断断续续的甲状旁腺激素增强管理Odonto /成骨分化的干细胞通过物和P38 MAPK通路顶端乳头

文摘

客观的。甲状旁腺素被认为是在牙齿发育至关重要。干细胞从顶端的乳头(scap)负责牙本质的形成。然而,甲状旁腺素之间的交互和scap仍不清楚。本研究旨在调查的影响甲状旁腺素对scap odonto /成骨分化能力和阐明潜在的分子机制。材料和方法。这里,scap被隔离和标识在体外。甲状旁腺素对scap的增殖的影响测定细胞计数Kit-8 (CCK-8)、流式细胞术(FCM)和埃杜。碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色,进行免疫印迹,rt - pcr检测odonto /成骨分化PTH-treated scap以及MAPK信号通路的参与。结果。一个高山活动试验确定10⁸mol / L甲状旁腺素的最佳浓度是诱导scap没有重大影响的扩散scap CCK-8表示,FCM和埃杜。odonto /成骨的标记的表达在mRNA水平和蛋白质水平显著调节。此外,间歇性治疗甲状旁腺素也增加物和P38的磷酸化,抑制后,分化抑制物和P38 MAPK通路。结论。甲状旁腺素可以调节odonto /成骨分化scap通过物和P38 MAPK通路。

1。介绍

牙髓、矿化结缔组织形成修复性牙本质的内在能力当侮辱由于外伤或感染1,2]。临床上,干细胞的数量和牙髓组织再生的生物材料进行了验证。作为有前途的dental-derived间充质干细胞(msc),干细胞从顶端的乳头(scap)没有伦理争议,低免疫原性的优点。scap驻留在不完全发达的牙齿的牙根尖可以很容易地分离(3]。除此之外,它已经表明,scap可以分化成功能性odontoblast-like细胞植入小鼠的皮下空间支架材料(4]。此外,scap的角色在根的形成是在许多研究[5]。有趣的是,在活的有机体内研究表明,根发展时可以暂停从牙齿味蕾细胞被孤立的早期阶段(6]。综上所述,简单的可访问性和优越的特性建立了它们作为牙齿和骨骼组织工程的一个有吸引力的选择。

我们先前的研究已经表明,scap的odonto /成骨分化能力可以由多种因素引起,包括无机物质,生长因子和促炎细胞因子(7- - - - - -9]。然而,对scap是否也能应对荷尔蒙刺激odontoblast-like地在牙本质的形成。在这项研究中,甲状旁腺素的激素是我们的兴趣。由甲状旁腺腺分泌甲状旁腺素、内分泌因素扮演了一个关键角色骨骼和牙齿发育和分化的组织(10]。先前的研究表明,甲状旁腺素调节细胞外液和血液中钙和磷的浓度。血清钙水平的变化导致矿物形成的结构性变化(11]。有趣的是,甲状旁腺素能诱导骨形成和骨吸收剂量依赖性的方式12]。具体地说,异化的活动被分配到甲状旁腺素的不断注入,而不是增加成骨细胞的影响引起的间歇甲状旁腺素注射(13]。报告发现,甲状旁腺素活动主要驻留在猴氨基端片段(14]。甲状旁腺激素的合成重组人甲状旁腺素猴伴片段(PTH1-34)已被证明参与严重骨质疏松的治疗,因为它是唯一临床批准药物osteoanabolic属性(15]。其机制之一是成熟的成骨细胞凋亡的衰减。多项研究表明,20μ克PTH1-34每日加速愈合的远端径向断裂在绝经后妇女16]。

牙齿的形成是由一系列的信号分子,受体和转录控制系统(17]。增殖蛋白激酶(MAPKs)是一个重要的组件在许多生理过程,如细胞增殖、分化、炎症、转换和冷凝(18,19]。MAPK级联顺序是由三个激活激酶复合物,包括p38 MAPK、细胞外signal-regulated激酶(ERK)和c-Jun n端激酶(物)20.]。ERK和P38通路在调节软骨细胞增殖起着重要的作用[21]。一氧化氮平衡成骨细胞和脂肪细胞谱系分化物途径(22]。MAPK途径的影响在odonto /成骨分化在许多研究人员吸引了很多关注。兵,P38和物通路已经被证明参与牙周韧带odonto /成骨分化的干细胞(PDLSCs)与三氧化矿物聚合(MTA)[刺激时23]。同样,人们已经发现,骨缺损可以逆转通过ERK外生BMP2, P38和物途径(24]。因此,我们想知道MAPK通路是否参与scap当刺激甲状旁腺素的分化。

