高葡萄糖加剧TNF -α全身的增殖抑制人类牙周韧带干细胞通过Upregulation和肿瘤坏死因子受体1的激活

文摘

客观的。本研究旨在调查高葡萄糖如何影响牙周韧带干细胞的增殖和凋亡(PDLSCs) TNF -的存在α。方法。PDLSCs获得牙周健康的恒牙治疗要么high-glucose条件下(30更易/ L, G30组)或正常葡萄糖条件(5.6更易/ L, G5.6组)在肿瘤坏死因子的存在与否α(10 ng / ml) 2到6天。细胞增殖和细胞周期被CCK-8评估,EdU公司分析,流式细胞术。细胞凋亡被膜联蛋白V / PI染色评估。蛋白表达被免疫印迹检测。细胞ROS表达式被CellROX标签和流式细胞术评估。特定的抗体针对TNFR1和TNFR2被用来阻止TNF -α信号。维生素C也用于验证如果ROS的阻塞可以拯救PDLSCs高葡萄糖和TNF -的存在α。结果。CCK-8试验表明,高葡萄糖加剧了TNF -α全身的细胞生存能力抑制(57.0%、85.2%、和100% G30 + TNF -α组,G5.6 + TNF -α组和对照组,分别在6天。高葡萄糖增加蛋白质的表达与对照组相比TNFR1 2(1.24倍),一天6天(1.26倍)。阻塞TNFR1完全逆转G30 + TNF -的增殖抑制α组。添加维生素C或TNFR1抗体完全逆转细胞内ROS表达式的海拔高葡萄糖和TNF -所致α。维生素C部分恢复细胞增殖的高葡萄糖和TNF -α。结论。高葡萄糖加剧TNF -α全身的增殖抑制人类牙周韧带干细胞通过upregulation和激活TNF受体1。抑制细胞内ROS表达式的维生素C部分救助PDLSCs细胞增殖。

1。介绍

牙周炎是由细菌感染引起,加剧了宿主的免疫反应,可能导致附件损失,骨吸收,最终失去的牙齿。幸运的是,牙周韧带干细胞(PDLSCs)显示一些承诺作为牙周组织再生的种子(1]。PDLSCs是一群间充质干细胞的表型(表达基质细胞表面标记,包括CD146 Stro-1, CD105, CD90、和CD73)和multilineage分化潜能2]。在我们之前的研究3),cd146从人类牙周韧带细胞被发现表达MSC表面标记(CD105, CD90、CD73、CD44和Stro-1)增殖和成骨的潜力并显示高于CD146-negative细胞。此外,PDLSCs也能够再生牙周组织,包括牙周韧带、牙槽骨、牙骨质,和周围神经和血管在动物模型(4]。临床病例报告5)还表明,自体牙周韧带祖细胞移植在过去3牙周炎患者达到明显的牙槽骨再生以及附件获得没有副作用,表明PDLSC再生牙周组织移植是一种很有前途的方法。

肿瘤坏死因子-α最重要的炎症因素之一,在牙周炎的进步6),主要由激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞。据报道,有一个积极的TNF -的浓度之间的相关性α观察牙龈沟液内细胞激素的和牙周炎症状态(7]。肿瘤坏死因子-α调节细胞增殖、分化和凋亡通过绑定到其膜结合受体(8]。TNFR1, 55 kDa膜蛋白含有死域在其细胞内的地区,是表示在几乎所有的细胞类型。TNFR1参与调控细胞增殖、凋亡和分化通过激活NF -κB AP-1或caspase-8。相比之下,TNFR2没有死域在其细胞内的地区和表达的几种类型的细胞,包括星形胶质细胞、细胞、胸腺细胞,内皮细胞,和人类间充质干细胞。尽管缺乏死域,TNFR2也通过激活调节细胞增殖和分化的NF -κB和AP-1。此外,TNF - TNFR2调节的组合α和TNFR1,可能通过增加当地TNF -的浓度α在细胞表面通过快速配体传递机制(9]。在我们之前的研究3),cd146 PDLSCs TNF -更敏感α治疗的增殖抑制与CD146-negative相比牙周纤维母细胞。我们还发现,蛋白质的表达TNFR1和TNFR2 cd146 PDLSCs高出2倍比CD146-negative牙周韧带细胞。然而,哪种类型的肿瘤坏死因子受体主要负责肿瘤坏死因子的影响α在PDLSCs仍不清楚。

完善,糖尿病增加了风险和牙周炎的严重程度,尤其是在贫困患者的代谢控制(10]。事实上,牙周炎是第六糖尿病的并发症。糖尿病高血糖,最典型的症状,不利影响细胞增殖,分化,甚至导致细胞死亡,导致牙周愈合延迟。据报道,高葡萄糖抑制增殖和细胞凋亡caspase-3-dependent牙周韧带成纤维细胞(11]。高葡萄糖也阻碍了增殖和成骨分化的PDLSCs通过增加细胞内ROS水平(12]。

