺乏新生血管和促血管生成因子，其应用受到限制。外泌体是细胞分泌到细胞外空间的因子/分子，在细胞间通讯中发挥作用。它们可以通过离心、过滤和离子交换色谱等多种方法从细胞培养基中提取[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]。外泌体的大小可以通过TEM和NTA进行鉴定，通常外泌体含量丰富的蛋白如CD63、CD81、TSG101和HSP70可以通过western blot进行鉴定[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]。许多最近的研究[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba- - - - - -GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]表明，骨髓间充质干细胞衍生的外来体（MSC外型）促进组织损伤的修复，从而导致伤口修复很大进展。MSC-外切还显示出诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管生成，并减少内皮细胞凋亡，表明损伤的修复和血管[重要作用GydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]。因此在本研究中，我们将ADSC-Exo应用于人造真皮预制皮瓣，以克服血管化不足的问题。与HFF-Exo相比，ADSC-Exo用于人造真皮预制皮瓣修复和血管化效果更好。但ADSC-Exo促进人造真皮预制皮瓣血管化的具体机制尚不清楚。GydF4y2Ba

上述结果表明，ADSC外型可以在预制皮瓣的血管中发挥重要作用。因此，我们采用NGS技术分析ADSC外型和HFF外型miRNA的频谱，并确定了九个上调和34个下调的miRNA（入选标准：GydF4y2Ba 和GydF4y2Ba )。GydF4y2Ba然后我们分析了差异靶向miRNA基因的GO富集和KEGG通路，确定hsa-miR-760和hsa-miR-423-3p为密切相关的靶基因GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba,分别。这两个基因还通过多种信号通路，如Smad和MAPK，在调控血管生成中发挥重要作用。纤维连接蛋白参与血管生成的调控，细胞外基质中的纤维连接蛋白通过活化内皮细胞诱导新生血管形成GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]。此外,GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba已被证明是密切相关的转化生长因子（TGF-β）GydF4y2BaβGydF4y2Ba总科信号。GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba能增加TGF-的活化吗GydF4y2BaβGydF4y2Ba-诱导Smad信号通路，促进新血管形成[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]。同时，新生血管的形成受到促血管生成因子成纤维细胞生长因子2和引导因子slip2的调控。GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba抑制内皮细胞血管生成基因表达，其可能通过降低FGF2和slip2的作用而阻碍血管形成[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]。因此，我们假设的上调HSA-MIR-760和HSA-MIR-423-3p在ADSC外型的下调可以通过促进预制皮瓣的血管GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba。我们随后共培养与ADSC外型或HFF - 外的HUVEC以确定它们对细胞增殖的作用，并检测到HSA-的miR-423-3p和hsa-的miR-760的相对的miRNA表达水平和基因表达水平GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba。这些结果证实了ADSC-Exo通过调节of的表达促进血管内皮细胞增殖的说法GydF4y2BaITGA5GydF4y2Ba和GydF4y2BaHDAC5GydF4y2Ba，从而增加人工真皮预制襟翼的新血管形成。根据KEGG分析结果中，该差动miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK途径，以及在粘着斑，Ras信号，和血管平滑肌收缩的途径，这是密切相关的细胞增殖和迁移。许多研究[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba,GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]已经表明，这些途径的激活可以显著促进血管新生，促进伤口修复。因此，我们建议ADSC外型由缺血环境受到影响，导致差的miRNA的丰富和活化上述途径，从而促进预制皮瓣的血管。在ADSC外型其他许多差异表达的miRNA与皮瓣的血管有关，还需要进一步研究探讨预制皮瓣的血管，这些外来体miRNA的机制。GydF4y2Ba

综上所述，外泌体miRNAs的应用可能为人工真皮预制皮瓣的应用提供一种新的支持策略。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

ADSCs:GydF4y2Ba	脂肪来源干细胞GydF4y2Ba
ADSC-Exo:GydF4y2Ba	脂肪干细胞外泌体GydF4y2Ba
bFGF的：GydF4y2Ba	碱性成纤维细胞生长因子GydF4y2Ba
厘米：GydF4y2Ba	文化传媒GydF4y2Ba
DMEM：GydF4y2Ba	杜尔贝克改良的鹰的介质GydF4y2Ba
的边后卫:GydF4y2Ba	胎牛血清GydF4y2Ba
走：GydF4y2Ba	基因本体论GydF4y2Ba
他:GydF4y2Ba	伊红GydF4y2Ba
高频电炉:GydF4y2Ba	人类包皮成纤维细胞GydF4y2Ba
HFF外型：GydF4y2Ba	人包皮成纤维细胞外泌体GydF4y2Ba
HGF:GydF4y2Ba	肝细胞生长因子GydF4y2Ba
HUVEC:GydF4y2Ba	人脐静脉内皮细胞GydF4y2Ba
IL：GydF4y2Ba	白介素GydF4y2Ba
KEGG：GydF4y2Ba	京都基因和基因组百科全书GydF4y2Ba
MAPK：GydF4y2Ba	增殖蛋白激酶GydF4y2Ba
MSC-出：GydF4y2Ba	间充质干细胞衍生的外来体GydF4y2Ba
门店:GydF4y2Ba	新一代测序GydF4y2Ba
NTA：GydF4y2Ba	纳米粒子跟踪分析GydF4y2Ba
PDGF:GydF4y2Ba	血小板衍生生长因子GydF4y2Ba
PI3K-Akt:GydF4y2Ba	Phosphatidylinositol-3-kinase-protein激酶BGydF4y2Ba
TEM：GydF4y2Ba	透射电子显微镜GydF4y2Ba
TGF -GydF4y2BaβGydF4y2Ba:GydF4y2Ba	转化生长因子GydF4y2BaβGydF4y2Ba
TPM：GydF4y2Ba	每百万成绩单GydF4y2Ba
VEGF:GydF4y2Ba	血管内皮生长因子。GydF4y2Ba

数据可用性GydF4y2Ba

用于支持本研究结果的下一代测序数据由王玉冲授权提供，因此不能免费提供。如欲查阅这些资料，请向[王玉冲，GydF4y2Badrwangyc@163.comGydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

利益冲突GydF4y2Ba

作者宣称不存在竞争利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

熊家超、刘志晓、吴敏良对这项工作同样有贡献。王玉冲、熊家超分析并撰写了手稿;刘志晓和吴敏良进行了实验;孙梦彦(音译)和夏宇(音译)分析了数据。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

这项工作是由卫生和计划生育临床研究项目的上海市政委员会（授权号20184Y0113）的支持。GydF4y2Ba

补充材料GydF4y2Ba

辅助材料是与靶基因预测结果的原始数据。GydF4y2Ba(GydF4y2Ba补充材料GydF4y2Ba)GydF4y2Ba

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