肌动蛋白阿尔法2（ACTA2）下调抑制神经通过的Rho GTP酶激活干细胞迁移

抽象

虽然神经干细胞（NSCs）可以向中枢神经系统（CNS）损伤后损伤迁移，迁移能力总是由于CNS损伤后的密合性的配体的扰动组成和密度和细胞外基质（ECM）梯度的限制。迄今为止，各种方法已经被开发，以提高NSC迁移和许多因素，这些都影响NSC迁移能力，也已确定。这里，初级神经干细胞培养和肌动蛋白的α2（ACTA2）在神经干细胞使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫测定的表达。接下来，ACTA2在调节NSC迁移和可能的作用机制中的作用进行了探讨。我们的研究结果证明了神经干细胞表示，ACTA2。同时，使用siRNA下调ACTA2通过经由增加的RhoA表达和降低Rac1的表达肌动蛋白丝的聚合阻碍抑制NSC迁移。本研究可以丰富ACTA2的基本知识NSC迁移并打开了一个渠道提高NSC迁移能力，随后提供介入目标中枢神经系统损伤后的功能恢复。

1.简介

干细胞(SCs)是一种非特化细胞的亚型，具有自我更新和分化为一个或多个发育细胞系的能力，在组织再生方面引起了广泛关注[1]。神经干细胞（NSCs）可以被激活，从头增殖，迁移朝向病变，涉及三个主要中枢神经系统（CNS）的细胞类型：神经元，星形胶质细胞和少突胶质，并集成到受伤区域来调节CNS损伤后组织稳态和修复[1-3]。迁移是神经干细胞的主要特征之一。先前的一项研究表明，NSCs可在心室下区(SVZ)增殖，而SVZ是成年人大脑的一个区域，其神经发生贯穿整个成年人的一生[4，但只有少数增殖的NSCs在缺血性脑卒中后迁移到损伤处[五]，提示限制功能恢复可能是由于在功能性病变的NSCs不足。在这里，探讨影响NSC流动性因素是利用细胞替代疗法CNS神经干细胞损伤后一个显著的问题。

细胞迁移依赖于前沿的肌动蛋白丝聚合。已有研究表明，肌动蛋白相关蛋白shootin1、cortactin、cofilin、Arp2/3、ezrin和slingshot参与肌动蛋白波，促进细胞极性的形成和迁移[6-8]。神经干细胞是最常见的游动细胞亚型之一。我们以前的研究已经表明，α-肌动蛋白4 (ACTN4)促进肌动蛋白丝聚合，从而促进NSC迁移[1]。此外，我们的研究还表明，CDC42活化有助于通过促进肌动蛋白丝聚合NSC运动[3]。因此，影响肌动蛋白NSCs的灯丝聚合分子可能直接NSC蠕动。

肌动蛋白的α2（ACTA2），也被称为α平滑肌肌动蛋白（αα-SMA），编码球状肌动蛋白（G-肌动蛋白），其被组装到丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的同种型，以允许细胞骨架肌动蛋白重塑和驱动细胞迁移[9，10]。先前的研究已经表明，ACTA2下调经由其肌动蛋白结合结构域显着损害人肝星状细胞迁移[11]。此外，研究还表明人肺癌细胞的ACTA2 potentiates转移潜力提高通过肌动蛋白丝组装[12，13]。此外，调查描绘的是ACTA2能提高成纤维细胞的迁移潜力和间充质干细胞[14-16]。在神经干细胞是否ACTA2表达及其在NSC迁移的作用仍然未知。

在本研究中，我们研究了ACTA2的NSC迁移中的作用，并探讨其作用机制。首先，初级神经干细胞进行培养，使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫染色测定ACTA2的神经干细胞中的表达。然后，ACTA2在调节肌动蛋白长丝聚合和潜在机制的作用进行了探讨。这项研究的目的是寻找影响NSC迁移的因素，并阐明可能的机制（S），这可能充实与神经干细胞的基本理论和增强NSC迁移能力，因此促进后各种神经功能恢复提供干预目标疾病和损伤。

2。材料和方法

2.1。动物

胚胎C57BL / 6小鼠从第三军医大学（艾米医科大学）的实验室购买。按照中国的动物福利立法的用于科学目的的动物保护进行所有动物的程序和由第三军医大学的地方当局为实验室使用动物的批准。