据报道,TNF -的平均水平α观察牙龈沟液内细胞激素的牙周炎患者(GCF)增加9.5 ng / ml [13]。此外,糖尿病状态上调单核细胞的肿瘤坏死因子-α牙周炎患者的分泌物(增加4.6倍)(革兰氏阴性细菌的存在挑战14]。在ligature-induced牙周炎动物研究中,TNF的表达α在牙周组织中也是高Goto-Kakizaki老鼠(2型糖尿病模型)比normoglycemic Wistar鼠(15]。这些数据表明,糖尿病条件可能加剧的不利影响TNF -α在牙周组织。高血糖和高浓度的TNF -α是两个常见的糖尿病牙周炎患者的病理条件,但它们如何影响PDLSCs仍未知。因此,本研究的目的是研究葡萄糖和TNF -多高α影响细胞增殖和细胞凋亡在人类PDLSCs和澄清可能的机制参与这个过程。为此,人类牙周韧带干细胞与肿瘤坏死因子-孵化αhigh-glucose条件下,细胞增殖和细胞凋亡检测。两种类型的肿瘤坏死因子受体的功能也被调查。细胞内ROS表达式检查,维生素C也是评估的保护作用。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

牙周韧带细胞的主要文化(液晶)如我们之前所述执行研究[3]。简单地说,前磨牙或第三臼齿收集从二十岁健康的人从12到24岁矫正原因在口腔医院,中山大学。牙周韧带组织被轻轻分开根表面的中间部分。牙周韧带组织被切成小块(1毫米³),其次是消化2毫克/毫升1型胶原酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)为30分钟37°C。在经过70年μm过滤器,收集细胞和悬浮在α美国Gibco /热费希尔mem(12571071)含有10% ( )的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(美国从Gibco)。5%的所有细胞都在湿润的气氛中孵化有限公司₂和95%的空气在37°C。培养基是改变每三天。这些细胞被亚文化当他们到达70%融合使用0.25% ( )胰蛋白酶和0.02% ( )EDTA(胰蛋白酶/ EDTA;美国Gibco)。

2.2。人类牙周韧带干细胞的分离和鉴定

人类牙周韧带干细胞分离使用人类CD146 microbead工具包LS列和MidiMACS分离器(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)根据产品说明书。总之,通过液晶( ⁷细胞)准备为单细胞悬浮体使用胰蛋白酶/ EDTA缓冲和resuspended 60μl D-PBS缓冲区包含0.5%的牛血清白蛋白和2毫米EDTA。20μl(货代阻塞试剂和20μl CD146微的补充道。混合培养在4 - 8°C,持续15分钟。然后,这些细胞被洗1毫升D-PBS缓冲区,离心机在300 g×10分钟,在500毫升resuspended D-PBS缓冲区。磁选是由应用细胞悬浊液LS列,这是放置在磁场MidiMACS分离器。列与缓冲冲三次,这样标记细胞被冲走了。CD146标记细胞收集通过删除列的磁场和冲洗列5毫升D-PBS缓冲区。cd146细胞离心300 g×10分钟和resuspended培养基。

间充质干细胞表面标记,细胞进行分析后,从第二段CD146 +液晶磁珠隔离进行了分析使用人类的MSC分析工具包(BD树干茎流、BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)CD105, CD90、CD73, CD44, CD34, CD11b, CD19、CD45、HLA-DR根据产品手册。简要CD146 +液晶是悬浮在缓冲溶液 ⁶密度/毫升。FITC-mouse反CD105抗体(PE-mouse反CD44, FITC-mouse反CD90、APC-mouse反CD73, hMSC积极/消极的同形像控制鸡尾酒,或者hMSC积极/消极的鸡尾酒)被添加到100年μl细胞样本,分别。样品在4°C的环境为在黑暗中30分钟和分析流式细胞分析仪(美国BD生物科学FACSCalibur)。

克隆形成试验,第一段CD146 +液晶被播种(每盘150个细胞)在10 cm-diameter文化菜(美国纽约康宁)。14天的文化后,细胞被固定在4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),沾0.1%甲苯胺蓝(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)为5分钟。殖民地的数量每道菜确定视觉光学显微镜下(Axiovert 40,卡尔蔡司,德国)。殖民地含有超过50个细胞被认为是一个殖民地。

2.3。Stro-1的免疫组织化学染色、细胞角蛋白和波形蛋白对于CD146 +液晶

CD146 +液晶培养14天,4%多聚甲醛固定,阻止了山羊血清(美国Bosterbio)为10%。老鼠的细胞被孵化反Stro-1抗体(1:100),鼠标anti-cytokeratin抗体(1:200),或鼠标anti-Vimentin抗体(克隆V9, 1: 200)(所有从生命表达载体技术,卡尔斯巴德、钙、美国)为2 h 37°C。样本然后孵化兔子anti-mouse免疫球蛋白(免疫球蛋白g H + L, Miaotong生物学、中国)1 H在37°C和沾3,3 - - - - - -diaminobenzidine (DAB) 3分钟和苏木精为1分钟。样本在显微镜下观察(Axio范围、蔡司、德国)。

2.4。成骨、脂肪形成的分化CD146 +液晶

CD146 +液晶被播种在6-well菜( ⁴每)和细胞培养2天。然后,细胞与成骨的培养基培养(包含10%的边后卫,0.1μM地塞米松、0.2毫米抗坏血酸和10毫米β甘油磷酸酯;所有从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)或脂肪形成的媒介(10%的边后卫,1μ地塞米松,200μM吲哚美辛,0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine;所有从Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)21天或14天,分别。成骨的和脂肪形成的媒介改变了每3天。细胞被固定在4%多聚甲醛和沾1%茜素红骨生成试验或3毫克/毫升油红O脂肪生成分析(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。照片是使用倒置显微镜捕捉到一个(德国蔡司、从、德国)。