总的来说,本研究的目的是揭示人类scap甲状旁腺素的作用机制对增殖,分化和MAPK通路。通过理解分子的监管职责的甲状旁腺素scap的分化,进一步甲状旁腺素在牙齿和骨骼组织再生中的应用可能是可实现的。

2。材料和方法

2.1。scap的隔离和文化

顶端的乳头从影响获得的第三臼齿没有龋齿和牙周膜的疾病在口腔颌面外科部门江苏省口腔医院伦理委员会批准的口腔学院南京医科大学。顶端的乳头轻轻从表面孤立发展中根,用一只镊子,处理为1毫米³,然后消化中包含3毫克/毫升I型胶原酶(Gibco,生活技术)和4毫克/毫升胰蛋白酶(Gibco,生活技术)为1小时37°C。然后,孤立的细胞被孵化α最低基本介质(αmem、Gibco、生命技术)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco,生活技术),100 U /毫升青霉素和链霉素100克/毫升。细胞通过3天时间。亚文化进行时达到80%的融合。scap在3 - 5个段落收获了这项研究。

2.2。细胞识别

确定scap的起源,通过1 scap与磷酸盐溶液冲洗没有EDTA与胰蛋白酶(PBS)和收集。然后,细胞被孵化的抗体使用:CD29-APC, cd - 73 pe CD90-PE, CD105-Cy5.5, CD34-FITC,和CD45-PE(都来自BD生物科学,圣何塞、钙、美国),并分析了BD FACSCalibur (BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.3。制备PTH-Conditioned介质

无菌冻干粉(ApexBio A1129)重组人类PTH1-34 (rhPTH1-34)重组成溶液的浓度 使用αmem和存储在-20°C。解决方案是使用前稀释成不同的浓度。48小时周期是根据先前的研究25]。细胞首先治疗甲状旁腺素6小时,然后取而代之的是媒体没有甲状旁腺素其余42小时。未经处理的细胞培养中完成αmem担任控制。处理和未经处理的培养基是改变每48小时在整个实验周期。

2.4。碱性磷酸活动和染色

高山活动进行一个高山活动分析工具包(南京建成,中国)如前所述[26]。bicinchoninic酸(BCA)工具包(Beyotime、上海、中国)用于规范化总蛋白质含量。随后,rhPTH(猴)治疗scap在不同浓度在96孔板培养3000细胞/。细胞被固定在第三天,孵化BCIP /平衡的试剂(Beyotime、上海、中国)。高山染色后就执行制造商的协议。根据高山的水平,10⁸mol / L被选为最理想的诱导培养基浓度的后续实验。

2.5。细胞增殖实验

scap ( 细胞/)在96孔板培养一式三份不同浓度的甲状旁腺素。后来,CCK-8 (Dojindo,九州岛,日本)被添加到每个在天0,1,3,5,7,9,11。标仪(Titertek,芬兰赫尔辛基)是测量光密度的波长450 nm。

EdU公司化验,发现DNA合成,点击它™EdU成像设备(英杰公司)根据制造商的手册。总之,细胞被孵化的EdU和固定的4%多聚甲醛(PFA)。感应Triton x - 100后,细胞治疗1×阿波罗反应鸡尾酒。评估增殖细胞,DNA是沾染了200年μL 33342年赫斯特(5μg / mL) 30分钟使用荧光显微镜和可视化。

2.6。流式细胞术

控制细胞和细胞收集间歇性治疗甲状旁腺素为FACScan流式细胞仪检测细胞周期(BD生物科学,圣何塞,CA)根据制造商的手册。流式细胞术也被用于研究细胞的凋亡特征间歇性治疗甲状旁腺素的指令APC-Annexin V凋亡检测设备(BioLegend)。三个独立的实验。