2.2。原代NSC和脑微血管内皮细胞(BMEC)培养

被雇用25天胚胎14.5 C57BL / 6小鼠的总数，得到初级神经干细胞如前所述[2，17]。简单地说，大脑皮层用杜尔贝科改良的Eagle 's培养基洗了两次(DMEM, Hyclone, Logan, Utah)。然后用10%胎牛血清(FBS, vol/vol, Hyclone, Logan, Utah)洗涤两次，在0.25%胰酶- edta (Hyclone, Logan, Utah) 37℃孵育30分钟后，抑制胰酶活性。然后，用火焰抛光的巴斯德移液管对组织进行三度稀释，并通过70度的试管μm尼龙细胞过滤器(BD Falcon，圣何塞，CA)后，他们洗两次DMEM。细胞悬液在含2% B27 (Gibco, Grand Island, NY)、20 ng/ml重组小鼠表皮生长因子(EGF, PeproTech, Rocky Hill, NJ)和20 ng/ml重组小鼠成纤维细胞生长因子-碱性(FGF, PeproTech, Rocky Hill, NJ)的富集培养基中培养，温度为37℃，CO为5%₂加湿后的状态。For NSC passage, neurospheres were collected by centrifugation at the speed of 300 rpm, dissociated in StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (Gibco, Grand Island, NY), and grown in enrichment medium as described above. Y27632 was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), and the working concentration was 30 μ中号如先前报道[18]。

为了分化，先将NSCs接种在10号上μ克/ ml的聚-L- ornithine-（PO-）预涂盖玻片，然后在补充有B27（GIBCO，Grand Island的，NY）和1个％glutamax的（GIBCO，Grand Island的，NY）分化培养基的DMEM / F12培养基中培养10天为先前报道[19]。在本研究中用于所有实验NSCs的通道是从通道3至5。

BMECs购自奥比奥科技有限公司(中国上海)，在供应商推荐的培养基中培养。

2.3。免疫荧光

Neurospheres or cells adhered to PO-precoated coverslips were incubated in 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature and then washed with phosphate buffer saline (PBS, pH ~7.4) for three times. The samples were permeated with 0.5% Triton X-100 PBS for 30 min and blocked by 5% bovine serum albumin (BSA) for 2 h after washing three times. Thereafter, the samples were incubated in primary antibodies, goat anti-Nestin (1 : 100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), rabbit anti-MAP-2 (1 : 100, Proteintech Group, Inc., Beijing, China), rabbit anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1 : 100, Abcam, Cambridge, UK), mouse anti-Olig2 (1 : 100, Milipore Corp., Billerica, MA, USA), rabbit anti-α-Smooth Muscle Actin (ACTA2) (1 : 100, Beyotime, Beijing, China), and mouse anti-Tubulin (1 : 100, Beyotime, Beijing, China) for 10–14 h at 4°C. After washing, relative fluorescence secondary antibodies were incubated at room temperature for 2 hours. Cell nuclei were counterstained with 4 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for 10 min at room temperature. Then, coverslips were mounted onto glass slides and the images were captured by a confocal microscope (Carl Zeiss, LSM780, Weimar, Germany) and examined using Zen 2011 software (Carl Zeiss, Weimar, Germany).

2.4。肌动蛋白丝聚合检测

肌动蛋白如先前所描述，检测灯丝聚合[2，3]。Briefly, neurospheres were incubated in 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature and then washed with PBS three times. Thereafter, the samples were incubated in Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin reagents (Life Technologies, Waltham, MA, USA) at room temperature for 30 minutes. After mounting onto glass slides, images were visualized with a confocal microscope (Carl Zeiss, LSM780, Weimar, Germany) and measured using Zen 2011 software (Carl Zeiss, Weimar, Germany).