2.5。High-Glucose和肿瘤坏死因子-α治疗

牙周韧带干细胞培养在不同条件下如下:(1)对照组(G5.6组):细胞培养在一个中等包含5.6毫米葡萄糖(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)(2)肿瘤坏死因子-α治疗组(G5.6 + TNF -α集团):细胞培养介质含有葡萄糖和TNF - 5.6毫米α(10 ng / ml, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);(3)High-glucose治疗组(G30组):细胞培养介质包含30毫米葡萄糖(4)High-glucose和肿瘤坏死因子-α治疗组(G30 + TNF -α集团):细胞培养介质含有葡萄糖和TNF - 30毫米α(10 ng / ml)

渗透的效果也进行了添加甘露醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞培养中含有葡萄糖5.6毫米和24.4毫米甘露醇。

2.6。肿瘤坏死因子受体堵塞和维生素C治疗

TNFR1或TNFR2堵塞实验,小鼠反TNFR1单克隆抗体(10μg / ml, MAB625、研发系统,明尼阿波利斯,美国MN)或鼠标反TNFR2单克隆抗体(10μg / ml, MAB726、研发系统,明尼阿波利斯,美国MN)被添加到中等high-glucose和TNF -前1小时α治疗。鼠标IgG1抗体作为同形像控制(10μg / ml, MAB002、研发系统,明尼阿波利斯,美国MN)。一小时后,介质取代了介质包含D-gl ucose(30毫米)和肿瘤坏死因子-α(10 ng / ml)。然后,另一个刚做好的抗体是同时添加到媒介的最终浓度10μ克/毫升。每3天中改变了遵循同样的协议。

关于维生素C治疗,抗坏血酸(200μM, A4544, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到媒体免费抗坏血酸(美国Gibco /热费希尔A1049001)前1小时high-glucose和TNF -α治疗。一小时后,介质中含有葡萄糖所取代(30毫米)和肿瘤坏死因子-α(10 ng / ml)。同时,另一个刚做好的维生素C的解决方案是添加到媒体在200年最终浓度μm .媒介改变了每3天遵循同样的协议。

2.7。细胞生存能力分析和PDLSCs生长曲线

细胞生存能力评估CCK-8工具包(Dojindo、日本)。PDLSCs被播种在96孔板( ³细胞每口井)和培养6天在不同条件下按计划进行。每24小时细胞生存能力测试: 。增长曲线是由SPSS软件版本22.0(美国、IBM、纽约Armonk)使用 模型。

2.8。西方墨点法

短暂,总蛋白质从细胞中提取使用里帕裂解缓冲(Triton x - 100年1%,150毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4)和蛋白酶抑制剂混合,(从Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)和超声波细胞粉碎机(美国布兰森仪器有限公司,丹伯里,CT)。蛋白质浓度测定BCA化验(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)。平等的蛋白质样品(30 - 40μg) 10% sds - page凝胶分离(Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)并转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔)。膜是孵化主要抗体:兔子反TNFR1(1: 1000),兔子反TNFR2 (1: 000;从Epitomics Abcam,伯林盖姆、钙、美国),和鼠标反β肌动蛋白(武汉博士德1:1000年,中国)。二次抗体是山羊anti-mouse IgG-HRP(1: 1000)和山羊anti-rabbit IgG-HRP (1: 1000;博士德,武汉,中国)。图像是通过化学发光使用ECL-Western污点工具包(连续波生物技术,北京)和分析使用ImageJ软件(美国1.44便士)。

2.9。细胞周期分析

PDLSCs镀在25厘米²瓶( ⁴细胞/瓶,康宁,美国纽约)和培养24小时。然后,细胞在不同条件下孵化计划4天。细胞收获和固定在70%乙醇4°Cfor 24 h。细胞被洗两次与冰冷的磷酸缓冲盐(PBS, Gibco,美国)和孵化与核糖核酸酶和propidium碘(F10797,热费舍尔,沃尔瑟姆,妈,美国)30分钟,然后细胞周期的分析是由一个流式细胞分析仪(美国BD生物科学FACSCalibur)。相对S期分数(%)计算从分裂的S期分数测试组的对照组。

细胞增殖是5-ethynyl-2发现的 - - - - - -脱氧尿苷(EdU)结合试验后产品指令(C10632,热费舍尔,沃尔瑟姆,妈,美国)。总之,PDLSCs镀在25厘米²瓶( ⁴细胞/瓶,康宁,美国纽约)和培养24小时。然后,细胞在不同条件下孵化计划3天。EdU试剂添加到培养基的最终浓度10μm . 24小时后,细胞被收获,固定,permeabilized管。细胞培养与点击它™+反应鸡尾酒在黑暗中在室温下30分钟。细胞被洗一次3毫升的清洗试剂和分析流式细胞分析仪(美国BD生物科学FACSCalibur)。

2.10。细胞内活性氧的检测

PDLSCs镀在25厘米²瓶( ⁴细胞/瓶,康宁,美国纽约)和培养24小时。然后,细胞在不同条件下孵化按计划6天。细胞收获和resuspended 1毫升培养基含有cellROX试剂(最终浓度0.02%,热费希尔,沃尔瑟姆,妈,美国)。细胞培养在37°C 60分钟,然后发现了细胞内ROS表达式流式细胞分析仪(美国BD生物科学FACSCalibur)。相对细胞内ROS水平计算从分裂的ROS水平测试组的对照组。