2.7。茜素红染色

茜素红染色进行了如前所述[27]。简单地说,细胞培养与四个不同的媒体(PTH-conditioned介质完全培养基,毫米,毫米+ PTH-conditioned介质)2周。毫米,也称mineralization-inducing媒体,是补充10更易/ Lβ甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich), 50 mg / L抗坏血酸(Sigma-Aldrich)和10 nmol / L地塞米松(Sigma-Aldrich)。然后,细胞被固定在4% PFA 30分钟,然后沉浸在2%茜素红染料10分钟。拍照时形成的钙化结节,安装,和被光谱吸光度相差显微镜检查下570海里。

2.8。实时逆转录聚合酶链反应

细胞培养有或没有时间显示甲状旁腺素。总RNA通过使用试剂盒试剂(英杰公司公司(美国)。互补脱氧核糖核酸合成PrimeScript RT大师混合设备(豆类生物技术,中国)。定量PCR ABI 7300实时PCR系统上运行(美国先进的生物系统)使用SYBR绿色PCR大师混合试剂(豆类、日本)。表提供了使用的引物1。GAPDH作为质量控制标准化其他基因表达式。

2.9。免疫印迹

细胞使用或没有甲状旁腺素培养3天,7天,分别,然后收集。检测的表达MAPK pathway-related蛋白质,细胞被间歇性治疗0,30、60和90分钟。探讨MAPK通路的抑制剂的影响,scap是采用无血清培养24小时,然后诱导在10⁸mol / L甲状旁腺素或10⁸mol / L甲状旁腺素+ 10μM抑制剂(SP600125目标物和SB203580瞄准P38)。细胞裂解试剂(Beyotime中国)含有蛋白酶抑制剂phenylmethanesulfonyl (PMSF)溶解细胞。然后,等量的总蛋白提取分离解决5% - -12% sds - page凝胶和转移到聚乙二烯薄膜(PVDF)。被屏蔽后5%牛血清白蛋白(BSA)为2小时,孵化了膜主要抗体检测骨钙素(OCN, 1: 1000年,Abcam),骨桥蛋白(OPN, 1: 1000年,Abcam) osterix (OSX, 1: 1000年,Abcam) runt-related转录因子2 (RUNX2, 1: 1000年,Abcam)、I型胶原蛋白(COL-I, 1: 1000年,Abcam),象牙质sialophosphoprotein (DSPP, 1: 1000年,Bioworld), ERK(# 4695,细胞信号技术,美国),p-ERK(# 4370,细胞信号技术,美国)、物(# 9252,细胞信号技术,美国),p-JNK(# 9255,细胞信号技术,美国),P38(# 8690,细胞信号技术,美国),和p-P38(# 4511,细胞信号技术,美国)一夜之间在4°C。然后,膜与适当的二次孵化抗体1小时。涂抹乐队被检测到的ImageQuant拉斯维加斯4000系统(美国通用电气医疗集团)。

2.10。免疫荧光染色

免疫荧光分析(如前所述)(28]。简单,细胞被播种在无菌玻璃幻灯片12-well盘子和间歇性治疗甲状旁腺素。在预期的时间点,细胞被固定和permeabilized 0.5% Triton x - 100 10分钟。洗后,细胞被封锁和孵化主要抗体包括OCN(1: 100年,Abcam), OSX(1: 100年,Abcam)和RUNX2(1: 100年,Abcam)一夜之间在4°C。4、6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI 1: 1000年,英杰公司)进行染色,用共焦显微镜和图像检测(奥林巴斯、日本)。

2.11。统计分析

所有定量数据使用SPSS 21.0软件进行了分析。单向方差分析测试来确定执行组之间的差别。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。scap的表征和筛选最佳的甲状旁腺素浓度