2.5。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

使用RIzol试剂(Ambion by Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)按照说明书从NSCs和脑微血管内皮细胞(BMECs)中提取总RNA，使用不含rnase的DNase (Qiagen, Valencia, CA)消除污染的DNA。对于逆转录，2μ每个样本使用预混Taq (Takara Taq Version 2.0 plus dye, Takara Bio Inc.， Tokyo, Japan)逆转录l RNA，共20个μ根据制造商的说明湖所用的引物如下：ACTA2：5 -GGACGTACAACTGGTATTGTGC-3（正向）和5 -TCGGCAGTAGTCACGAAGGA-3（反向）和GAPDH：5 -GGC CCC TCT GGA AAG CTG TG-3（正向）和5 -CCA GGC GGC ATG GCA GAT C-3（逆转）。退火温度的PCR为60℃，并进行了28个循环。PCR产物用电泳2％琼脂糖凝胶电泳和可视化通过染色（Solarbio，Solarbio科技有限公司，中国北京）黄金观点。使用ChemiDoc XRS +系统（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州）乐队进行了分析。

2.6。ACTA2 siRNA转染

acta2特异性siRNA (sc-43591)购自Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)。使用Lipofectamine™3000转染试剂(Invitrogen，威豪，MA, MA, USA)按照说明书将acta2特异性siRNA转染到NSCs中。阴性对照为相同量的转染siRNA和Lipofectamine™3000试剂。RT-PCR和western blot检测转染效率。

2.7。NSC迁移分析

神经干细胞进行传代和消化成单个细胞，然后，它们在不同的组中培养。培养3天之后，神经球接种在用于NSC迁移的传播出神经球PO-预涂的24孔板。Images were captured after 12 h by a phase-contrast microscopy. The migration distance of NSCs from the edge of the neurospheres was measured by Image-Pro Plus 6.0 software.

2.8。Western印迹

在不同的组样品用RIPA（碧云天，北京，中国），辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂（罗氏，印第安纳波利斯，IN，USA）进行均质化。一个fter centrifugation at 14000g for 30 min at 4°C, the supernatant was collected and concentration was determined using the enhanced BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Beijing, China). Equal quality of protein was separated by 10% SDS-PAGE under reducing conditions and electroblotted to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Roche, Indianapolia, IN, USA). Then, the membranes were blocked in TBST (0.5% Tween-20 in Tris-buffered saline) containing 5% ( ）脱脂奶粉（博士德生物科技，武汉，中国）在室温下2小时。然后，将膜在第一抗体，兔孵育抗α-Smooth Muscle Actin (ACTA2, 1 : 1000, Beyotime, Beijing, China), rabbit anti-RhoA (1 : 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), rabbit anti-Rac1 (1 : 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), mouse anti-GADPH (1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), and mouse anti-active RhoA (Neweast, Bath, UK) overnight at 4°C. After washing, the membranes were in the relative horseradish peroxidase- (HRP-) conjugated secondary antibody (Boster Biological Technology, Wuhan, China) at room temperature for 2 hours. Then, bands were visualized by ChemiDoc™ XRS⁺成像系统（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州）的WesternBright ECL套件（Advansta，门洛帕克，CA，USA）。使用Image实验室™软件（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州）测定各膜的光密度测量。GAPDH端上来作为内部控制。

2.9。统计分析

所有数据均表示为 并使用SPSS 19.0软件（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）进行统计分析。多重比较用（ANOVA）单因子变异数分析进行，其次是土耳其的事后检验。一个 被认为是统计上显著。

3.结果

3.1。主NSC隔离及特点

对于主培养NSC，新皮质的组织解剖，并从E14.5 C57BL / 6小鼠收获。神经球后的富集培养物培养基中培养3天明显观察到（图图1（a）)。同时，大多数细胞的巢蛋白表达，神经干细胞的标记物，使用免疫染色（图图1（b）)。为了确定培养的细胞的分化潜能，细胞在分化培养基中温育7-10天。结果表明，细胞分化举行的容量为神经元（MAP2⁺）（图图1（c）),星形胶质细胞(GFAP)⁺）（图1（d）和少突胶质细胞(Olig2)⁺）（图1（e）中)。这些结果表明，培养的细胞为神经干细胞和具有增殖和分化的能力到两个神经元和神经胶质（星形胶质细胞和少突胶质细胞）谱系。