2.11。检测细胞凋亡

使用TUNEL细胞凋亡在第二天被发现(TdT-mediated dUTP缺口末端标记)试验设备(罗氏,曼海姆,德国)。总之,PDLSCs镀在48-well板( ⁴细胞每)和培养24小时。然后,细胞在不同条件下孵化计划2天。细胞被固定在4%多聚甲醛1小时,孵化3% H₂O₂10分钟,permeabilized试剂中含有0.1%柠檬酸三钠和0.1% Triton x - 100对冰2分钟。然后,细胞被标记和fluorescein-dUTP peroxidase-labeled anti-fluorescein抗体。TUNEL反应与diaminobenzidine可视化(DAB)。黑暗的民建联积累在细胞(核和凋亡机构)判断表明TUNEL阳性反应。细胞核的细胞与500 ng / ml DAPI染色(罗氏,曼海姆,德国)。对于每个好,至少10个随机显微镜领域(100 x)使用一个倒置荧光显微镜检查(从蔡司德国,德国)和分析使用Image-Pro +软件。

细胞凋亡检测到6天使用Annexin-V /π工具包(美国马热费希尔,沃尔瑟姆)。PDLSCs镀在25厘米²瓶( ⁴细胞/瓶,康宁,美国纽约)和培养24小时。然后,细胞在不同条件下孵化按计划6天。细胞被胰蛋白酶收获(EDTA免费)和PBS洗两次。然后,细胞被孵化Annexin-V和π在绑定缓冲试剂在黑暗中15分钟。细胞凋亡是由一个流式细胞分析仪分析(美国BD生物科学FACSCalibur)。

2.12。统计分析

所有实验均重复3次使用牙周韧带干细胞来自3个不同的个体。总共有20个健康个体纳入本研究。数据分析使用SPSS软件版本22.0(美国、IBM、纽约Armonk)。数据被表示为 和分析使用单向方差分析LSD事后紧随其后 - - - - - -测试。值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。隔离和标识cd146牙周韧带干细胞(PDLSCs)

7 - 14天之后,原始的牙周韧带细胞(液晶)连接,开始增殖。CD146 (CD146 +)液晶隔绝通过液晶使用immunomagnetic珠子。第二段CD146 +液晶MSC)阳性标记,包括CD105(92.16%)(图。S1a),CD73(99.11%)和CD90(98.76%)(图。印地)。此外,CD146 +液晶造血CD34标记为阴性,CD11b, CD19 CD45和HLA-DR(无花果。就是S1c)。

首次通过CD146 +液晶形式殖民地(无花果。S2a)经过14天的文化低细胞密度(每盘150细胞)。在显微镜下,细胞被发现是小,纺锤形,排列在集群。此外,CD146 +液晶被发现波形蛋白阳性和阴性细胞角蛋白(无花果。开通(左)和中等)与基质细胞的属性是相一致的。关于Stro-1(无花果。开通右),另一种间充质干细胞标记,一些细胞表达Stro-1(细胞质染色棕色),而其他细胞为阴性Stro-1(透明细胞)。后成骨的或脂肪形成的感应CD146 +液晶形成钙结节(图中被发现。S2c,(图左)和更多的脂质滴。S2c比CD146液晶,右)。

总之,cd146液晶能够形成殖民地在低细胞密度,进行骨生成和脂肪生成,表达MSC表面标记CD90、CD105, CD73,和Stro-1但不是造血标记,表明cd146细胞从人类牙周韧带组织是一个族群的间充质干细胞。CD146牙周韧带细胞(CD146 +液晶)被认为是牙周韧带干细胞(PDLSCs)在目前的研究。

3.2。高葡萄糖加剧了TNF -α全身的细胞生存能力在PDLSCs抑制

每24小时CCK-8进行化验。细胞形态学6天被记录。经过6天的文化,PDLSCs对照组达到融合(图1(一)G5.6)。high-glucose组的细胞密度(G30)与对照组相比降低(图1(一)G30),但是差异没有统计学意义(图1 (c))。然而,肿瘤坏死因子-α治疗抑制PDLSC细胞生存能力(85.2%, )与对照组相比(图1 (c))。细胞肿瘤坏死因子之间有更多的空间α组(图1(一),G5.6 + TNF -α比对照组)。有趣的是,高葡萄糖加剧了肿瘤坏死因子的抑制作用α。细胞密度high-glucose和TNF -进一步下降α治疗组(G30 + TNF -α)与肿瘤坏死因子-α组(G5.6 + TNF -α在图1(一))。CCK-8化验也表现出类似的结果(图1 (c))。估计生长曲线(图1 (b))清楚地表明G30 + TNF -α治疗(图1 (b)红星)严重延迟PDLSCs的扩散与两对照组相比(图1 (b),蓝色圆圈)和G5.6 + TNF -α组(图1 (b)绿色广场)。高的渗透影响葡萄糖被添加甘露醇评估。结果(图。S3)表明,没有加剧TNF -甘露醇治疗α全身的细胞增殖抑制6天,说明造成的不利影响是高水平的葡萄糖,而不是渗透压的变化。