SCAP形态主要是在典型的成纤维细胞在培养瓶或spindle-like安排,和细胞集落的细胞在径向扩张模式是观察(图1(一))。FCM的研究结果显示这些细胞阳性CD29, CD105, CD90和CD73而负CD34、CD45(图1 (b))。调查的影响甲状旁腺素的高山活动,scap治疗与不同浓度的PTH-conditioned媒体3天。与其他组相比,10⁸mol / L甲状旁腺素组提出了最高的高山活动(图1 (c), )。高山染色的图像在不同浓度组扫描显微镜(图1 (d))。

3.2。10⁸mol / L甲状旁腺素对scap的扩散没有影响

EdU保留试验显示正常的媒体和10之间没有显著差异⁸mol / L组(数字2(一个)和2 (b), )。同时,CCK-8分析也显示,10⁸mol / L甲状旁腺素组的细胞数量上几乎没有影响scap(图2 (c), )。通过流式细胞仪分析显示,对照组没有明显的区别和甲状旁腺素组(数据2 (d)- - - - - -2(我), )。根据以上数据,我们因此应用甲状旁腺素的浓度10⁸mol / L以下实验。

3.3。甲状旁腺素诱发scap的Odonto /成骨分化

底层odonto /成骨分化间歇性治疗甲状旁腺素对scap的影响研究用茜素红染色、免疫印迹、rt - pcr。茜素红染色,表明基质矿化,显示出更高的矿化反应的矿化诱导培养基比正常的媒介(图3(一个))。氯化十六烷吡啶(CPC)结果也表明了,成骨分化潜能强在甲状旁腺素组比对照组(图3 (b), )。此外,odonto / osteogenic-associated标记的表情被免疫印迹和rt - pcr分析。甲状旁腺素是抑制GAPDH表达治疗发生/ 3和7天。与对照组相比,甲状旁腺素的蛋白表达显著上调OCN, OPN, OSX, RUNX2, COL-I, DSPP每天3和7(数字3 (c)和3 (d))。一致,mRNA的表达OCN,OPN,OSX,RUNX2,COL-I,DSPP时间的方式也显著增加(图3 (e), )。

3.4。甲状旁腺素引起的激活物和scap P38 MAPK通路

调查PTH-induced分化是否通过MAPK通路介导,相对蛋白质包括物、P38和ERK测量用免疫印迹。甲状旁腺素诱导物的磷酸化在15分钟的治疗,随后下降(图4(一)和4 (b), )。激活P38的检测在15分钟,达到最大激活30分钟,然后在60分钟(数据减少4(一)和4 (c), )。然而,ERK回应消极间歇时间的方式管理甲状旁腺素,这意味着ERK不是激活(数字4(一)和4 (d), )。这些结果表明,间歇性甲状旁腺素治疗增加物和P38的磷酸化。

3.5。抑制物和P38 MAPK通路抑制Odonto /成骨分化PTH-Treated scap

进一步确认物和P38 MAPK途径调解odonto /成骨分化间歇甲状旁腺素对scap的影响,特定的抑制剂SB203580和SP600125。为期3天的文化之后,高山活动甲状旁腺素组显著增加。然而,高山活动增加减毒与SB203580或SP600125(数据并发处理5(一个)和5 (b))。免疫印迹和rt - pcr进行检测分化标记物的表达。mrna的表达增强,治疗甲状旁腺素而显著降低,与各自cotreated抑制剂(图5 (c))。上述结果进一步证实了免疫印迹和免疫荧光分析(数据5 (d)- - - - - -5 (h))。

4所示。讨论

据报道在牙根发育、各种生长因子牙本质的形成发挥着重要的生理作用。例如,igf - 1能增强牙髓干细胞的增殖和成骨分化(DPSCs)甚至伸长磨牙根(29日]。雌激素缺乏消极影响odonto /骨生成,这可能导致受损的矿化和减少牙齿再生(30.]。此外,甲状旁腺素,骨重建的主要中介,当管理断断续续的下巴的骨头,导致增强牙科植体骨整合(31日]。

PTH1-34是临床治疗方案通过美国食品和药物管理局(FDA)对骨质疏松症(32]。因为其骨形成能力的优势,它一定会被用在更广泛的领域。此外,牙本质和骨骼结缔组织相似,彼此相似的组成和开发机制(33]。因此,本研究的目的是调查的影响间歇治疗PTH1-34 scap odonto /成骨分化。