3.2。ACTA2在主要神经干细胞表达，而在NSC迁移发挥了重要作用

为了验证ACTA2是否在NSCs中表达，我们首先通过RT-PCR检测ACTA2 mRNA的表达。结果显示，以BMECs为阳性对照的NSCs中ACTA2 mRNA表达(图)图2（a）)。然后，进行ACTA2和巢蛋白的coimmunostaining以评价神经干细胞ACTA2蛋白表达，结果划定的NSCs表示ACTA2。

接下来，探索NSC迁移ACTA2的作用，ACTA2的siRNA用于下调ACTA2表达。结果表明，ACTA2 mRNA表达显著由ACTA2的siRNA，与对照相比，加扰，和媒介物组（图降低图3（a）和3 (b))。随后，再次确认由RT-PCR测定法（图中得到的免疫印迹的结果3 (c)和3 (d))。此外，细胞数和生长距离从神经球的移民ACTA2 siRNA组中均显着降低，与对照，扰频，和车辆下相差显微镜组（图的比较3 (e)-3 (g))。总之，这些结果表明，ACTA2下调抑制NSC迁移。

3.3。肌动蛋白丝聚合从事ACTA2操纵NSC迁移

为了揭示可能的内在机制NSC迁移，我们推测肌动蛋白丝聚合可能参与这一进程，由于肌动蛋白丝聚合在细胞迁移中的关键作用。F-肌动蛋白的组装用鬼笔环肽进行评估和微管蛋白，笼状结构的微管的符号[免疫染色的1]，以可视化NSCs的形态结构变化。结果显示，ACTA2下调后，与对照组、置乱组和对照剂组相比，足丝状伪足形成百分比显著降低(图)4(一)和4 (b))。与此同时，ACTA2 siRNA组的主导过程和次级分支的平均数量也明显低于对照组、置乱组和载体组(图)4(一)，4 (c),4 (d))。这些结果表明，肌动蛋白丝聚合参与了ACTA2对NSC迁移的调控。

3.4。小GTP酶的Rho家族曾是中保调节肌动蛋白丝聚合

Rho家族小GTP酶，包括的Rho，Rac的，和CDC42的，是在多种细胞类型肌动蛋白丝的聚合[必不可少20]。为了进一步确认Rho家族小GTP酶是否参与ACTA2调节肌动蛋白丝聚合以促进NSC迁移，我们评估的RhoA，Rac1的，和CDC42的表达。结果概括在ACTA2 siRNA组在活性RhoA的表达比在控制中，加扰明显上调，和媒介物组（图图5（a）和图5（b）)。与对照组、置乱组和载体组相比，ACTA2 siRNA组中Rac1显著下调(图)图5（a）和图5（c）)。同时，CDC42表达了那些组间无差异显著（图图5（a）和图5（d）)。

接下来，为了探究Rho GTPase RhoA在ACTA2介导NSC迁移中的作用，我们用RhoA抑制剂之一Y27632处理NSC。western blot结果显示Y27632可以部分下调活性RhoA的表达(图)图6（a）和图6（b）)。同时，条带所示，当ACTA2沉默神经干细胞与Y27632（图处理，这些活性RhoA的表达明显增加图6（a）和图6（b）)。

随后，我们观察到Y27632对神经球迁移和效果的结果表明，迁移距离被显著该组中与Y27632治疗比ACTA2 siRNA组（图增加图7（a）和图7（b）)。当Y27632处理acta2沉默的NSCs时，这种增强作用部分消失(图)图7（a）和图7（b）)。

此外，为了确定在ACTA2介导NSC迁移Y27632发挥的作用，免疫荧光结果表明的丝状伪足形成的百分比部分地与Y27632除了在ACTA2下调增加，相比于ACTA2 siRNA组（图图8（a）和图8（b）)。同时，补充Y27632的ACTA2 siRNA组比补充Y27632的ACTA2 siRNA组的平均前导过程和次级分支数部分减少(图)图8（a），图8（c）,图8（d）)。总之，这些结果划定RhoA蛋白是肌动蛋白操纵从NSC迁移ACTA2所得长丝聚合的介质。

4.讨论

在本研究中，原代神经干细胞进行培养，我们的结果表明在神经干细胞表示，ACTA2。同时，使用siRNA下调ACTA2通过经由增加的RhoA表达和降低Rac1的表达肌动蛋白丝的聚合阻碍抑制NSC迁移。