3.3。高葡萄糖在PDLSCs TNFR1蛋白表达升高

因为高葡萄糖加强抑制TNF -的影响α在PDLSCs细胞生存能力,我们推测高葡萄糖可能增加肿瘤坏死因子受体的表达。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (c)、高葡萄糖(30毫米)蛋白表达升高在2天PDLSCs TNFR1(对照组的1.24倍, )和6天(1.26倍, )。TNFR2也是评估的蛋白表达(数字2 (d)- - - - - -2 (f)),结果表明,TNFR2表达式持平后接触high-glucose条件2到6天。

3.4。高葡萄糖和TNF -α抑制细胞的生存能力,使细胞周期阻滞通过激活TNFR1

为了研究哪种类型的肿瘤坏死因子受体负责high-glucose和肿瘤坏死因子α全身的细胞生存能力抑制特定抗体针对TNFR1或TNFR2被应用到培养基前1小时TNF -α治疗。

的堵塞TNFR1 TNFR2完全逆转high-glucose——和TNF -α全身的细胞生存能力抑制(97.8%的对照组, )。G30 + TNF -细胞密度α+ anti-TNFR1 + anti-TNFR2组恢复到对照组水平(数字3(一个)和3 (b))。有趣的是,堵塞TNFR1独自戏剧性地逆转high-glucose和肿瘤坏死因子α全身的细胞生存能力抑制(90.6%的对照组, ),即使它是低于对照组,但没有统计学意义。G30 + TNF -细胞密度α+ anti-TNFR1集团也恢复到对照组水平(数字3(一个)和3 (b))。然而,堵塞TNFR2确实会带来一些经济复苏的细胞密度和细胞生存能力high-glucose和TNF -α条件,但差异无统计学意义( )(数据3(一个)和3 (b))。

通过流式细胞术中也检测到细胞周期4天。如图3 (c)独自,高葡萄糖不引起细胞周期阻滞,而TNF -α治疗降低了相对S期分数(79.5%的对照组, )。类似于CCK-8化验的结果,相对G30 + TNF - S期分数α组进一步下降(66.0%的对照组, )相比G5.6 + TNF -α组。与CCK-8化验的结果一致,堵塞TNFR1可以完全恢复相对S期分数高葡萄糖和TNF -的存在α(105%的对照组, )。

细胞周期蛋白依赖性激酶4(到)的蛋白表达也评价了西方墨点法在6天。如图S7肿瘤坏死因子-α治疗降低到表达式(39%的对照组, ),和的表达到G30 + TNF -α组进一步下降而G5.6 + TNF -α组(对照组的26%, )。

为了确认是否细胞生存能力的下降是由于增殖抑制细胞凋亡,这是很常见的现象引起的肿瘤坏死因子-α治疗,细胞凋亡被TUNEL /评估DAPI染色(图4(一))和膜联蛋白V / PI染色(图4 (b))。结果表明,尽管凋亡率高于G30 + TNF -α组与对照组(8.1%比3.5%, ),凋亡细胞的增加相对较少(4.6%)。相反,相对的变化在G30 + TNF - S期分数α组(66.0%的对照组,图3 (c)),所以做了改变G30 + TNF -细胞的生存能力α组(对照组的62.5%,图5 (b))。这些结果表明,细胞生存能力和细胞密度的减少主要是由于细胞增殖的抑制作用,而不是细胞凋亡。

3.5。添加维生素C或TNFR1抗体完全逆转海拔引起的细胞内ROS表达高葡萄糖和TNF -α

据报道,高葡萄糖和TNF -α在许多细胞类型可以移植细胞内ROS表达式。因此,细胞内ROS水平调查使用CellROX摄政和流式细胞术在6天。正如所料,TNF -α治疗增加活性氧表达(1.37倍, ),和高葡萄糖进一步促进了细胞内ROS的海拔TNF -的存在α(1.69倍, )(数据5(一个)和5 (b))。抗氧化剂维生素C (200μ米)被发现能够扭转ROS的高度表达引起的高葡萄糖和TNF -α(对照组的1.02倍, )(数据5 (c)和5 (d))。同样,堵塞TNFR1也阻止活性氧G30 + TNF -高程α组(对照组的1.00倍, )(数据5 (c)和5 (d)),这表明ROS TNFR1表达是由激活。

3.6。维生素C部分恢复细胞增殖的高葡萄糖和TNF -α

EdU公司试验进行验证是否堵塞引起的活性氧可以反向增殖抑制高葡萄糖和TNF -α。图6G30 + TNF -显示增殖细胞α组(49.0%, )严重降低与对照组相比(100.0%)和G5.6 + TNF -α组(67.0%)(图6)。然而,添加维生素C部分恢复细胞增殖(64.6%)的高葡萄糖和TNF -α。TNFR1堵塞的特定抗体的抑制作用可能完全扭转高葡萄糖和TNF -α细胞增殖方面的治疗(113.7%)。

也发现类似的结果在CCK-8试验和细胞周期检测。细胞密度显著恢复在维生素C治疗组的高葡萄糖和TNF -α(图7(一))。同样,细胞生存能力揭示了CCK-8化验的维生素C治疗组也在很大程度上恢复(83.5%的对照组,图7 (b))。正如所料,维生素C治疗也恢复相对S期分数从66.0%到89.0%的高葡萄糖和TNF -α(数据7 (c)和7 (d))。

为了确认是否有益的维生素C对细胞活力的影响是由于减轻细胞凋亡,膜联蛋白V / PI染色试验。结果表明(图8)high-glucose引起的细胞凋亡和肿瘤坏死因子-α治疗没有改变的维生素C,支持细胞生存能力的降低主要是由于增殖的抑制而不是high-glucose引起的细胞凋亡和肿瘤坏死因子-α治疗。