报告发现,断断续续的低剂量的甲状旁腺素增强骨而更高浓度的甲状旁腺素可能会减少骨形成(34]。高山被认为是早期细胞矿化的标志。高山活动增加价值在早期文化阶段表明,牙间充质细胞是高度分化(35]。根据我们的高山活动结果,10⁸mol / L是最佳的间歇scap诱发甲状旁腺素的浓度。此外,细胞增长率进行评估检测10的扩散效应⁸scap mol / L甲状旁腺素。我们的观察表明,间歇性管理甲状旁腺素没有影响的扩散scap CCK-8表示,埃杜和FCM。

确定odonto /成骨分化能力的甲状旁腺素,茜素红染色,rt - pcr和免疫印迹进行。钙结节生产矿化的一个标志,矿化结节形成的增加间接表明甲状旁腺素的关键作用scap的矿化和分化36]。rt - pcr和免疫印迹odonto /成骨诱导分化指标(OCN OPN, OSX, RUNX2 COL-I,和DSPP)后,甲状旁腺素治疗。OCN发现在成牙质细胞过程的长度时,总是出现在搪瓷达到成熟年龄(37]。OPN,单链多肽,是高度集中在矿物表面38]。OSX, zinc-finger-containing转录因子,在牙间充质细胞表达。多个研究发现,皮质骨形成是废除和成骨细胞标记基因减少OSX-null老鼠(39]。RUNX2充当OSX的上游基因。RUNX2直接调节多个成牙质细胞基因的表达(40]。COL-I广泛分布于骨、软骨和牙本质(41]。DSPP,主要odontoblastic细胞标记,在牙质生成中起着至关重要的作用,形成牙本质细胞外基质(42]。重要的矿化标志表示upregulation odonto /成骨的归纳影响scap的甲状旁腺素。

多个信号通路参与scap的分化过程,包括MAPK。MAPK通路转导细胞外刺激成核和控制基因表达促进分化。据报道,P38是激活骨形成蛋白2 (BMP2)在第三期成牙质细胞刺激43]。另一项研究表明,抑制引起人们尤其是脂多糖(LPS)——诱导牙本质矩阵标记(44]。此外,物的子类MAPKs可能升高基底对细胞因子的反应。最近的研究表明,物发挥作用在DPSCs hydroxide-induced钙矿化(45]。生化研究证实物可能会触发民进党表达式的激活AP-1复杂(46]。ERK活化的作用似乎是有争议的。工作从几个实验室显示ERK激活是必不可少的骨而其他报道发现,ERK激活抑制成骨细胞功能的调节47,48]。p-ERK bmsc的差别研究表明,对这些基因可以诱导骨生成当接受BMP2和甲状旁腺素(49]。我们的数据表明,p-ERK被间歇性甲状旁腺素表达下调政府,这是符合这一假说,ERK脱磷酸作用诱导骨形成。最后,这项研究表明,间歇性的存在甲状旁腺素诱导P38的磷酸化和物而P38和物的抑制减弱PTH-induced磷酸化和MAPK的核易位。综上所述,上述结果表明,甲状旁腺素诱导物和P38 MAPK通路的激活scap。

由于SCAP矿化伴随间歇性刺激甲状旁腺素,我们假设甲状旁腺素可能参与SCAP分化。总之,我们的研究结果说明甲状旁腺素的作用的成矿scap通过MAPK通路,提供一个有吸引力的方式促进牙齿和骨骼组织再生研究通过调节细胞的生物学行为。然而,我们只进行了在体外在这项研究中测试。进一步的研究在动物模型和临床牙髓学的治疗需要澄清的甲状旁腺素在再生医学中的作用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。读者可以通过电子邮件联系教授Yu获得数据。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Xiyao彭日成,李应壮族,Zehan贡献同样这个手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81873707),江苏省医学人才项目(ZDRCA2016086),优先级的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD, 2018 - 87),聪明的SuYan研究与发展基金卫生科技创新(NMU-SY201804)和江苏省的科技开发项目(BE2017731)。

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