Rho家族小GTP酶，典型地包括的RhoA，Rac1的，和CDC42，是一个家族显著调节散装细胞类型的[迁移6，21]。这里，我们的结果表明，升高的RhoA从由ACTA2的siRNA下调ACTA2所得受损NSC迁移，这是与以前的研究[线20-23]。此外，我们的结果还表明，在使用ACTA2 siRNA下调ACTA2后，Rho GTPases的Rho家族的另一成员Rac1也出现了降低。Rac1下调是阻碍细胞迁移的另一个因素[24，25]。因此，ACTA2下调阻碍通过RhoA的上调和下调Rac1的，以双重地抑制肌动蛋白丝聚合NSC迁移。我们集中注意力于RhoA的信号通路为RhoA的增加的水平高于Rac1蛋白水平下降。此外，以往的研究已经证明，RhoA的调解调节间充质干细胞的增殖和分化[26-29，脂肪来源干细胞(ADSCs) [三十、肌肉干细胞[31]，和体癌细胞[18，32，33]。

从RhoA活化所得的骨架重排保持影响NSC特性的能力。先前的报告表明，细胞骨架重排的调整对象的间充质干细胞（MSC）分化成神经源性亚型34]。此外，由于细胞的细胞外基质(ECM)网络微环境的重组，细胞骨架重排影响脂肪形成[35]，提示细胞骨架重排也可能影响细胞增殖。在这里，我们的研究结果表明，ACTA2介导的肌动蛋白丝聚合调节NSC迁移和骨架重排。在这里，这是值得探索引起RhoA的活性在NSC增殖和分化在今后的研究中增殖和分化的神经干细胞的其他两个主要特点ACTA2下调的作用。

ACTA2是平滑肌细胞在纤维化的枢转标记和从事血管收缩力和血压稳态[36]。先前的研究已经表明，ACTA2表达的增加促进了在位内膜基质细胞（euESC）侵袭和迁移[36]。同时，研究还描绘ACTA2导致降低的细胞运动性和成肌纤维细胞的收缩的体内伤口愈合过程中的抑制，超越它的结构重要性的细胞[37]。此外，有研究证实ACTA2高表达的肺癌细胞转移明显增强，而ACTA2下调则明显削弱转移[12]。据我们有限的知识，它是找出ACTA2在神经细胞中的表达及其在NSC迁移功能的第一份报告。

该组合物和在本地环境粘附配体的密度已被证明是在控制细胞迁移的重要变量[38]，和细胞外基质（ECM）梯度能指导NSC迁移[20]。该组合物和粘附配体的密度和细胞外基质（ECM）的梯度必须压倒性CNS损伤后的干扰，此后影响朝病变促进局部神经血管修复NSC迁移。神经干细胞向病灶迁移的数量不足是影响中枢神经系统损伤后的功能恢复显著因素。各种方法已被开发，以提高NSC迁移和许多因素，这些都影响了NSC迁移能力，也已确定。我们目前的研究可以充实NSC迁移ACTA2的基本知识，并提供了使用神经干细胞与ACTA2表达促进体内神经干细胞的线索。同时，密度和梯度仍然难以捉摸。在这里，我们下一步的工作是评估ACTA2的表达水平在中枢神经系统损伤后的局部环境，并确定本地ACTA2梯度浓度下抑制NSC迁移的变化是否，终于寻找可行的方法，有利于NSC迁移。

5。结论

总之，本研究表明，ACTA2在初级神经干细胞中表达，并且下调ACTA2阻碍NSC迁移通过增加的RhoA表达和降低Rac1的表达抑制肌动蛋白丝的聚合，这可能会丰富ACTA2的基本知识在NSC迁移和打开的途径用于增强NSC迁移势，随后提供干预目标CNS损伤后的功能恢复。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据可直接从合理要求通讯作者。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项工作是由从基础研究和重庆的前沿探索项目（cstc2018jcyjAX0186）和中国（81601071）国家自然科学基金鸿飞戈和中国国家自然科学基金（81760233）和贵州省科技计划项目（资金支持[2017] 5733-020和[2019] 5661），以安永华于。

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