4所示。讨论

干细胞在牙周组织中被认为是一群异质细胞。到目前为止,没有单一的生物标志物干细胞的分离和鉴定牙周韧带(16]。据报道,STRO-1、SSEA-4 CD271, CD146用作牙周韧带细胞的浓缩指标(17],具有自我更新和多分化潜能的能力。陈和他的同事们的研究(18]显示本地化的假定的msc在健康的人的牙齿和牙周炎影响牙齿附近的血管。此外,现在相信msc还来自周(17)附近的一个细胞群,局部血管和血管营养和稳定负责。对具有矿化活动(19],以及multipotency [20.),分享一些相似之处与PDLSCs包括喜欢的《忍者外传2》的表达,CD146 CD140b,参与维护血液vessel-like结构(21]。因此,在目前的研究中,CD146被用作生物标记的识别有效的牙周韧带的祖细胞。此外,这是不可避免的,干细胞失去分化潜能和自我更新能力在体外条件下(22),无论哪一种生物标记用于净化。在目前的研究中,cd146通道内液晶5使用以体外培养条件的不利影响最小化。

牙周伤口愈合受损是糖尿病牙周炎患者的常见症状。据报道,秋田老鼠的血糖水平(1型糖尿病动物模型)达到600 mg / dl(33.3毫米)3周时(23]。葡萄糖在30 mM用作high-glucose条件在体外研究[24,25]。据报道,高葡萄糖会损害细胞生存通过抑制增殖和诱导细胞凋亡。细胞生存能力牙周韧带成纤维细胞的抑制(87.1%的对照组, )high-glucose条件下(25毫米)7天(26]。另外,牙周韧带细胞凋亡率也是调节从3%到5%在25毫米细胞孵化high-glucose媒介(24小时11]。然而,在目前的研究中,细胞增殖的PDLSCs持平high-glucose条件下为6天(30毫米),所以是细胞凋亡。这些结果表明,PDLSCs耐高葡萄糖比牙周纤维母细胞。

根据临床研究之间存在着正相关的严重性牙周炎症和肿瘤坏死因子的水平α观察牙龈沟液内细胞激素在(GCF)。肿瘤坏死因子-的浓度αGCF牙周健康的个体是2.73 ng / ml [13],它增加到9.5 ng / ml实验性牙龈炎患者(27)和慢性牙周炎患者(28]。与高葡萄糖、增殖和凋亡的影响PDLSCs TNF -α治疗剂量依赖性的方式。在我们之前的研究3],cd146 PDLSCs治疗与肿瘤坏死因子-α在不同浓度48小时。肿瘤坏死因子-α2.5 ng / ml和5 ng / ml被发现促进细胞增殖,但TNF -α10 ng / ml PDLSCs显示凋亡效应,表明严重炎症条件PDLSCs是有害的。正如所料,在目前的研究中,PDLSCs孵化与TNF -α10 ng / ml 6天显示更低的细胞生存能力和更高的细胞凋亡率与对照组相比。然而,细胞凋亡率G30 + TNF -α组只有4%高于对照组,表明细胞生存能力的下降主要是由增殖抑制作用造成的。

在这项研究中,TNF -的有害影响α明显放大的高葡萄糖即使高葡萄糖PDLSCs本身没有伤害。埃斯波西托和他的同事透露,TNF -α浓度是敏锐地增加了高血糖在人类受试者通过氧化机制(29日),和过度TNF -α糖尿病并发症密切相关,通过诱导内皮细胞凋亡high-glucose条件下(30.]。因为肿瘤坏死因子的影响α是基于它的浓度,我们推测是否高葡萄糖抑制肿瘤坏死因子的影响,恶化呢α通过增加它的表达式。在文化high-glucose介质(30毫米)有或没有TNF -α治疗2天,TNF -水平α在细胞上清液和细胞溶解产物是通过酶联免疫吸附试验(图来衡量的。S4)。结果表明,肿瘤坏死因子-α在细胞上清液低于阈值(5.6 pg / ml),这是与蜀和同事们的一致发现基底TNF的表达α在牙周韧带细胞大约是10 pg / 10⁶细胞。相反,肿瘤坏死因子-的浓度α的细胞溶解产物G30 + TNF -α组是30%高于G5.6 + TNF -α组。这些结果表明,高葡萄糖促进外源性肿瘤坏死因子-之间的绑定α和肿瘤坏死因子受体内生TNF的表达,而不是增加α。

此外,两种肿瘤坏死因子受体的表达被免疫印迹检测。蛋白质的表达TNFR1增加了高葡萄糖,而表达TNFR2 high-glucose条件下持平。TNFR1表达的可以调节由几个转录因子,包括CCAAT /增强子结合蛋白(C / EBP), NF -κB,激活蛋白1 (AP-1) [31日]。C / EBP, NF -κB, AP-1发现高血糖条件下被激活,参与糖尿病并发症的发展32,33]。这些转录因子激活TNF -α,表明积极的反馈调节。然而,进一步的研究需要阐明的upregulation是否TNFR1 high-glucose条件是由C / EBP, NF -κB或者AP-1。TNFR1的功能和TNFR2在high-glucose条件下也评估使用特定抗体。TNFR1, TNFR2,而是被发现负责增殖抑制和细胞凋亡。我们的结果是按照其他研究人员的发现,肝细胞凋亡34和视网膜神经细胞凋亡35)引起的糖尿病高血糖是由TNFR1的激活。在目前的研究中,堵塞TNFR2部分恢复细胞的生存能力(尽管差别没有统计学意义),这可能是由于肿瘤坏死因子-之间的亲和力α和TNFR2 TNF -远低于α和TNFR1。因此,TNFR2充当ligand-passing机器,促进TNFR1(的功能36]。

临床研究和动物实验表明,总抗氧化能力GCF是牙周炎症的程度成反比。Pavlica和他的同事们(37)使用犬模型发现,总抗氧化能力GCF轻度牙周炎组明显高于严重牙周炎组。此外,布鲁克和他的同事们(38]在牙周炎患者,也发现了类似结果表明氧化应激可能参与牙周炎的发展(39]。一方面,生产过剩的活性氧(ROS)的线粒体电子传递链被认为是一个重要的致病机制的过程中,糖尿病并发症。高血糖条件下,过度的单糖进行丙酮酸氧化三羧酸循环,这就增加了通量的NADH和FADH₂电子传递链。重载的电子传递链生成活性氧分子氧(通过电子40]。另一方面,ROS生产也可以由TNF -α。据报道,人类皮肤成纤维细胞以时间和剂量依赖性的方式释放活性氧与TNF -刺激后α(41]。更重要的是,肿瘤坏死因子-α全身的血管平滑肌细胞ROS高程是进一步增强high-glucose条件(42),表明TNF -之间的协同效应α和高葡萄糖。据报道,添加外源活性氧或代理触发增加内源性活性氧生成变得敏感许多类型的细胞(内皮细胞、肝细胞和纤维肉瘤细胞)TNF-induced凋亡可能通过抑制NF -κB基因转录的生存(43]。在目前的研究中,TNF -α全身的ROS表达式也进一步增加高葡萄糖的存在。然而,PDLSC凋亡不是治疗缓解的维生素C,这表明其他机制参与这个过程。相比之下,降低细胞生存能力high-glucose和TNF -所致α治疗由维生素C治疗明显逆转,表明活性氧在细胞周期阻滞中起着至关重要的作用。这是ROS引起DNA损伤能够激活p53,进而p21上调^cip1。p21的upregulation^cip1抑制CDK2的激活,诱导细胞周期阻滞在G1期(44]。同时,p16的表达^INK4aROS升高也是调节,结合CDK4/6和逮捕细胞G1期(44]。在目前的研究中,细胞周期分析(图3 (c))透露,PDLSCs孵化与TNF -αhigh-glucose条件下表现出细胞周期阻滞于G0 / G1期(73.8%)与对照组(52.5%)。阻止活性氧产量到200年μM维生素C明显减少G0 / G1期的比例从75.1%降至64.9%(图7 (c)从17.9%到26.1%)和恢复S期分数的高葡萄糖和TNF -α,这表明一个重要的角色在PDLSCs ROS在细胞周期的调控。还需要进一步的研究来验证是否p21^cip1或p16^INK4a参与这一过程。

维生素C(抗坏血酸)是一种水溶性抗氧化剂,能清除氧自由基的几种类型,包括单线态氧和羟基自由基。GCF中维生素C的浓度是207.3μ米,三倍高于血浆浓度(72μ米)(45]。此外,慢性牙周炎患者的血浆维生素C水平是比牙周健康的人低50%46]。因此,在这项研究中,维生素C,享年200岁μ米作为一种抗氧化剂,对PDLSCs展出优秀的保护作用的细胞增殖。据报道,魏和他的同事们(4720),维生素Cμ克/毫升(113.6μ米)能够增强扩散能力和成骨分化效率PDLSCs通过诱导端粒酶活性。然而,维生素C的管理只是部分逆转肿瘤坏死因子-α——和高glucose-induced PDLSCs细胞周期阻滞,表明还有其他非ROS信号通路参与TNF -α介导的细胞周期阻滞。例如,据报道,激活p53、p21和积累,没有必要为TNF -α全身的G1被捕。相反,Rb磷酸化的抑制TNF -α没有激活p53被认为是一个可能的机制(48]。在目前的研究中,我们还发现ERK1/2的表达,以及到的表达,既减少high-glucose和TNF -α条件(无花果。S5b,S5d,S7)。完善,持续激活ERK1/2是s阶段所必需的条目在细胞增殖(49]。燕和他的同事们(50)报道,维生素C的促进增殖和成骨PDLSCs ERK1/2的激活。因此,还需要进一步的研究来探索有益的维生素C的影响取决于是否激活ERK1/2 high-glucose和TNF -α条件。此外,我们还测试了脂溶的维生素E(200年的影响μ米)细胞增殖(无花果S6)。维生素E还部分恢复细胞生存能力在high-glucose和肿瘤坏死因子- 6天α条件,但效果弱于维生素C ( )。弗雷和他的同事们的研究(51]显示,氧自由基是优先减少维生素C而不是维生素e .发生脂质过氧化反应后血浆维生素C损耗。如果从等离子体中删除维生素C,维生素E可能不能完全阻止脂质过氧化的发生,但只有延迟脂质过氧化反应的速率。这些发现可能解释了为什么维生素C对PDLSCs表现出更好的保护作用与维生素E相比。

本研究有潜在的局限性。首先,PDLSCs治疗一个常数high-glucose条件下(30毫米)相对较短的时间(6天)。事实上,血糖波动加剧主动脉内皮细胞凋亡(52和加速在糖尿病大鼠肾损伤53]。此外,糖尿病并发症的发病率呈正相关,糖尿病的持续时间(54),建议继续,疾病的长期发展。因此,还需要进一步的研究来阐明PDLSCs血糖波动的影响。长期的糖尿病动物模型也是很有必要探讨慢性高葡萄糖的不利影响牙周韧带干细胞。第二,ROS upregulation的具体机制和扩散抑制引起的高葡萄糖还不清楚。还需要进一步的实验来确认是否MAPKs, p21^cip1,或者p16^INK4a参与的过程glucose-induced ROS海拔高、增殖抑制。

5。结论

高葡萄糖(30毫米)不会引起细胞凋亡和细胞生存能力抑制但加剧TNF -α全身扩散通过upregulation和激活TNFR1抑制和细胞凋亡。

高葡萄糖和TNF -α在PDLSCs协同提高细胞内ROS水平。维生素C在200μ米可以部分恢复细胞生存能力通过抑制细胞内ROS表达,增加入口S期和有丝分裂。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持和赞助中国国家自然科学基金会(NNSF) (81170970)。

补充材料

补充图S1:流式细胞术分析MSC在CD146 +液晶表面标记。第二段落CD146 +液晶隔离后immunomagnetic珠发现了MSC标记表达式,包括(a) CD105, (b) CD90、CD73,和(c) CD34, CD11b, CD19, CD45 HLA-DR。补充图S2: cd146牙周韧带细胞表现出间充质干细胞的特征。(一)CD146 +液晶的克隆形成试验。CD146 +液晶被播种在培养皿(每盘150个细胞)和培养14天。甲苯胺蓝染色法进行检测。(左)总值外观;(右)在显微镜下细胞形态(100 x 200比例尺表示μ米)。(b)免疫组织化学染色细胞角蛋白、波形蛋白和Stro-1 CD146 +液晶。(左)负染色的细胞角蛋白(苏木精染色);(中)波形蛋白阳性染色;(右)一些Stro-1细胞阳性,而其他细胞对Stro-1不利。比例尺代表200μm。(c)成骨、脂肪形成的感应CD146-PDLCs和CD146 +液晶。液晶是培养成骨、脂肪形成的条件下21或14天;(左)矿化结节检测成骨的条件下用茜素红染色;(右)脂质集群与油红O染色;200年图片代表规模的酒吧μm。补充图S3:渗透压对细胞的影响的可行性PDLSCs(6天),PDLSCs培养在不同条件下(G5.6 G30,甘露醇、甘露醇+ TNF -α,G5.6 + TNF -αG30 + TNF -α)。甘露醇治疗组,细胞被孵化中含有葡萄糖5.6毫米和24.4毫米甘露醇。细胞生存能力被CCK-8化验6天。数据表示为 。这个试验重复3次使用PDLSCs来自3个不同的个体。 与对照组(G5.6), 与G30 + TNF -α组。补充图S4:检测TNF -α在细胞治疗后上层清液和细胞溶解产物高葡萄糖和TNF -α天2。PDLSCs治疗在不同条件下(G5.6 G30, G5.6 + TNF -αG30 + TNF -α执行)48 h, ELISA检测TNF -的内容α细胞上清液(a)和(b)的细胞溶解产物;G5.6 + TNF -的价值α集团被认为是1.0;UD表示未被发现(低于阈值5.6 pg / ml); 与G5.6 + TNF -α组。补充图S5:蛋白表达p-JNK和p-ERK1/2 PDLSCs high-glucose和TNF -α条件(6天),PDLSCs培养在正常葡萄糖或high-glucose TNF -存在与否的条件α。磷酸化的蛋白表达物和磷酸化ERK1/2被免疫印迹检测。(a, c)蛋白的表达p-JNK被TNF -升高α治疗6天。数据表示为 。化验都是复制三次使用PDLSCs来自3个不同的个体。 与对照组。(b, d)蛋白的表达p-ERK1/2被TNF -抑郁α治疗6天,进一步抑制high-glucose条件下。数据表示为 。化验都是复制三次使用PDLSCs来自3个不同的个体。 与对照组。 与G5.6 + TNF -α组。补充图S6:维生素C和维生素E部分逆转的增殖抑制诱导高葡萄糖和TNF -α。PDLSCs治疗在不同条件下(G5.6 G30, G5.6 + TNF -αG30 + TNF -α)。维生素C (200μ(200米)和维生素Eμ米)被添加到培养基high-glucose和TNF -之前1小时α治疗。细胞增殖检测CCK-8试验每24小时。数据表示为 。化验都是复制三次使用PDLSCs来自3个不同的个体。 与对照组(G5.6), 与G30 + TNF -α组。△代表G30 + TNF -之间的差异α+ C组和G30 + TNF -α+维生素E组是统计学意义( )。补充图S7:蛋白质的表达到在PDLSCs high-glucose和TNF -α条件(6天),PDLSCs培养在正常葡萄糖或high-glucose TNF -存在与否的条件α。蛋白质的表达到β肌动蛋白免疫印迹检测。数据表示为 。试验重复3次使用PDLSCs来自3个不同的个体。 与对照组。 与G5.6 + TNF -α组。(补充材料)

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